基于UPLC-Q-Extractive Orbitrap MS鑒定姜黃提取物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

王 媛，劉美娟，王宏進(jìn)，殷光玲，李 妍，張旭光，孫立新

(1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 本溪 110016；2.湯臣倍健股份有限公司，廣東 廣州 300146)

姜黃提取物主要包括姜黃素(CUR)、去甲氧基姜黃素(DMC)、雙去甲氧基姜黃素(BDMC)等姜黃素類化合物[1]，具有降脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、抗病毒等多種藥理活性[2]。有研究表明，姜黃素氫化代謝物四氫姜黃素表現(xiàn)出多種優(yōu)于姜黃素的生物活性[3]，二氫姜黃素可抑制細(xì)胞凋亡[4]、對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的脂堆積、氧化應(yīng)激損傷、胰島素抵抗具有一定的預(yù)防作用[5]。篩選出活性、穩(wěn)定性、生物利用度高于CUR、DMC、BDMC的代謝產(chǎn)物，在一定程度上能夠解決CUR、DMC、BDMC穩(wěn)定性差、生物利用度低的問題。

目前，與CUR相關(guān)的代謝產(chǎn)物研究較多[6-9]，而DMC和BDMC的研究較少，且僅報(bào)道了其在大鼠糞便、尿液中的一相代謝物[10-11]及其納米制劑[8]在大鼠糞便、尿液、血漿中的二相代謝物。對(duì)于姜黃提取物，僅報(bào)道了3種姜黃素類化合物在大鼠糞便、尿液中的一相代謝物[11]和人血漿[12]中的代謝產(chǎn)物，且分離出的代謝物較少[10-11]、質(zhì)譜數(shù)據(jù)不完善[12]。因此，本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Extrative Orbitrap MS)技術(shù)鑒定姜黃提取物中3種姜黃素類化合物的代謝產(chǎn)物，以期對(duì)姜黃素類化合物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)充，為后期篩選活性代謝物研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Vanquish Flex超高效液相色譜儀、Q-ExactiveTM四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(HESI)、TraceFinder 4.1工作站及TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；CPA225D型電子分析天平(1/10萬)：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16型高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

姜黃素對(duì)照品(純度≥98%)：中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素對(duì)照品(純度≥98%)：上海源葉生物有限公司產(chǎn)品；姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四叔丁基銨對(duì)照品(純度≥98%)：多倫多研究化學(xué)公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸、乙腈(色譜純)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

姜黃提取物：湯臣倍健股份有限公司產(chǎn)品，主要由姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3種化學(xué)成分組成，經(jīng)工作曲線法測(cè)定，其含量分別為192.5±1.6、44.99±0.56、44.29±0.7 mg/g(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠(雄性，體質(zhì)量220～250 g，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(遼) 2020-0001)：由沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1對(duì)照品溶液的制備 取適量的姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四丁基銨對(duì)照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，除姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉對(duì)照品用20%甲醇-水溶液溶解外，其他對(duì)照品均用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為87.0、72.0、102.0、61.0、80.0、109.0、99.0、89.0、107.0 mg/L對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃儲(chǔ)存，待用。

混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取各0.2 mL姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四丁基銨對(duì)照品儲(chǔ)備液，各0.3 mL去甲氧基姜黃素、四氫姜黃素，0.4 mL二氫姜黃素，置于100 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.174、0.204、0.218、0.198、0.178、0.214、0.216、0.240、0.244 mg/L混合對(duì)照品溶液，于4 ℃儲(chǔ)存，待用。

1.4.2灌胃溶液的制備 精密稱取適量的姜黃提取物，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(取約0.5 g羧甲基纖維素鈉，加入100 mL純凈水中，80 ℃加熱使其溶解，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)混懸，配制成約142 g/L混懸液。

1.4.3動(dòng)物分組和給藥 取18只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分成6組(n=3)，依次編號(hào)為K1、K2、K3、Y1、Y2、Y3。K1、K2、K3組分別用于收集空白糞便和尿液、空白血漿、空白膽汁；Y1、Y2、Y3組分別用于收集給藥糞便和尿液、給藥血漿、給藥膽汁。

實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物于SPF級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，給藥前禁食12 h，可自由飲水。禁食12 h后，Y1、Y2、Y3組大鼠灌胃給予姜黃提取物-0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，給藥劑量1 703 mg/kg(姜黃素327.8 mg/kg、去甲氧基姜黃素76.6 mg/kg、雙去甲氧基姜黃素75.4 mg/kg)。K1、K2、K3組大鼠灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.4.4生物樣品采集 將K1和Y1組大鼠置于代謝籠中，分別收集0～12 h時(shí)空白糞便和尿液、給藥糞便和尿液，并將收集的糞便樣品置于室溫下避光風(fēng)干，所有樣品于-20 ℃儲(chǔ)存，待用。

K2和Y2組大鼠分別于灌胃后0.25、1、2、3、4、6、8、12、24 h時(shí)從眼眶后靜脈叢取0.5 mL血，置于經(jīng)肝素鈉處理的EP管中，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，得到空白血漿和給藥血漿樣品，于-20 ℃儲(chǔ)存，待用。

K3和Y3組大鼠經(jīng)麻醉后做膽汁插管手術(shù)，分別收集0～12 h時(shí)空白膽汁和給藥膽汁樣品，于-20 ℃儲(chǔ)存，待用。

1.4.5樣品處理 血漿樣品：避光操作。分別取100 μL 9個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，置于同一棕色EP管中，加入3 mL甲醇，渦旋2 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一棕色EP管中，室溫下氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)?00 μL 75%甲醇復(fù)溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清液，備用。

糞便樣品：避光操作。將風(fēng)干后的糞便置于研缽中研碎，混合均勻。取約1 g混合均勻的糞便樣品，置于25 mL燒杯中，加入5 mL甲醇，超聲提取30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?；殘?jiān)? mL甲醇復(fù)溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清液，備用。

尿液、膽汁樣品：避光操作。精密量取各1 mL尿液、膽汁樣品，分別置于25 mL燒杯中，加入5 mL甲醇，超聲提取30 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?；尿液殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，膽汁殘?jiān)? mL甲醇復(fù)溶，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min, 離心2次，取上清液，備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～6 min(10%～30%B)，6～14 min(30%～65%B)，14～17 min(65%～95%B)，17～20 min(95%B)，20～20.1 min(95%～10%B)，20.1～23.1 min(10%B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(HESI源)，負(fù)離子模式檢測(cè)，鞘氣流速9 L/min，輔助氣流速3 L/min，噴霧電壓3.8 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，輔助氣溫度310 ℃。采用自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)(Full scan-ddMS2(TopN))數(shù)據(jù)采集模式；一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z150.0～2 000.0，分辨率70 000；二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500，分辨率17 500；碰撞氣為高純氮?dú)?；碰撞?0、30、40 eV；Top(N):10，自動(dòng)選擇質(zhì)譜產(chǎn)生的前10個(gè)最強(qiáng)離子峰作為二級(jí)質(zhì)譜的母離子進(jìn)行碎裂。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)照品質(zhì)譜裂解行為

在負(fù)離子模式下，對(duì)照品CUR、DMC、BDMC、二氫姜黃素、四氫姜黃素、六氫姜黃素、八氫姜黃素、姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉、姜黃素硫酸四叔丁基銨的色譜保留時(shí)間及準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-分別為13.68、13.43、12.95、13.42、13.17、9.59、8.95、10.38、11.19 min和m/z367.116 5、337.104 9、307.097 4、369.130 5、371.147 6、373.166 4、375.178 2、565.132 8、447.073 5。同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照品二氫姜黃素與四氫姜黃素分別在10.65、10.84 min處有1個(gè)色譜峰，其各自的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜碎片)分別與二氫姜黃素、四氫姜黃素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同。研究表明，姜黃素類為庚二酮類化合物，在溶液中同時(shí)存在酮式和烯醇式結(jié)構(gòu)[13-16]，推測(cè)保留時(shí)間10.65、10.84 min處分別為二氫姜黃素、四氫姜黃素烯醇式結(jié)構(gòu)的色譜峰。各對(duì)照品提取離子流色譜圖示于圖1。負(fù)離子模式下，姜黃素類化合物主要從碳碳單鍵處發(fā)生裂解，各對(duì)照品的具體裂解規(guī)律示于附圖1(請(qǐng)登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》網(wǎng)站http:∥www.jcmss.com.cn下載)。

注：1.八氫姜黃素；2.六氫姜黃素；3.姜黃素-β-O-葡萄糖醛酸鈉；4.姜黃素四叔丁基銨；5.雙去甲氧基姜黃素；6.去甲氧基姜黃素；7.姜黃素；8.二氫姜黃素(酮式)；8-1.二氫姜黃素(烯醇式)；9.四氫姜黃素(酮式)；9-1.四氫姜黃素(烯醇式)圖1 各對(duì)照品提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of references

2.2 代謝產(chǎn)物分析

首先，根據(jù)原型藥物結(jié)構(gòu)推測(cè)可能的代謝產(chǎn)物，檢索姜黃素類化合物代謝產(chǎn)物文獻(xiàn)，建立包括化合物名稱、分子式、精確分子質(zhì)量、一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜碎片的代謝物數(shù)據(jù)庫；其次，利用TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理軟件，同時(shí)在空白樣品和給藥樣品的總離子流圖中提取數(shù)據(jù)庫中代謝產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量，得到僅在給藥樣品中色譜峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息，并結(jié)合文獻(xiàn)、對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)及姜黃素類化合物的裂解規(guī)律[13-14]，鑒定代謝產(chǎn)物，對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1。姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物扣除空白后的總離子流色譜圖示于圖2。

表1 負(fù)離子模式下，各對(duì)照品一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 MS1 and MS2 data of references in negitive ion mode

注：a.血漿；b.糞便；c.膽汁；d.尿液圖2 姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物扣除空白后的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of metabolites subtracted background of turmeric extract in rats

2.3 姜黃提取物在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定

本研究共鑒定出59個(gè)代謝產(chǎn)物，包括16個(gè)雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物(B1～B16)、15個(gè)去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物(D1～D15)、16個(gè)姜黃素代謝產(chǎn)物(C1～C16)、12個(gè)無法歸屬的代謝產(chǎn)物(W1～W12)。代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于附表1。B3、B7、B8、B11～B13、C3、D3、D5、D8、D10、W1～W5、W7、W10、W12代謝產(chǎn)物的鑒定如下(其他代謝物二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)[8,10,17-23]數(shù)據(jù)一致)。

B3保留時(shí)間為6.14 min，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z565.099 9，推測(cè)分子式可能為C25H25O13S，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰大258 u(176+80+2)，表明B3可能為BDMC硫酸酯化葡萄糖醛酸化氫化代謝產(chǎn)物。B3的二級(jí)碎片離子m/z485.145 0、389.067 9分別比準(zhǔn)分子離子峰少80 u、176 u，證實(shí)B3中含有硫酸和葡萄糖醛酸；碎片離子m/z309.111 6比BDMC準(zhǔn)分子離子峰多2 u，表明BDMC雙鍵處發(fā)生還原，其母核結(jié)構(gòu)可能為二氫雙去甲氧基姜黃素。進(jìn)一步裂解發(fā)現(xiàn)，m/z199.006 2由m/z565.099 9從C2、C3處裂解得到，m/z199.006 2失去1分子硫酸后得m/z119.049 7，因此，推測(cè)B3為二氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯。由碎片離子m/z199.006 2可知，硫酸與雙鍵左側(cè)的羥基結(jié)合。

B7保留時(shí)間為7.05 min，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z491.191 3，推測(cè)分子式可能為C25H32O10，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰大184 u(176+8)，表明可能為BDMC葡萄糖醛酸化氫化代謝物。B7的二級(jí)碎片離子m/z315.158 3比準(zhǔn)分子離子峰多176 u，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰多8 u，表明B7可能為八氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸代謝物。進(jìn)一步比較B7與B1(八氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸)的質(zhì)譜碎片，發(fā)現(xiàn)B7的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z491.191 3、315.158 3與B1的碎片離子m/z491.191 0[M-H-SO3]-、315.159 7[M-H-SO3-GluA]-相同，且B1中m/z315.159 7同樣未進(jìn)一步發(fā)生裂解，二者裂解方式相同。在保留時(shí)間6.29 min處，其準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子均與B7相同，因此推測(cè)6.29 min處為B7烯醇式結(jié)構(gòu)色譜峰。

同理，可分別鑒定B8、B11為二氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸、四氫雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。保留時(shí)間7.91 min處為B11烯醇式結(jié)構(gòu)色譜峰。B8碎片離子m/z203.070 5、119.049 8由B8準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z487.159 1失去1分子葡萄糖醛酸后，分別從C6、C7及C2、C3處發(fā)生斷裂得到；B11碎片離子m/z205.086 1、163.075 7由B11準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z487.159 1失去1分子葡萄糖醛酸后，分別從C6、C7及C4、C5處發(fā)生斷裂得到。

B12保留時(shí)間為10.49 min，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z389.067 7，推測(cè)分子式可能為C19H17O7S，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰多82 u(80+2)，表明可能為BDMC硫酸酯化氫化代謝物。B12碎片離子m/z309.112 1比其準(zhǔn)分子離子峰少80 u，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰多2u，比對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰多2 u，推測(cè)可能為二氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯代謝物。碎片離子m/z269.011 9為準(zhǔn)分子離子峰m/z389.067 7從C5、C6處斷裂得到，且可知硫酸與雙鍵一側(cè)羥基結(jié)合；m/z203.070 6為準(zhǔn)分子離子峰m/z389.067 7從雙鍵處發(fā)生斷裂得到，因此推測(cè)B12可能為二氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯，其二級(jí)碎片離子m/z189.055 1由m/z269.011 9失去1分子硫酸得到。同理，B13為四氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯，保留時(shí)間8.38 min處為B13烯醇式結(jié)構(gòu)色譜峰。

C3準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z625.120 7，推測(cè)分子式可能為C27H29O15S，與對(duì)照品CUR準(zhǔn)分子離子峰相比多258 u(176+80+2)，推測(cè)為CUR硫酸酯化葡萄糖醛酸化氫化代謝物。C3的碎片離子m/z545.165 6、449.091 0與準(zhǔn)分子離子峰分別相差80 u、176 u，證實(shí)C3中含有葡萄糖醛酸和硫酸酯結(jié)構(gòu)。二級(jí)碎片離子m/z369.131 3、219.065 5、149.060 2、113.024 1與二氫姜黃素對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜碎片相同，因此推測(cè)C3為二氫姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯。m/z229.016 5表明葡萄糖醛酸與雙鍵左側(cè)羥基結(jié)合。

D3準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z595.112 5，推測(cè)分子式可能為C26H27O14，與對(duì)照品DMC準(zhǔn)分子離子峰相比多258 u(176+80+2)，推測(cè)為DMC葡萄糖醛酸硫酸酯化氫化代謝物。m/z419.078 7[M-H-GluA]-、339.120 2[M-H-GluA-SO3]-證實(shí)結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖醛酸和硫酸，且其碎片離子m/z339.120 2比去甲氧基姜黃素準(zhǔn)分子離子峰多2 u，因此推測(cè)D3為二氫去甲氧基姜黃葡萄糖醛酸硫酸酯。m/z229.016 5表明葡萄糖醛酸與雙鍵左側(cè)羥基結(jié)合、甲氧基位于雙鍵左側(cè)，由準(zhǔn)分子離子峰從C2、C3處裂解得到。

D5準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z519.183 5，推測(cè)分子式為C26H31O11，利用TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)m/z519.183 5進(jìn)行元素成分分析，發(fā)現(xiàn)D5與六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸的分子質(zhì)量誤差小于5×10-6，初步推測(cè)為六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。用ChemDraw軟件繪制六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行碎片裂解，發(fā)現(xiàn)D5碎片離子m/z179.070 7為m/z519.183 5失去1分子葡萄糖醛酸后，從C3、C4處發(fā)生斷裂得到，m/z179.070 7進(jìn)一步失去1分子OCH3后，得到碎片離子m/z149.060 7，因此推測(cè)D5為六氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。

D8保留時(shí)間為9.85 min，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z421.095 6，推測(cè)分子式為C20H21O8S，比對(duì)照品DMC準(zhǔn)分子離子峰多84 u(80+4)，表明其可能為DMC氫化硫酸酯化代謝物。碎片離子m/z341.136 5[M-H-SO3]-證實(shí)存在硫酸酯，碎片離子m/z341.136 5比DMC準(zhǔn)分子離子峰多4 u，因此推測(cè)D8為四氫去甲氧基姜黃素硫酸酯。其二級(jí)碎片離子m/z235.097 6由準(zhǔn)分子離子峰失去1分子硫酸后，從C6、C7處發(fā)生斷裂得到；m/z219.101 1由準(zhǔn)分子離子峰失去1分子硫酸后，從C5、C6處發(fā)生斷裂，同時(shí)C5上羰基失去1分子氫與C3環(huán)合成丁烯內(nèi)酯結(jié)構(gòu)得到。同理，保留時(shí)間7.13 min處為D8烯醇式結(jié)構(gòu)色譜峰，m/z259.027 6表明硫酸與甲氧基一側(cè)的羥基結(jié)合，由m/z421.095 6從C3、C4處裂解得到。

D10與D8擁有相同的碎片離子m/z341.137 4、235.096 7，推測(cè)D8與D10具有相同的母核結(jié)構(gòu)，且其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z517.171 8比碎片離子m/z341.137 4多176 u，表明D10為葡萄糖醛酸代謝物，因此推測(cè)其為四氫去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸。

W1～W5：W5保留時(shí)間為4.92 min，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z273.043 8，推測(cè)分子式為C11H13O6S。W5準(zhǔn)分子離子峰與C8特征碎片離子m/z273.043 0相同，表明該化合物結(jié)構(gòu)可能與C8特征碎片離子結(jié)構(gòu)相同。碎片離子m/z193.086 2[M-H-SO3]-證實(shí)存在硫酸，m/z178.063 0為m/z273.043 8失去1分子硫酸后，再失去1分子CH3得到，因此推測(cè)W5為4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-丁-2-酮硫酸酯，其二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律示于圖3。W3保留時(shí)間為4.66 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z369.117 0，推測(cè)分子式為C17H21O9。二級(jí)碎片離子m/z193.086 7[M-H-GluA]-表明W3為葡萄糖醛酸代謝物，且其碎片離子m/z193.086 7、178.063 6與W5相同，因此推測(cè)W3為4-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-丁-2-酮葡萄糖醛酸。

W1準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z371.132 0，推測(cè)分子式為C17H23O9，比W3準(zhǔn)分子離子峰多2 u，推測(cè)W1為W3氫化代謝物。W1的二級(jí)質(zhì)譜碎片m/z195.101 9[M-H-GluA]-證實(shí)存在葡萄糖醛酸，且W1準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子m/z195.101 9、180.078 3比W3準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子m/z193.086 7、178.063 6均多2 u，表明W1發(fā)生了氫化，因此推測(cè)W1為4-(3-羥丁基)-2-甲氧基苯酚葡萄糖醛酸。W2準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z275.059 6，推測(cè)分子式為C11H15O6S，比W5準(zhǔn)分子離子峰多2 u，推測(cè)W2為W5氫化代謝物，其二級(jí)碎片離子m/z195.101 9[M-H-SO3]-證實(shí)結(jié)構(gòu)中含有硫酸，碎片離子m/z195.101 9、180.078 6與W1相同，因此推測(cè)W2為4-(3-羥丁基)-2-甲氧基苯酚硫酸酯。

W4準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z243.032 7，推測(cè)分子式為C10H11O5S，比W5準(zhǔn)分子離子峰少30 u，表明W4在結(jié)構(gòu)上比W5少1個(gè)甲氧基。m/z243.032 7比碎片離子m/z163.076 0多80 u，證實(shí)W4中含有硫酸結(jié)構(gòu)，而m/z119.048 9為m/z243.032 7失去1分子硫酸后，再失去1分子CO得到，因此推測(cè)該化合物為4-(4-羥苯基)-丁-2-酮硫酸酯。

W7保留時(shí)間為7.12 min，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z409.094 2，推測(cè)分子式為C19H21O8S，與對(duì)照品BDMC相比多102 u(80+16+6)，推測(cè)W7可能為BDMC羥基化氫化硫酸酯化代謝物。碎片離子m/z329.137 5證實(shí)存在硫酸。碎片離子m/z149.060 1為m/z329.137 5從C4、C5處裂解后失去1分子羥基得到，表明W7中含有羥基，因此推測(cè)W7為羥基化六氫雙去甲氧基姜黃素硫酸酯。碎片離子m/z245.011 6、259.027 7表明羥基與硫酸化均位于羰基碳一側(cè)，m/z179.070 7為m/z259.027 7失去1分子硫酸得到。保留時(shí)間5.12 min處為W7烯醇式結(jié)構(gòu)色譜峰。

W10準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z291.102 6，推測(cè)分子式為C19H15O3，與對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰相比少16 u，推測(cè)W10為BDMC去羥基化代謝物。利用ChemDraw軟件繪制BDMC去掉1分子羥基的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)姜黃素類化合物裂解規(guī)律[7-8]進(jìn)行碎片裂解，發(fā)現(xiàn)得到的碎片離子與實(shí)際得到的碎片離子不符，推測(cè)W10為BDMC去羥基化的同分異構(gòu)體。嘗試將C3、C4位置的雙鍵結(jié)構(gòu)換成三鍵，并去掉C1、C2位置的雙鍵，再次進(jìn)行裂解發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)分子離子峰m/z291.102 6分別從C1和C2、C2和C4、C4和C5處斷裂得到m/z185.060 0、171.044 6、145.056 2。其中，m/z249.091 1為m/z291.102 6失去1分子CO后重排得到，因此推測(cè)W10為1,7-雙(4-羥基苯基)庚-1-烯-4-炔-3-酮，其質(zhì)譜裂解規(guī)律示于圖4。

圖3 W5二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.3 MS2 spectrum and proposed fragmention pathways of W5

圖4 W10二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.4 MS2 spectrum and proposed fragmental pathways of W10

同理，W12準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z295.133 2，推測(cè)分子式為C19H19O3，與對(duì)照品BDMC準(zhǔn)分子離子峰相比少12 u(16-4)，推測(cè)由BDMC失去1分子雙鍵氧和1分子雙鍵得到。利用ChemDraw軟件繪制BDMC去掉1分子雙鍵氧和1分子雙鍵的結(jié)構(gòu)，并根據(jù)姜黃素類化合物的裂解規(guī)律[13-14]進(jìn)行碎片裂解，推測(cè)W12為四氫雙去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物，其質(zhì)譜裂解規(guī)律示于圖5。

圖5 W12二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律Fig.5 MS2 spectrum and proposed fragmental pathways of W12

2.4 CUR、DMC、BDMC在大鼠體內(nèi)的代謝途徑

姜黃提取物中3種姜黃素類化合物在大鼠血漿、膽汁中的代謝途徑以母體藥物還原氫化后與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合為主；糞便中以母體藥物還原氫化、還原氫化后與硫酸結(jié)合為主；尿液中以母體藥物還原氫化、還原氫化后與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合為主。姜黃提取物中3種姜黃素類化合物在大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑示于圖6。

2.5 討論

本研究在姜黃提取物中共鑒定出59個(gè)代謝產(chǎn)物，糞便中18個(gè)、尿液中39個(gè)、血漿中33個(gè)、膽汁中36個(gè)。其中，姜黃素代謝產(chǎn)物16個(gè)(血漿中8個(gè)、糞便中5個(gè)、尿液中11個(gè)、膽汁中8個(gè))；去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物15個(gè)(血漿中8個(gè)、糞便中3個(gè)、尿液中10個(gè)、膽汁中9個(gè))；雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物16個(gè)(血漿中11個(gè)、糞便中4個(gè)、尿液中12個(gè)、膽汁中13個(gè))；無法歸屬的代謝產(chǎn)物12個(gè)(血漿、糞便、尿液、膽汁各6個(gè))。

不同生物樣品中，姜黃提取物各代謝產(chǎn)物在種類和數(shù)量上存在交叉。研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)存在于血漿、尿液、膽汁3種生物樣品中的代謝物最多，有14個(gè)(B1、B2、B6、B8、B9、B14、C2、C5、D2、D5、D8、W2、W4、W5)，為六氫或八氫原型藥物的葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合物、六氫或八氫原型藥物的葡萄醛酸和硫酸共同結(jié)合物；同時(shí)存在于糞便、尿液和膽汁生物樣品中的代謝物有3個(gè)，分別為C11(四氫雙去甲氧基姜黃素硫酸)、D14(去甲氧基姜黃素)、W7(六氫羥基化雙去甲氧基姜黃素硫酸酯)。糞便與尿液共同代謝產(chǎn)物有8個(gè)(B15、B16、C14、C15、C16、D13、W10、W12)，為一相代謝物和原型藥物；血漿與尿液共同代謝產(chǎn)物有4個(gè)(B11、C9、C12、D12)，主要為原型藥物葡萄糖醛酸或硫酸酯結(jié)合物；血漿與膽汁共同代謝產(chǎn)物有4個(gè)(B5、B13、C6、D6)，主要為四氫原型藥物的葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物；尿液與膽汁生物樣品中共同代謝產(chǎn)物有3個(gè)(B7、C4、D1)，為八氫原型藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物或葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物；4種生物樣品中均可發(fā)現(xiàn)代謝物B4、B10、C8、D4，為八氫或六氫原型藥物的硫酸酯結(jié)合物。此外，D3、D11、C3、B3、B12等二氫化原型藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物或葡萄糖醛酸和硫酸共同結(jié)合物僅在膽汁中發(fā)現(xiàn)。

本研究未對(duì)W1～W12進(jìn)行歸屬，是因?yàn)閃1～W5化合物結(jié)構(gòu)較小，無法判斷是姜黃提取物中哪種成分的代謝產(chǎn)物；而W8、W9既可能是去甲氧基姜黃素去甲基化代謝產(chǎn)物，也可能是雙去甲氧基姜黃素羥基化代謝物；W10～W12既可能是雙去甲氧基姜黃素代謝物，也可能是姜黃提取物中其他姜黃素類化合物以原型形式排出體外；W7作為W8硫酸酯化代謝物同樣無法進(jìn)行歸屬。另外，由于3種姜黃素類化合物均可能產(chǎn)生W6，因此本研究并未將W6歸屬為姜黃素代謝產(chǎn)物[19]。

與文獻(xiàn)[6,8-11]對(duì)比，本研究在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了16個(gè)新的代謝產(chǎn)物(B3、B7、B8、B11～B13、C3、D3、D5、D8、D10、W1、W2、W4、W5、W7、W10)、4個(gè)已知代謝物(B6、W3、W11、W12)。但未鑒定出文獻(xiàn)[11](大鼠灌胃給予姜黃素類化合物)在大鼠糞便和尿液中分離出的六氫姜黃素、六氫雙去甲氧基姜黃素、八氫姜黃素、八氫雙去甲氧基姜黃素、1,5-環(huán)氧-3-羰基-1,7-雙(4-羥基苯基)-4,6-庚二烯、八氫姜黃素二去甲基化二去羥基化代謝物、八氫雙去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物；未鑒定出文獻(xiàn)[10](大鼠灌胃給予去甲氧基姜黃素單體)在大鼠糞便和尿液中分離出的5-去羥基二氫去甲氧基姜黃素、六氫去甲氧基姜黃素甲基化代謝物、六氫去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物、八氫去甲氧基姜黃素去羥基化代謝物，這可能是因?yàn)樯鲜龃x產(chǎn)物排出體外需要的時(shí)間較長(zhǎng)(收集糞便和尿液時(shí)間為48 h)，而本研究?jī)H收集了0～12 h的糞便和尿液；未鑒定出文獻(xiàn)[6,9](大鼠灌胃給予姜黃素單體)在大鼠血漿中分離出的六氫姜黃素[6,9]、八氫姜黃素[6]、4-(3-羥丙基-1-烯基)-2甲氧基苯酚[6]、4-(3-羥丙基)-2-甲氧基苯酚[6]、1-羥基-4-(4-羥基-3-甲基苯基)-3-烯-2-酮[6]、二氫姜黃素葡萄糖醛酸[9]，這可能是因?yàn)榻S提取物中的其他成分會(huì)促進(jìn)姜黃素在大鼠體內(nèi)的代謝，加快了一相代謝物向二相代謝物的轉(zhuǎn)變；未鑒定出文獻(xiàn)[8](大鼠分別灌胃給予姜黃素納米制劑、去甲氧基姜黃素納米制劑、雙去甲氧基姜黃素納米制劑)在大鼠體內(nèi)分離出的去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯、雙去甲氧基姜黃素葡萄糖醛酸硫酸酯、六氫去甲氧基姜黃素硫酸酯、二氫雙去甲氧基姜黃素，這可能是因?yàn)楸狙芯恐腥ゼ籽趸S素和雙去甲氧基姜黃素的給藥劑量比文獻(xiàn)低。

3 結(jié)論

本研究共鑒定出59個(gè)大鼠血漿、糞便、尿液、膽汁中的姜黃提取物代謝產(chǎn)物，其中16個(gè)新的代謝產(chǎn)物，糞便、血漿中新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物各2個(gè)，尿液中新發(fā)現(xiàn)1個(gè)代謝產(chǎn)物。研究表明，姜黃素類化合物原型成分及一相代謝產(chǎn)物主要存在于糞便、尿液中，二相代謝產(chǎn)物主要存在于血漿、膽汁中。本研究對(duì)去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素代謝產(chǎn)物進(jìn)行了補(bǔ)充，可為后續(xù)活性代謝物的篩選提供依據(jù)。