miRNA-222靶向Smad2/7對牙周膜干細(xì)胞向成骨分化的影響

胡佳薊 鐘香 唐翠連 張群慧

[摘要]目的：探討miRNA-222靶向Smad2/7對牙周膜干細(xì)胞向成骨分化的影響。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定人牙周膜干細(xì)胞表面標(biāo)志物，采用油紅O染色、茜素紅染色和阿爾新藍(lán)染色法驗(yàn)證成脂、成骨和軟骨分化能力，同時(shí)驗(yàn)證miRNA-222、sh-Smad2和sh-Smad7對成骨分化的影響，RT-PCR檢測miRNA-222在成骨分化中的表達(dá)，采用Western blot檢測miRNA-222對ALP、Runx2、OCN、Smad2和Smad7蛋白的影響。結(jié)果：牙周膜干細(xì)胞表面呈陽性表達(dá)的有STRO1和CD146，陽性率分別為98.63%和99.16%。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在成骨分化過程中，人牙周膜干細(xì)胞中miRNA-222表達(dá)明顯降低。茜素紅染色結(jié)果顯示，與空白組相比，miRNA-222模擬組中的紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯降低（P<0.05），miRNA-222抑制組中的紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著增多（P<0.05）;與sh-NC相比，sh-Smad2組和sh-Smad7組紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少（P<0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，miRNA-222模擬組的ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），與miRNA-222模擬組相比，miRNA-222抑制組的ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）;與空白組相比，miRNA-222模擬組的Smad2和Smad7蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），與miRNA-222模擬組相比，miRNA-222抑制組的Smad2和Smad7蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.001）。結(jié)論：過表達(dá)miRNA-222可以減少Smad2和Smad7表達(dá)，從而抑制人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。

[關(guān)鍵詞]miRNA-222;Smad2;Smad7;STRO1;CD146;成骨分化

[中圖分類號]R781.4+2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）02-0095-05

Effect of miRNA-222 Targeting Smad2/7 on Osteogenic Differentiation of Periodontal Ligament Stem Cells

HU Jiaji1，ZHONG Xiang1，TANG Cuilian2，ZHANG Qunhui1

（1.Department of Stomatology; 2.Department of Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Shaoyang University，Shaoyang 422000，Hunan，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of miRNA-222 targeting Smad2/7 on the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells （PDLSCs）. Methods Flow cytometry was used to identify the surface markers of human periodontal ligament stem cells. Oil red O staining， alizarin red staining and alcian blue staining were used to verify the adipogenic， osteogenic and chondrogenic differentiation abilities. The effects of miRNA-222， sh-Smad2 and sh-Smad7 on osteogenic differentiation were also verified. The expression of miRNA-222 in osteogenic differentiation was detected by RT-PCR， Western blot was used to detect the effect of miRNA222 on the expression of ALP， Runx2， OCN， Smad2 and Smad7 proteins. Results STRO1 and CD146 were positively expressed on the surface of periodontal ligament stem cells， and the positive rates were 98.63% and 99.16%， respectively. RT-PCR results showed that during the process of osteogenic differentiation， the expression of miRNA-222 in human periodontal ligament stem cells was significantly reduced. The results of Alizarin Red staining showed that compared with the blank group， the number of red-brown mineralized nodules in the miRNA-222 simulation group was significantly reduced （P<0.05）， and the red-brown mineralized nodules in the miRNA-222 inhibition group were significantly reduced. The number was significantly increased （P<0.05）， compared with sh-NC， the number of red-brown mineralized nodules in the sh-Smad2 and sh-Smad7 groups was significantly reduced （P<0.05）. Western blot detection results showed that compared with the blank group， the expression of ALP， Runx2， and OCN in the miRNA-222 simulation group was significantly reduced （P<0.05）. Compared with the miRNA-222 simulation group， the ALP， Runx2， and OCN protein expressions in the miRNA-222 suppression group The protein expression of Runx2 and OCN was significantly increased （P<0.05）， compared with the blank group， the expression of Smad2 and Smad7 protein in the miRNA-222 simulation group was significantly reduced （P<0.05）. Compared with the miRNA-222 simulation group， the expression of The protein expression of Smad2 and Smad7 in the miRNA- 222 inhibition group was significantly increased （P<0.001）. Conclusion Overexpression of miRNA-222 can reduce the expression of Smad2 and Smad7， thereby inhibiting the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells.

Key words： miRNA-222; Smad2; Smad7; STRO1; CD146; osteogenic differentiation

牙周炎是常見的牙周組織疾病，該病是由于牙菌斑中的細(xì)菌微生物及其代謝產(chǎn)物侵犯牙周組織而引起的慢性炎癥[1]，主要的病理改變是牙周袋的形成和牙槽骨的吸收。牙槽骨是人體骨骼中最活躍的代謝部分[2]，當(dāng)發(fā)生牙周炎時(shí)，牙槽骨處則同時(shí)發(fā)生著被破壞與修復(fù)性再生。在正常的生理狀態(tài)下，只有當(dāng)骨的吸收和修復(fù)性再生相平衡時(shí)才能保證牙槽骨代謝的穩(wěn)定。臨床上治療牙周炎的傳統(tǒng)方法是控制牙菌斑和消除牙周炎癥，而這些方法卻都無法獲得理想的牙周組織修復(fù)和再生。不過令人欣慰的是，已有相關(guān)研究表明，牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）可以修復(fù)牙周組織缺損，維持牙周的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)牙周組織再生[3]。此外，又有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNAs參與多種細(xì)胞的成骨分化進(jìn)程，并且可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路，在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中起著重要的調(diào)控作用[4]。牙周膜干細(xì)胞就是存在于牙周膜中的一種未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞[5]。因此，為了進(jìn)一步闡明miRNA-222調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制，筆者進(jìn)行了以下研究，以期為臨床在治療牙周炎方面提供一定的理論依據(jù)。

1? 資料和方法

1.1 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（購自美國Hyclone公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS）（購自中國Boster公司）;青霉素/鏈霉素溶液（購自美國Sigma公司）;STRO-1/CD146/CD45/C34/FITC（購自英國Abcam公司）;4%多聚甲醛、茜素紅、油紅O（購自美國Invitrogen公司）;ALP、Runx2、OCN、Smad2、Smad7抗體（購自中國Beyotime公司）;RIPA裂解液、BCA試劑盒和阿利新藍(lán)染色試劑盒（購自上海玉博生物科技有限公司）;miRNA-222mimic和miRNA-222inhibitor（購自美國Biolegend公司）;山羊抗兔IgG二抗（購自北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 樣本收集：收集筆者醫(yī)院口腔科就診的20例患者為研究對象。牙齒都是患者因?yàn)樽枭蛘蛐枰纬耐暾o齲且無牙周炎的前磨牙或第三磨牙;年齡20～36歲;經(jīng)患者知情同意。

1.3 方法

1.3.1 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：拔除的新鮮牙齒放入含有鏈霉素和青霉素的預(yù)冷的a-MEM溶液中，用無菌鑷取出，放置于含有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中，使用PBS反復(fù)沖洗，再用手術(shù)刀刮取根中1/3的牙周膜組織，放入培養(yǎng)瓶中，加入10 ml 20%的DMEM培養(yǎng)基，蓋好放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。一周后更換液體，去除未貼壁的漂浮組織，然后用顯微鏡觀察是否有細(xì)胞出現(xiàn)。當(dāng)有細(xì)胞出現(xiàn)后，每3 d更換1次液體，直至細(xì)胞覆蓋瓶底80%。吸去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，用1 ml的0.25%胰酶消化，持續(xù)敲打，再加入10%的DMEM培養(yǎng)基終止消化，制成單細(xì)胞懸液，離心處理，12 000 rpm離心5 min，然后去上清，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 人牙周膜干細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)鑒定：胰蛋白酶消化后，對數(shù)生長期人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行離心處理，1 200 rpm離心5 min，然后用PBS清洗3次，去上清。細(xì)胞密度稀釋至1×106細(xì)胞/毫升，取5份細(xì)胞懸液，每份各100 μl，加入STRO-1、CD146、CD45和CD34抗體，陰性對照組加入等量的PBS，避光室溫孵育20 min，1 200 rpm離心5 min，去上清，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 成骨、成脂和軟骨分化實(shí)驗(yàn)：人牙周膜干細(xì)胞中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸、50 mg/L抗壞血酸和100 nmol/L地塞米松，在10%FBS的a-MEM完全培養(yǎng)基中進(jìn)行成骨培養(yǎng)21 d，每2 d更換一次培養(yǎng)基。分別在第0、3、7、14、21天提取人牙周膜干細(xì)胞中總RNA。第21天，用油紅O染色法檢測人牙周膜干細(xì)胞的成脂分化能力;用茜素紅染色觀察人牙周膜干細(xì)胞的鈣鹽沉積和礦化結(jié)節(jié)情況;用阿爾新藍(lán)染色法檢測并評估人牙周膜干細(xì)胞的軟骨分化能力。

1.3.4 茜素紅染色結(jié)果：連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨分化21 d后，取出原有的培養(yǎng)基，PBS清洗2～3次，常溫下采用2 ml的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。

1.3.4.1 miRNA-222對成骨分化的影響：將固定后的細(xì)胞分為miRNA-222模擬組、miRNA-222抑制劑組和空白組，其中miRNA-222模擬組、miRNA-222抑制劑組和空白組分別轉(zhuǎn)染miRNA-222mimic、miRNA-222inhibitor、miRNA-222-NC，參照Lipo-2000說明書分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將干預(yù)后固定液用PBS緩沖液洗凈，每孔加入2%的茜素紅染色15 min，用PBS緩沖液洗去浮色，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1.3.4.2 sh-Smad2和sh-Smad7對成骨分化的影響：取三代人牙周膜干細(xì)胞接種于24孔板中，分為sh-Smad2組、sh-Smad7組和sh-NC組，然后分別轉(zhuǎn)染sh-Smad2、sh-Smad7、sh-NC。參照Lipo-2 000說明書分別對人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，棄掉原液，無菌PBS洗2次，將實(shí)驗(yàn)更換為成骨培養(yǎng)基，誘導(dǎo)2周后，4%的多聚甲醛固定，PBS緩沖液洗凈后，每孔加入2%的茜素紅染色15 min，用PBS緩沖液洗去浮色后，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1.3.5 RT-PCR檢測：用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，利用miRNA-222和GAPDH，miRNA-222引物序列上游為5′-GAGTCACGGGTCATCGGTCG-3'，下游為5′-AGATAGATACCGCATCGCA-3';GAPDH引物序列上游為5′-TAAAGCAGGAGGGCCCTTCG-3'，下游為5′-CATTGGCCACTTTCAAGGCGTC-3'。引物在生物系統(tǒng)7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR，mRNA的內(nèi)參照物為GAPDH，反應(yīng)條件為95 ℃，預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)40次，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，觀察miRNA-222在人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的表達(dá)。

1.3.6 Western blot檢測：PBS沖洗人牙周膜干細(xì)胞，用RIPA裂解液緩沖液裂解后得到蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將相應(yīng)體積的蛋白質(zhì)與載入緩沖液混合。在沸水浴中加熱3 min變性蛋白質(zhì)，30 min后SDS-PAGE凝膠蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，在室溫或4 ℃過夜。然后加入GAPDH（稀釋1：10 000）、Smad2（稀釋1：10 000）、Smad7（稀釋1：2 000）、Runx2（稀釋1：10 000）、ALP（稀釋1：10 000）、OCN（稀釋1：10 000）一抗，孵育1 h，PBS洗滌3次，每次10 min。再加入山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1 h，洗滌3次，共30 min。然后加入顯色劑顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)觀察miRNA-222對Smad2、Smad7、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)的影響。

2? 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)鑒定：分離的牙周膜干細(xì)胞表面呈陽性表達(dá)的有STRO1和CD146，陽性率分別為98.63%和99.16%，見圖1A和1B;CD45和CD34呈陰性表達(dá)，見圖1C和1D。

2.2 成脂、成骨和軟骨的分化能力：如圖2A所示，細(xì)胞周圍有大量的紅色油脂狀顆粒被染成紅色，證明人牙周膜干細(xì)胞具有成脂分化的能力;如圖2B所示，有紅褐色的鈣鹽沉積和礦化結(jié)節(jié)，說明人牙周膜干細(xì)胞有較好的成骨分化能力;如圖2C所示，人牙周膜干細(xì)胞具有較好的軟骨分化能力，都具備干細(xì)胞特性。

2.3 miRNA-222在人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中，miRNA-222水平逐漸降低，21 d，牙周膜干細(xì)胞成骨分化miRNA-222水平更低，與0 d相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖3。

2.4 miRNA-222表達(dá)對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響：茜素紅染色結(jié)果顯示，與空白組相比，miRNA-222模擬組中的紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），miRNA-222抑制組中的紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

2.5 miRNA-222表達(dá)對ALP、Runx2、OCN蛋白的影響：Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，miRNA-222模擬組的ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與miRNA-222模擬組相比，miRNA-222抑制組的ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

2.6 miRNA-222表達(dá)對Smad2和Smad7蛋白的影響：Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，miRNA-222模擬組的Smad2和Smad7蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與miRNA-222模擬組相比，miRNA-222抑制組的Smad2和Smad7蛋白表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖6。

2.7 sh-Smad2、sh-Smad7、sh-NC對成骨分化的影響：茜素紅染色結(jié)果顯示，與sh-NC相比，sh-Smad2組和sh-Smad7組紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖7。

3? 討論

牙周病通常是由于牙周支持組織受到厭氧菌感染而引起的慢性感染性疾病[6]，成年人發(fā)病率較高，有將近20%的患者有重度牙周炎[7]。該疾病早期無明顯癥狀，但是隨著病程的逐漸延長，牙周膜以及骨組織就會(huì)出現(xiàn)不可逆性喪失，臨床上常表現(xiàn)為牙齦出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙的松動(dòng)移位。因此，牙周病是導(dǎo)致成年人牙齒缺失的主要原因之一。治療牙周病的主要目的是停止牙周軟組織和硬組織的破壞，修復(fù)牙周組織并促進(jìn)牙周組織再生，但療效一般。近年來，以干細(xì)胞為主的組織工程修復(fù)技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注，并且效果顯著。牙周膜干細(xì)胞不僅具有維持牙周組織的動(dòng)態(tài)平衡，還具有分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞等多種細(xì)胞的多重分化和再生能力[8-9]。此外，牙周膜干細(xì)胞能夠激活相關(guān)的信號軸促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和增殖，并在體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)可以形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)及牙周膜，在正畸牙移動(dòng)的骨改建過程中起主要作用，是治療牙周病的熱點(diǎn)。因此，本研究以它為切入點(diǎn)進(jìn)行重點(diǎn)研究。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，分離的牙周膜干細(xì)胞表面呈陽性表達(dá)的有STRO1和CD146，陽性率分別為98.63%和99.16%，CD45和CD34呈陰性表達(dá)。油紅O染色法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞周圍有大量的紅色油脂狀顆粒被染成紅色，證明人牙周膜干細(xì)胞具有成脂分化的能力;茜素紅染色結(jié)果顯示，有紅褐色的鈣鹽沉積和礦化結(jié)節(jié)，說明人牙周膜干細(xì)胞有較好的成骨分化能力;阿爾新藍(lán)染色法結(jié)果顯示，人牙周膜干細(xì)胞具有較好的軟骨分化能力，都具備干細(xì)胞特性。以上的結(jié)果表明，分離和培養(yǎng)的細(xì)胞存在多向分化能力，與既往的相關(guān)報(bào)道具有一致性。本研究RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在成骨分化過程中，人牙周膜干細(xì)胞中miRNA-222表達(dá)明顯降低，而且通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，miRNA-222模擬組紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯降低，miRNA-222抑制組紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著增多。因此說明，下調(diào)miRNA-222的表達(dá)，有利于成骨分化。又通過Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-222模擬組ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)明顯降低，miRNA-222抑制組ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)顯著升高，又一次印證了細(xì)胞學(xué)成骨分化的能力。

miRNA在生命的發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用，參與生命的各種進(jìn)程[10]。相關(guān)研究表明，miRNAs可激活并調(diào)控人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞潛在的多功能性，尤其是在間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的能力中起著至關(guān)重要的作用[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-54在人牙周膜源性干細(xì)胞中作為成骨促進(jìn)劑發(fā)揮作用[12]。也有報(bào)道，沉默miRNA-132-3p表達(dá)通過促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和成骨修復(fù)[13]，抑制microRNA-222上調(diào)TIMP3促進(jìn)2型糖尿病骨折大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[14]。筆者通過Western blot檢測驗(yàn)證miRNA-222對Smad2和Smad7的影響，結(jié)果顯示，miRNA-222模擬組Smad2和Smad7蛋白表達(dá)明顯降低，miRNA-222抑制組Smad2和Smad7蛋白表達(dá)顯著升高。此處可以說明，miRNA-222的潛在靶基因?yàn)镾mad2和Smad7。許多研究通過靶向Smad家族成員證明了miRNAs與成骨進(jìn)展相關(guān)。相關(guān)研究表明，miR-24-3p可以靶向Smad5影響人牙周膜干細(xì)胞成骨分化[15]。另有研究表明，MiR-125a-3p通過靶向Smad4和Jak1負(fù)調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[16]，miR-1323通過抑制BMP4/SMAD4信號傳導(dǎo)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[17]。因此筆者推測Smad2和Smad7可能參與人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。為了驗(yàn)證它的準(zhǔn)確性，筆者采用茜素紅染色法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，沉默Smad2和Smad7，紅褐色礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少，從而說明，過表達(dá)miRNA-222可以降低Smad2和Smad7的表達(dá)，從而抑制人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。

綜上所述，miRNA-222可以調(diào)節(jié)Smad2和Smad7的表達(dá)，揭示了人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化機(jī)制，并為牙周組織再生的新治療策略提供了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2021-01-05

本文引用格式：胡佳薊，鐘香，唐翠連，等.miRNA-222靶向Smad2/7對牙周膜干細(xì)胞向成骨分化的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（2）：95-99.

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