紫玉蘭‘紅元寶’花芽分化階段基因定量分析的內(nèi)參基因篩選

章穎佳 程少禹 王卓為 戴夢(mèng)怡 董彬 張超 張壽洲 王亞玲 申亞梅

摘 要：? 為篩選紫玉蘭‘紅元寶’（Magnolia liliflora ‘Hongyuanbao’）二次花芽分化階段穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，該研究以‘紅元寶’不同花芽分化時(shí)期的花芽和葉為材料，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出8個(gè)候選內(nèi)參基因，即泛素酶基因（UBC）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、微管蛋白β鏈（β-TUB）、微管蛋白β-5鏈（β-TUB5）、微管蛋白α-3鏈（α-TUB3）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、酰基載體蛋白2（ACP2）、?；d體蛋白3（ACP3）。運(yùn)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，簡(jiǎn)單克隆和熔解曲線驗(yàn)證引物特異性;利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)各個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況，結(jié)合GeNorm、NormFinder、BestKeeper軟件和RefFinder在線工具綜合評(píng)估其表達(dá)穩(wěn)定性，并通過(guò)目的基因TFL1的表達(dá)分析驗(yàn)證其可靠性。結(jié)果表明：（1）8個(gè)候選內(nèi)參基因條帶位置正確，熔解曲線呈單一峰，說(shuō)明引物特異性良好。（2）β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘紅元寶’不同花芽分化時(shí)期較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而UBC和ACT為穩(wěn)定性最低的內(nèi)參基因。（3）β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其組合的相對(duì)表達(dá)量趨于一致，而ACT和UBC并未對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)化。因此，β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作為‘紅元寶’二次花芽分化研究中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。該研究結(jié)果將為木蘭屬植物二次成花分子調(diào)控機(jī)制研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 紫玉蘭， 內(nèi)參基因， 兩次成花， qRT-PCR， 微管蛋白基因

中圖分類(lèi)號(hào)：? Q943;S685.15

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2022）01-0113-09

收稿日期：? 2021-05-29

基金項(xiàng)目：? 浙江省“十四五”育種專(zhuān)項(xiàng)花卉協(xié)作組項(xiàng)目（2021C02071-3） [Supported by the Key Scientific and Technological Grant of Zhejiang for Breeding New Agricultural Varieties （2021C02071-3）]。

第一作者： 章穎佳（1996-），碩士研究生，研究方向?yàn)橛裉m品種資源及種質(zhì)創(chuàng)新，（E-mail）909621959@qq.com。

*通信作者：? 申亞梅，博士，教授，研究方向?yàn)橛裉m品種資源及種質(zhì)創(chuàng)新，（E-mail）yameishen@zafu.edu.cn。

Selection of reference genes in Magnolia liliflora

‘Hongyuanbao’ during flower bud differentiation

ZHANG Yingjia1，2， CHENG Shaoyu1，2， WANG Zhuowei1，2， DAI Mengyi1，2， DONG Bin1，2，

ZHANG Chao1，2， ZHANG Shouzhou3， WANG Yaling4， SHEN Yamei1，2*

（ 1. College of Landscape Architecture， Zhejiang A & F University， Hangzhou 311300， China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of

Germplasm Innovation and Utilization for Garden Plants， Zhejiang A & F University， Hangzhou 311300， China; 3. Fairy Lake Botanical

Garden， Shenzhen 518004， Guangdong， China; 4. Xi’an Botanical Garden， Xi’an 710061， China ）

Abstract：? A number of Magnolia （Magnoliaceae） species bloom twice each year， instead of once in most other species in this family， which is a desirable ornamental trait. To investigate the molecular mechanism of the flower bud differentiation during the second bloom each year in these Magnolia species， quantitative real-time PCR （qRT-PCR） is frequently used as a sensitive gene expression technique that relies on the stability of reference genes for data normalization. In order to screen the identification of reference gene（s） suitable for molecular characterization of flower bud differentiation stages during second bloom of M. liliflora ‘Hongyuanbao’ ， in this study ， leaf and flower bud tissues of M. liliflora ‘Hongyuanbao’ at different flower bud differentiation stages were used as materials. Based on transcriptomic sequencing data， eight constitutively expressed genes， including UBC （ubiquitin-conjugating enzyme）， ACT （actin）， β-TUB （tubulin beta）， β-TUB5 （tubulin beta）， α-TUB3 （tubulin alpha）， PEPC （phosphoenolpyruvate carboxylase）， ACP2 （acyl carrier protein 2）， ACP3 （acyl carrier protein 3）， were selected as candidate reference genes for qRT-PCR. Primer Premier 5 was used to design the primers. PCR products of all the eight candidate reference genes were analyzed by gel electrophoresis which showed sharp bands with the expected size. Comprehensively analysis was conducted using four softwares including geNorm， NormFinder， BestKeeper and RefFinder to evaluate its expression stability， and its reliability was verified by expression analysis of the target gene TFL1. The results were as follows： （1） Each melting curve was a single peak， which indicated the high specificity of PCR primers. （2） β-TUB， β-TUB5 and α-TUB3 were the most stable reference genes， whereas UBC and ACT were the lest stable. （3） The relative expressions of β-TUB5， α-TUB3， β-TUB and their combinations showed highly consistent results， while ACT and UBC did not effectively standardize the expression level of TFL1.Therefore， β-TUB5， α-TUB3 and β-TUB can be identified as the most suitable reference genes for qRT-PCR analysis of gene expression in flower bud differentiation during the second bloom of M. liliflora ‘Hongyuanbao’. This study provides useful references for investigating the regulatory mechanisms in Magnolia species flowering.

Key words： Magnolia liliflora， reference gene， re-flowering， qRT-PCR， TUB

木蘭屬（Magnolia Linn.）植物在我國(guó)已有兩千多年的栽培歷史，花色艷麗、樹(shù)形優(yōu)美，是重要的春季開(kāi)花綠化植物（張翼等，2009）。在自然條件下，木蘭屬植物中少數(shù)種質(zhì)能在夏季二次開(kāi)花，甚至可持續(xù)開(kāi)放到秋季（Xia et al.， 2008）。然而，對(duì)木蘭屬植物二次開(kāi)花或多次開(kāi)花機(jī)理研究仍處于初級(jí)階段，目前僅有紫玉蘭‘紅元寶’（M. liliflora ‘Hongyuanbao’）（程少禹等，2020）和‘常春’二喬玉蘭（Magnolia×soulangeana ‘Changchun’）（Sun et al.， 2021）兩個(gè)品種不同花期的轉(zhuǎn)錄組分析研究，而從基因調(diào)控層面揭示該屬植物二次開(kāi)花機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)具有高精度、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因表達(dá)分析的研究中（Huggett et al.， 2005）。但qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性容易受到樣本差異性、組織特異性、提取RNA質(zhì)量等因素的影響（Suzuki et al.， 2000），需要引入一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)參基因校正目的基因的表達(dá)（Quackenbush， 2002; Xu et al.， 2017）。實(shí)際研究中所選取的內(nèi)參基因通常只能在一定范圍內(nèi)表達(dá)恒定，不能確保在所有實(shí)驗(yàn)條件中均能穩(wěn)定表達(dá)（Thellin et al.， 1999）。若不經(jīng)篩選而盲目使用他人實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參基因，容易得到不準(zhǔn)確甚至錯(cuò)誤的結(jié)果（Mukesh et al.， 2006）。因此，在不同樣本或不同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行qRT-PCR分析的前提是篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。目前，已有研究篩選得到木蘭屬植物不同花色（王寧杭等，2019）、熱脅迫處理（王倩穎等，2019）和鹽脅迫處理（常鵬杰等，2018）適用的內(nèi)參基因，卻未對(duì)二次開(kāi)花的木蘭屬植物進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選。

紫玉蘭‘紅元寶’（M. liliflora ‘Hongyuanbao’）（簡(jiǎn)稱(chēng)‘紅元寶’）是紫玉蘭（M. liliflora）的一個(gè)品種，具有一年二次開(kāi)花的特性（程少禹等，2020）。為篩選適合木蘭屬植物二次花芽分化研究的內(nèi)參基因，本研究以‘紅元寶’不同花芽分化時(shí)期的花芽和葉為材料，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)選取8個(gè)常用內(nèi)參基因（UBC、ACT、β-TUB、β-TUB5、α-TUB3、PEPC、ACP2、ACP3），并利用GeNorm、NormFinder和Bestkeeper等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件綜合評(píng)估候選內(nèi)參基因在不同花芽分化時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性，以期為木蘭屬植物二次或多次花開(kāi)放的分子機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選取

‘紅元寶’（樹(shù)齡10年）種植于浙江農(nóng)林大學(xué)平山基地。選取三棵長(zhǎng)勢(shì)一致，狀況良好無(wú)病蟲(chóng)害的‘紅元寶’為實(shí)驗(yàn)材料，定期采集樹(shù)冠中上部分的花芽及其周?chē)哪廴~。由于每棵樹(shù)上花芽分化的進(jìn)程并不同步，因此不同分化時(shí)期的花芽按照對(duì)應(yīng)的尺寸規(guī)格進(jìn)行取樣。2019年4月12日進(jìn)行第一次采樣，每隔15天采樣一次，采集三次作為第一次花芽分化前中后三個(gè)時(shí)期的樣品;2019年6月25日開(kāi)始采集第二次花芽分化樣品，每隔15天采集一次，采集三次作為第二次花芽分化前中后三個(gè)時(shí)期的樣品。每個(gè)時(shí)期的樣品均采集3個(gè)重復(fù)，共36個(gè)樣品。每個(gè)樣品均置于5 mL的凍存管中，采集后迅速放入液氮中超低溫保存，最終轉(zhuǎn)到-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)‘紅元寶’轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果，從中選取泛素酶基因（UBC）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、β微管蛋白（β-TUB）等8個(gè)常見(jiàn)的內(nèi)參基因。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)的要求，運(yùn)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。引物交于浙江有康生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列信息詳見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit（天津，Novogene）試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各樣品的總RNA。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其完整性、濃度和純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Mix（TaKaRa）進(jìn)行cDNA合成，進(jìn)行10 μL體系反轉(zhuǎn)錄，取2 μL 5×PrimeScript 緩沖液，500 ng總RNA，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃保存。用LightCycler 480Ⅱ（Roche）熒光定量?jī)x進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，其中BCG qPCR Master Mix（2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，25 ng cDNA模板，并用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，然后運(yùn)行95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究基于‘紅元寶’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取了8個(gè)常見(jiàn)的候選內(nèi)參基因：泛素酶基因（UBC）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、微管蛋白β鏈（β-TUB）、微管蛋白β-5鏈（β-TUB5）、微管蛋白α-3鏈（α-TUB3）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、酰基載體蛋白2（ACP2）、?；d體蛋白3（ACP3）。通過(guò)SymbolDA@Ct、GeNorm、NormFinder、Bestkeeper、RefFinder分別計(jì)算qRT-PCR中所得到的數(shù)據(jù)，對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行分析，最終確定最佳單個(gè)內(nèi)參基因或內(nèi)參基因組合。候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平通常是由qRT-PCR的閾值周期Ct值決定，Ct值與基因表達(dá)水平成反比，即Ct值越大，基因表達(dá)水平越低，反之亦然。利用GeNorm根據(jù)基因表達(dá)穩(wěn)定值（M值）的大小判斷候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性（MSymbol|@@1.5），M值越小則基因表達(dá)越穩(wěn)定。為確定能在一定范圍內(nèi)恒定表達(dá)的最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)量，利用GeNorm配對(duì)差異值（Vn/n+1）判斷最佳內(nèi)參數(shù)量從而進(jìn)行歸一化（Vandesompele et al.， 2002）。若基因間成對(duì)差異值大于或等于0.15，則應(yīng)多增一個(gè)基因?qū)ζ溥M(jìn)行可靠的歸一化;若成對(duì)差異值小于0.15，則不需要增加基因進(jìn)行正?；↙iang et al.， 2020）。利用NormFinder將原始Ct值進(jìn)行了對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行方差分析，計(jì)算得出一個(gè)基因的穩(wěn)定表達(dá)值，穩(wěn)定值最小的候選內(nèi)參基因則為最穩(wěn)定基因（Lindbjerg et al.， 2004）。BestKeeper通過(guò)計(jì)算Ct值的變異率比較不同候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平差異，相關(guān)系數(shù)r2越大，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD和變異系數(shù)CV越小則越穩(wěn)定（Pfaffl et al.， 2004）。采用在線網(wǎng)站RefFinder評(píng)估和篩選參考基因，按照GeNorm、NormFinder和BestKeeper的計(jì)算程序，對(duì)候選內(nèi)參基因的排名，為每個(gè)基因分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，并計(jì)算出它們的權(quán)重幾何平均值，從而獲得最終的總體排名（Xie et al.， 2012;黃真池等，2013）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得條帶清晰，并且28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA的2倍，無(wú)嚴(yán)重的RNA降解和DNA污染情況（圖1）。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有RNA樣品中OD 260/OD 280值均在1.8～2.0之間，說(shuō)明RNA純度較高，可用于進(jìn)一步研究。

2.2 候選內(nèi)參基因引物評(píng)價(jià)

將‘紅元寶’不同花芽分化時(shí)期樣品的cDNA等量混合作為模板，8個(gè)候選內(nèi)參基因通過(guò)簡(jiǎn)單克隆擴(kuò)增后，各候選內(nèi)參基因結(jié)果均與預(yù)期一致，條帶均顯示在80～150 bp之間且單一清晰（圖2）。將cDNA稀釋成6個(gè)濃度梯度（50、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5），以不同濃度的cDNA作為qRT-PCR擴(kuò)增的模板。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以不同濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)即可獲得斜率（k）和相關(guān)系數(shù)（r2）。運(yùn)用擴(kuò)增效率公式：E=（10-1/k-1）×100%，可知E值均在90.0%～110.0%之間，相關(guān)系數(shù)r2≥0.98（表1）。各候選內(nèi)參基因的單一熔解峰也表明引物特異性良好（圖3），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 內(nèi)參表達(dá)穩(wěn)定性分析

通過(guò)比較8個(gè)候選內(nèi)參基因Ct值來(lái)評(píng)估其在‘紅元寶’不同花芽分化階段的表達(dá)豐度，根據(jù)Ct值的分布（圖4），8個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值均集中在17～30之間，表達(dá)豐度適中。

利用GeNorm對(duì)各個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性排序，由圖5可知，8個(gè)M值均小于1.5，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)棣?TUB和β-TUB5，表達(dá)穩(wěn)定值最?。∕=0.598）。UBC（M=1.137）和ACT（M=1.021）在該軟件的分析中排序靠后，是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。配對(duì)差異值的分析顯示，Vn/n+1的值均大于0.15，其原因可能是‘紅元寶’二次成花時(shí)間跨度大，不同組織中基因變異大（圖6）。在geNorm手冊(cè)中也提及Vn/n+1取0.15只是一個(gè)默認(rèn)值，并非總是必要，可根據(jù)研究目的或Vn/n+1變化趨勢(shì)選擇2～3個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參基因（任銳等，2016）。NormFinder軟件分析基因穩(wěn)定性同樣與數(shù)值大小呈負(fù)相關(guān)，α-TUB3的M值最?。∕=0.214），因此穩(wěn)定性最高，穩(wěn)定性次之的是β-TUB5（M=0.308），穩(wěn)定性最低的是UBC（M=0.910）和ACT（M=0.847），這一結(jié)果與GeNorm大致相同。BestKeeper分析結(jié)果顯示ACT的SD值最大（SD=2.15），是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因;ACP2的SD值最?。⊿D=1.04）、UBC次之（SD=1.08），表明ACP2和UBC的穩(wěn)定性較高，這與GeNorm、NormFinder的分析結(jié)果部分不一致。RefFinder集合了上述三種軟件的算法和程序，對(duì)每個(gè)備選基因計(jì)算穩(wěn)定值權(quán)重的幾何平均值進(jìn)行綜合排名，數(shù)

值越小，表明基因的穩(wěn)定性越高（陳瑩等，2019）。通過(guò)分析結(jié)果得出（表2），α-TUB3穩(wěn)定性最高，β-TUB5 和β-TUB穩(wěn)定性次之。

基于上述3個(gè)軟件（GeNorm，NormFinder，Bestkeeper）的分析結(jié)果，通過(guò)RefFinder綜合確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名。由表2可知，在‘紅元寶’不同花芽分化階段，α-TUB3、β-TUB5、β-TUB的表達(dá)穩(wěn)定性最高，而UBC和ACT表達(dá)穩(wěn)定性最低。

2.4 TFL1基因驗(yàn)證最佳內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

TERMINAL FLOWER 1（TFL1）是重要的成花抑制基因，因此，選用TFL1基因?qū)蜻x內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證。由圖7可知，TFL1在葉中幾乎沒(méi)有表達(dá)，而在花芽中，第一次花芽分化的表達(dá)量明顯低于第二次花芽分化，推測(cè)低水平表達(dá)的TFL1可能促進(jìn)了‘紅元寶’二次開(kāi)花。而以穩(wěn)定性較差的內(nèi)參基因分析TFL1的相對(duì)表達(dá)量時(shí)，TFL1基因表達(dá)模式發(fā)生了變化。以單個(gè)基因（β-TUB、β-TUB5、α-TUB3）及其組合為內(nèi)參基因校準(zhǔn)TFL1基因的表達(dá)水平時(shí)，均顯示出了一致趨勢(shì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了4個(gè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因篩選結(jié)果的可靠性。

3 討論與結(jié)論

理想的內(nèi)參基因在任何實(shí)驗(yàn)條件下都能穩(wěn)定表達(dá)，但大量研究表明，在不同物種或不同條件中穩(wěn)定表達(dá)的基因會(huì)發(fā)生變化（Artico et al.， 2010;Mafra et al.， 2012）。因此，在特定條件下篩選合適的內(nèi)參基因?qū)τ诤罄m(xù)基因表達(dá)模式分析具有重要意義。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出‘紅元寶’花芽分化進(jìn)程8個(gè)候選內(nèi)參基因，基于GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder軟件綜合分析結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘紅元寶’花芽分化進(jìn)程最佳內(nèi)參基因。

在‘紅元寶’不同花芽分化階段，GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評(píng)估的8個(gè)內(nèi)參基因排序存在差異。有研究顯示，利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析茉莉花（Jasminum sambac）（齊香玉等，2020）和老鴉瓣（Amana edulis）（徐碧霞等，2021）不同組織的內(nèi)參基因表達(dá)量時(shí)，3個(gè)軟件得到的穩(wěn)定性排名也不同。由此，GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析結(jié)果的差異在物種中普遍存在（付建新等，2016）。在本研究中，GeNorm和NormFinder分析結(jié)果表明α-TUB3、β-TUB5和β-TUB穩(wěn)定性較高，UBC和ACT穩(wěn)定性較低;而B(niǎo)estKeeper與前二者結(jié)果不一致，認(rèn)為ACP2和UBC穩(wěn)定性最高，ACT穩(wěn)定性最低。造成分析結(jié)果有差異的原因是3個(gè)軟件采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同，使同一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生了不同的排名（Spiegelaere et al.， 2017）。

為減少軟件算法差異造成的偏差，通常結(jié)合幾何平均值法整合不同軟件的結(jié)果得出綜合排名（任銳等，2016）。本研究利用RefFinder綜合評(píng)估上述3個(gè)軟件的排序結(jié)果，分配權(quán)重進(jìn)行幾何平均值的計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有樣品中穩(wěn)定性最高的是β-TUB、β-TUB5和α-TUB3，穩(wěn)定性最低的是UBC和ACT。為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選結(jié)果的可信度，本研究使用所有單個(gè)內(nèi)參及最佳內(nèi)參基因組合（β-TUB、β-TUB5和α-TUB3）對(duì)目的基因TFL1進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析，結(jié)果表明3個(gè)內(nèi)參基因組合校準(zhǔn)的基因表達(dá)模式更為準(zhǔn)確。在老鴉瓣（徐碧霞等，2021）、茉莉花（齊香玉等，2020）、芒（Miscanthus sinensis）（黃逸之等，2020）等物種的內(nèi)參研究中也證實(shí)，綜合不同軟件的分析結(jié)果更能反映給定實(shí)驗(yàn)條件下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。由此表明，本研究利用多個(gè)不同的算法對(duì)基因穩(wěn)定性進(jìn)行綜合評(píng)估從而對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，研究結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

TUB基因是生物體維持生命活動(dòng)所必須的細(xì)胞器骨架的基本組分，由α-TUB和β-TUB組成，具有良好的穩(wěn)定性（闕友雄等，2009）。有研究結(jié)果表明，馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）花芽的不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參研究中，TUB是最佳的內(nèi)參基因之一（張明超，2019）;刺葡萄（Vitis davidii）（潘紅等，2019）和石蒜屬（Lycoris）植物（蔣婷婷等，2015）在不同組織器官和非生物脅迫條件下篩選內(nèi)參基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)TUB的穩(wěn)定性最高。與前人研究結(jié)果一致，本研究綜合4個(gè)軟件分析結(jié)果確定TUB同源基因β-TUB、β-TUB5和α-TUB3為‘紅元寶’二次花芽分化研究的最佳內(nèi)參基因。但TUB基因并非適用于所有物種，在甜櫻桃（Prunus avium）（仇志浪等，2020）、萱草（Hemerocallis fulva）（梁錦等，2020）、馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）（周琳等，2020）不同品種和組織器官中，TUB表達(dá)不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參基因。這表明了內(nèi)參基因篩選研究受不同物種、組織器官及不同實(shí)驗(yàn)條件的影響。

綜合所述，本研究篩選到β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘紅元寶’二次花芽分化相關(guān)基因表達(dá)分析的穩(wěn)定內(nèi)參基因組合，能夠?qū)﹂_(kāi)花關(guān)鍵基因進(jìn)行較準(zhǔn)確的相對(duì)定量分析，本研究結(jié)果為木蘭屬植物二次或多次開(kāi)花的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

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