多殺性巴氏桿菌相關(guān)毒力因子的研究進(jìn)展

多殺性巴氏桿菌（pasteurella multocida，Pm）是重要的畜禽致病菌，可引起多種動(dòng)物出現(xiàn)巴氏桿菌病。家禽感染表現(xiàn)為禽霍亂，豬感染則引起萎縮性鼻炎，牛，羊感染則主要表現(xiàn)為出血性敗血癥和傳染性肺炎。此外，還能感染美洲野牛，牦牛，鹿，河馬，大象，雪豹及獅子等野生動(dòng)物。在非洲和亞洲流行區(qū)，由多殺性巴氏桿菌引起的牛出血性敗血?。℉emorrhagic septicemia，HS）死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此牛出敗成為這些流行區(qū)國(guó)家的一種重要經(jīng)濟(jì)性動(dòng)物疫病。

1　黏附素

細(xì)菌感染的第一步是黏附到宿主細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上，因此由多殺性巴氏桿菌黏附素介導(dǎo)的黏附作用是重要的致病因素。

1.1 Ⅳ型菌毛

A、B、D型多殺性巴氏桿菌中存在Ⅳ型菌毛，經(jīng)鑒定其大小在18kDa左右，N端有高度保守的21個(gè)氨基酸序列。Ⅳ型菌毛能使細(xì)菌牢固附著于動(dòng)物呼吸道、消化道以及泌尿生殖道的黏膜上皮細(xì)胞上，是多殺性巴氏桿菌的一種重要毒力因子，由基因ptfA編碼。Siju等對(duì)B：2型巴氏桿菌ptfA基因進(jìn)行克隆和序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與A：1菌株的ptfA基因相似性為78.4%，說明不同菌型的多殺性巴氏桿菌的ptfA基因具有高度的變異性。Harper等利用菌毛抗體處理細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)能特異性抑制不同血清型菌株的黏附能力 [2]，說明Ⅳ型菌毛在細(xì)菌黏附過程中發(fā)揮重要作用。

1.2 絲狀血凝素

對(duì)多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70的基因組序列進(jìn)行分析，鑒定了兩個(gè)預(yù)測(cè)的絲狀血凝素基因FhaB1和Fhab2，均是毒力關(guān)鍵性基因，二者編碼的絲狀血凝素蛋白有45%的相似性，該蛋白促進(jìn)了細(xì)菌的彌散，有利于細(xì)菌的進(jìn)一步定植。若對(duì)多殺性巴氏桿菌的絲狀血凝素基因進(jìn)行誘變，則該菌對(duì)小鼠的毒力明顯減弱。在禽霍亂菌株P(guān)1059上突變pfhaB2基因后，該菌株通過鼻內(nèi)接種感染火雞，發(fā)現(xiàn)其致病力顯著減弱，而通過靜脈注射其毒力僅適度減弱，說明pfhaB2在細(xì)菌最初的入侵和定殖中具有重要作用。

1.3 纖維結(jié)合素受體

多種細(xì)菌存在纖維結(jié)合素受體，通過其脂質(zhì)末端與宿主體內(nèi)的纖維結(jié)合素相結(jié)合，從而起到細(xì)菌黏附的作用。ComE1是一種公認(rèn)的纖維結(jié)合素受體，大小是 12.7 kDa。透射電鏡技術(shù)顯示，ComE1位于Pm的細(xì)菌表面。ComE1蛋白C端包含2個(gè)螺旋-發(fā)夾-螺旋結(jié)構(gòu)域，重組ComE1（PM1665）能結(jié)合到固態(tài)纖連蛋白和Ⅰ型膠原蛋白上，但不能與包括纖維蛋白原，層粘連蛋白及透明質(zhì)酸等在內(nèi)的大分子物質(zhì)相結(jié)合。Mullen等利用ComE1抗血清處理多殺性巴氏桿菌，可以阻斷該菌與纖維結(jié)合素的結(jié)合。

2　外膜蛋白

外膜蛋白（outer membrance proteins，OMPs）是外膜中鑲嵌的多種蛋白質(zhì)的總稱。這些蛋白位于致病菌和宿主細(xì)胞的接觸面上，其功能受到各種選擇壓力的影響。外膜的主要組成成分，如膜結(jié)構(gòu)蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜結(jié)合蛋白和脂蛋白等，在病原菌和宿主環(huán)境的相互作用以及宿主對(duì)感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。其中OmpH、OmpA、鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白、OmpW是外膜蛋白重要成員。目前，對(duì)于Pm的OmpW研究較少，但對(duì)大腸桿菌的OmpW研究表明該蛋白與細(xì)菌抗吞噬作用相關(guān)。

2.1 外膜蛋白 H

OmpH是多殺性巴氏桿菌菌體最主要的外膜蛋白之一，是一個(gè)37kDa大小的通道樣跨膜孔蛋白，具有一般孔蛋白的特性。據(jù)報(bào)道，不同的多殺性巴氏桿菌菌株中，OmpH的分子質(zhì)量有所差異，在32～39 kDa左右。對(duì)15種不同血清型的多殺性巴氏桿菌OmpH序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明各血清型的OmpH蛋白同源性很高，具有高度保守性，相似度在72%～100%。OmpH能誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體。Luo等從A：3型多殺性巴氏桿菌菌株純化出天然的OmpH，并證明它可以誘發(fā)雞的同源保護(hù)，保護(hù)率達(dá)100%，與活菌誘導(dǎo)的保護(hù)率相同。有研究表明抗OmpH的單抗能夠保護(hù)小鼠抵抗多殺性巴氏桿菌的致死性感染，介導(dǎo)細(xì)胞向感染部位擴(kuò)散。通過對(duì)OmpH的抗原性及保護(hù)性了解的加深，使得開發(fā)更有效的多殺性巴氏桿菌疫苗成為可能。

2.2 外膜蛋白 A

OmpA蛋白又稱修飾蛋白，該蛋白經(jīng)SDS加熱后進(jìn)行SDSPAGA時(shí)，其涌動(dòng)速度明顯減慢，因此又被稱為慢孔蛋白。不同血清型Pm均有OmpA，其中B和D血清型Pm的OmpA含量是其他血清型OmpA的2倍。OmpA由兩個(gè)域組成，連接著外膜和肽聚糖。據(jù)推測(cè)，OmpA首要的功能是通過C-端與肽聚糖相互作用，以穩(wěn)定細(xì)胞外膜。OmpA除了作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定器，還被報(bào)道有作為黏附素和透明質(zhì)酸酶，介導(dǎo)多殺性巴氏桿菌對(duì)宿主細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)分子的黏著。通過抗外膜泡囊的單克隆抗體技術(shù)，多殺性巴氏桿菌OmpA蛋白最初被鑒定為一個(gè)36kDa大小、由兩個(gè)域的熱修飾蛋白。同一研究小組的后續(xù)工作表明，OmpA特異性的單克隆抗體不能保護(hù)小鼠抵抗多殺性巴氏桿菌的致死性感染。

2.3 鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白

鐵是細(xì)菌生存所必需的一種基本營(yíng)養(yǎng)元素，其在代謝電子傳遞鏈中具有重要作用。利用全基因組微陣列芯片技術(shù)對(duì)Pm70基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌中有超過50個(gè)基因參與鐵攝取及相關(guān)新陳代謝過程。其中，有許多大分子量蛋白參與菌體細(xì)胞內(nèi)鐵含量的調(diào)節(jié)，這些蛋白被統(tǒng)稱為鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白（Iron-regulated outer member proteins，IROMPs）。Choi-Kim 等人報(bào)道了分子量為76kDa，84kDa和96 kDa的3種鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白，這些蛋白只有在細(xì)菌生長(zhǎng)于限鐵培養(yǎng)條件下或在宿主體內(nèi)時(shí)才會(huì)表達(dá)。Boyce等人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與富鐵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的多殺性巴氏桿菌相比，限鐵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的多殺性巴氏桿菌能引起小鼠更強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。另據(jù)顧宏偉等人的研究發(fā)現(xiàn)，利用兔多殺性巴氏桿菌C51-17株的IROMPs抗血清對(duì)小鼠進(jìn)行被動(dòng)免疫，發(fā)現(xiàn)小鼠在接受C51-3株攻擊時(shí)，其中5/6獲得保護(hù)，表明IROMPs具有一定的交叉保護(hù)力。因此認(rèn)為，IROMPs可能在交叉保護(hù)性免疫反應(yīng)中具有重要作用。

3　內(nèi)毒素和外毒素

3.1 脂多糖

Pm的內(nèi)毒素脂多糖，位于細(xì)菌細(xì)胞壁外壁層的最表面，厚約8～lOnm，為革蘭陰性菌所特有，是革蘭陰性菌內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)和表面抗原的組成成分，并具有種特異性。一般來講，脂多糖由類脂A、核心寡糖及O-抗原三部分組成。脂多糖結(jié)構(gòu)的變化使得革蘭陰性菌細(xì)胞壁表面抗原決定簇具有多樣性。

水牛在發(fā)生出血性敗血癥的過程中，LPS在其中發(fā)揮重要的致病作用。靜脈注射自血清型B：2的菌株中分離的LPS可致水牛產(chǎn)生出血性敗血癥的癥狀。但幼齡火雞對(duì)從A型巴氏桿菌中分離的LPS具有一定的抵抗力，雞胚和小鼠則對(duì)多殺性巴氏桿菌LPS高度敏感。有研究顯示，多殺性巴氏桿菌的LPS在對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的黏附及移行過程中起著重要作用。LPS能引起機(jī)體體液免疫并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，因此認(rèn)為L(zhǎng)PS是一種保護(hù)性抗原。由于LPS具有促進(jìn)有絲分裂的活性，從而可刺激?？苿?dòng)物肺（下轉(zhuǎn)第228頁）