毒蕈堿受體通過Yes相關蛋白信號對口腔鱗狀細胞癌生物學行為的實驗研究

江涵 神應強 陳謙明

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔黏膜病國家臨床重點?？浦袊t(yī)學科學院口腔黏膜癌變與防治創(chuàng)新單元 四川大學華西口腔醫(yī)院口腔黏膜病科 成都 610041

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的頭頸部惡性腫瘤，具有難治療、易轉移、預后差、易復發(fā)等特點，5年生存率低于50%。早診斷和早治療是提高OSCC患者生存率的關鍵[1-2]。早期就有研究揭示毒蕈堿（muscarinic，m）受體具有作為致癌基因的潛能[3-4]。近年來，圍繞m受體所展開的基礎研究也逐漸增多,但在不同類型的癌癥中，其作用機制尚無定論。因此，本研究利用癌癥基因圖譜（the cancer gene atlas，TCGA）數據庫及若干OSCC細胞系探討了m受體在OSCC 中的表達情況，并研究了m受體激動劑卡巴膽堿在OSCC發(fā)生發(fā)展中的潛在作用及可能機制，以期為OSCC 的治療提供新靶標。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人OSCC細胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮角質細胞HOK（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室）。逆轉錄試劑盒（Takara公司，日本）。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 核酸擴增檢測系統(tǒng)試劑盒（Applied Biosystems公司，美國）?？ò湍憠A試劑（Sigma-Aldrich公司，美國）。細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒CCK8（Dojindo公司，日本）。Matrigel（BD公司，美國），Transwell小室（Corning公司，美國）。Yes相關蛋白（Yes related protein，YAP）-1抗體（Abcam公司，美國），p-YAP（S127）抗體（Cell signaling technology公司，美國）。

1.2 引物合成

根據既往文獻[5]確定目的基因及內參基因序列及引物。引物序列如表1。

表1 m受體基因的引物序列Tab 1 Primer sequence of m receptor genes

1.3 TCGA數據庫查詢

通過TCGA數據庫查詢m受體亞型基因在人體各種癌癥類型中及在頭頸部腫痛和正常組織中的差異表達水平，再進一步查詢生存曲線分析各受體亞型基因對預后的影響。

1.4 RT-qPCR

分別提取人OSCC細胞系Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12以及人口腔上皮膠質細胞HOK的總RNA，通過逆轉錄試劑盒逆轉錄分別獲得各基因組DNA，用RT-qPCR擴增chrm1、chrm3、chrm5，反應體系為20 μL，SYBRTMSelect Master Mix預混液10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，無酶水7.2 μL。預變性95 ℃，2 min；變性95 ℃，15 s；退火65 ℃，15 s，延伸72 ℃，1 min共40個循環(huán)。每個樣品3個復孔，采用2-ΔΔCT法進行結果分析。

1.5 CCK8細胞增殖實驗

將卡巴膽堿用滅菌水配制成100 mmol·L-1母液溶解后置于-80 ℃保存，實驗時處理組按不同濃度對母液稀釋，對照組加入等體積的稀釋液。取處于對數生長期的細胞系HSC4和HN12，分別消化離心后，再分別均勻鋪于96孔板中，待細胞貼壁生長至約50%后，加入濃度梯度的卡巴膽堿（10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1 μmol·L-1）工作液，對照組換成等體積的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后向每孔加入含有10%CCK8的200 μL工作液，孵育1.5 h后用酶標儀測定在450 nm處的光密度（optical density，OD）值，計算細胞存活率。

1.6 Transwell細胞侵襲實驗

提前將Matrigel于4 ℃融化，按照1∶4的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel，再將其均勻鋪于Transwell小室內膜上，置于37 ℃孵箱中1 h 使Matrigel凝固。將生長良好的OSCC細胞系HSC4和HN12消化離心，用無血清的培養(yǎng)基將懸液調整為每毫升5×105個備用。取出24孔板，先將含有濃度為1 μmol·L-1的卡巴膽堿無血清培養(yǎng)基500 μL加入24孔板，再將小室置于孔板中，向每個小室內各加入上述處理好的細胞懸液200 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，結晶紫染色后漂洗除去多余染料，將小室的膜裁剪下來封片后置于顯微鏡下觀察。采集隨機選取的4個區(qū)域的固定細胞圖像，統(tǒng)計侵襲細胞數。

1.7 細胞免疫熒光實驗

通過細胞免疫熒光實驗檢測卡巴膽堿對OSCC細胞核轉位的影響。將生長良好的OSCC細胞系HN12的細胞懸液稀釋成每毫升1×104個加入4孔腔室載玻片中，每孔0.5 mL。待細胞貼壁后，換成含有卡巴膽堿（工作濃度為1 μmol·L-1）的培養(yǎng)基處理24 h后，將培養(yǎng)基棄去，經固定、透膜及封閉后加入YAP1一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入熒光二抗室溫孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，每次15 min，滴加少許4’，6-二脒基-2-苯基吲哚蓋上蓋玻片于熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western Blot實驗

通過Western Blot實驗檢測經卡巴膽堿處理后Hippo信號通路相關蛋白的表達水平。收集經卡巴膽堿（工作濃度為1 μmol·L-1）處理2 h的OSCC細胞HN12的蛋白，使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度后并加入5×上樣緩沖液混合煮沸10 min行凝膠電泳，結束后用濕轉法將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h后，根據相應蛋白相對分子質量大小裁剪聚偏氟乙烯膜，分別加入對應的YAP1，p-YAP（S127）一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，加入5 000×稀釋的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，用Western Blot顯影液顯影。

1.9 統(tǒng)計學分析

用Graphpad Prism 8.0軟件進行分析，多組之間的比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫查詢結果分析

為整體了解m 受體基因（chrm1、chrm3、chrm5）在HNSC中的表達及與正常組織的表達差異性和對預后的影響，通過TCGA數據庫檢索，結果顯示如圖1A～C所示：在人體多種類型的癌癥中，與相應正常組織相比，m受體基因均有表達差異。其中chrm1在HNSC中的表達降低，而chrm3、chrm5在HNSC中的表達升高。生存分析曲線結果顯示（圖1D～F）：chrm1和chrm5對生存期無影響，但是chrm3表達高的組別比正常組生存期低，且差異有統(tǒng)計學意義，提示chrm3與預后相關。

圖1 m受體亞型基因的差異表達及生存分析Fig 1 The expression of m receptor subtype genes and survival analysis in TCGA database

2.2 RT-qPCR結果分析

通過RT-qPCR 反應擴增的目的基因chrm1、chrm3、chrm5片段，結果顯示：相對于人口腔上皮角質細胞HOK，人OSCC 細胞Cal27、HSC3、HSC4、HN4、HN12中，HN4和HN12細胞chrm3高表達，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）（圖2B）。此外，chrm1和chrm5在腫瘤細胞中及正常 細胞中無明顯差異（圖2A、C）。

圖2 OSCC細胞株中m受體基因的表達水平Fig 2 The expression of m receptor subtype genes in OSCC cells

2.3 CCK8 細胞增殖與Transwell 細胞侵襲實驗結果分析

通過CCK8細胞增殖實驗在卡巴膽堿作用細胞24 h后結果（圖3A）顯示：隨著卡巴膽堿濃度的增高，chrm3高表達的HN12細胞增殖活性逐漸增強，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而chrm3受體正常表達的HSC4細胞系的增殖則不受卡巴膽堿濃度的影響。為了進一步檢測卡巴膽堿有無誘導OSCC細胞侵襲的作用，仍然選取HSC4和HN12細胞，在卡巴膽堿工作濃度為1 μmol·L-1進行Transwell細胞侵襲實驗，結果如圖3B～G所示：卡巴膽堿對m受體基因不同表達水平的細胞均有促進侵襲的作用，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖3 卡巴膽堿在不同濃度下分別對HN12和HSC4細胞增殖活性及侵襲能力的影響Fig 3 Carbachol on the proliferation and invasion ability of HN12 and HSC-4 cells at different concentrations

2.4 細胞免疫熒光實驗

為了分析卡巴膽堿是否通過影響Hippo信號通路來促進OSCC細胞的增殖和侵襲，采用細胞免疫熒光實驗對比加入卡巴膽堿后YAP的細胞核轉位有無變化。結果如圖4所示：與對照組相比，卡巴膽堿處理后，HN12細胞中YAP的核轉位增加，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 卡巴膽堿對OSCC細胞內YAP核轉位的影響Fig 4 The effect of Carbachol on the nuclear translocation of YAP in OSCC cells

2.5 Western Blot實驗

為了進一步分析上述結果中YAP和p-YAP在細胞內表達水平的變化情況，采用Western Blot實驗對比在經過卡巴膽堿處理后的OSCC細胞中YAP的p-YAP的表達水平。結果如圖5所示：與對照組相比，卡巴膽堿處理后，HN12細胞中的YAP和p-YAP具有差異表達，其中HN12細胞中YAP表達升高，而p-YAP（S127）表達降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖5 YAP和p-YAP經過卡巴膽堿處理后在OSCC細胞中的表達水平Fig 5 The expression level of YAP and p-YAP in OSCC cells after treatment with Carbachol

3 討論

OSCC的治療雖在近幾年有所進步，但是由于其預后差，尋找新的有效的治療靶點及藥物仍是亟待解決的問題。神經對組織生長的依賴性最初是在19世紀的蠑螈肢體再生中被發(fā)現(xiàn)的。直至近年以來，研究者才逐漸關注周圍神經對腫瘤的調控作用，并有一系列的研究在不同的惡性腫瘤中均有重要發(fā)現(xiàn)。其中，m受體作為周圍神經所分泌的神經遞質的重要受體之一，其致癌潛能在前列腺癌中就有分析報道[4]。隨著研究的深入，m1受體被證實可誘導前列腺癌細胞的擴散[5]，并且通過使用這些受體的激動劑也有了更進一步的研究結果。有學者選擇m受體卡巴膽堿來進行研究。卡巴膽堿又名氯化氨甲酸膽堿，為乙酰膽堿的類似物，是一種非選擇性膽堿能受體激動劑，它可以通過與m受體相互作用而發(fā)揮相應的生理生化作用。研究結果發(fā)現(xiàn)，使用卡巴膽堿激活m受體后可通過FAK-YAP信號軸驅動去勢抵抗性前列腺癌的腫瘤細胞的生長[6]。然而，在不同的腫瘤類型中，m受體及其亞型的作用卻不盡相同。研究[7-8]顯示，在胰腺導管腺癌和乳腺癌中，m1受體發(fā)揮了抑制腫瘤生長的作用。

本研究首先通過查詢TCGA數據庫和RT-qPCR實驗確定了與正常細胞相比，人OSCC細胞系中有毒蕈堿受體，特別是m3受體高表達。利用非選擇性m受體激動劑卡巴膽堿進行CCK8細胞增殖及Transwell細胞侵襲實驗分析，發(fā)現(xiàn)隨著卡巴膽堿濃度的增高，促進增殖及侵襲的作用越強。為進一步探究其作用機制，發(fā)現(xiàn)YAP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，YAP蛋白作為Hippo信號通路中關鍵因子在調控癌細胞增殖和抑制細胞凋亡中起著十分重要的作用[9]。基于此，猜測m受體對此信號通路是否也會產生激活作用，結果發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿處理細胞后誘導了細胞內YAP核轉位，具體來說，鑒于S127位點的磷酸化狀態(tài)是調控YAP進出核的主要因素[10]，YAP的升高和p-YAP（S127）的降低揭示原本在細胞質內分布較多的YAP通過去磷酸化進入細胞核，從而誘導細胞的增殖和侵襲。然而，由于癌癥的發(fā)生過程不僅僅是單一的信號通路，m受體對OSCC的作用效果及其他作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，m受體亞型在OSCC細胞中呈明顯的差異表達且與預后相關，使用m受體激動劑卡巴膽堿可通過激活YAP從而誘導OSCC細胞的增殖與侵襲。然而，各項基礎研究針對m受體對腫瘤的作用尚無定論，不同類型的腫瘤與m受體的相互作用并非一致，可能是由于配體與不同受體亞型結合后會激活不同的信號通路，導致不同的生物學效應。因此，未來的研究中需要結合腫瘤細胞的不同分子亞型來進一步評估m(xù)受體的作用。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。