糞便硫酸類肝素蛋白多糖2與分泌型卷曲相關(guān)蛋白2基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌篩查中的應用價值

張利偉，胡海燕

(1.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001；2.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)屬于臨床上較為常見的消化系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)所有惡性腫瘤中位居第三，且每年約有130多萬新增病例，更有69萬人因CRC死亡[1-3]。隨著近年來人們生活方式的日益變化及人口老齡化問題的逐漸嚴重，CRC發(fā)病人數(shù)逐漸增加，且發(fā)病年齡逐漸減小，已受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[4]。由于該病發(fā)病早期具有極強的隱匿性，一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時機，因此預后較差[5]。早期準確診斷CRC對臨床治療及預后具有極其重要的現(xiàn)實意義。既往臨床上主要通過腸鏡、糞便隱血試驗以及血清腫瘤標志物等進行CRC的診斷，但均有一定的臨床局限性[6]。有研究[7-8]表明，糞便中分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(Secreted frizzled related protein 2，SFRP2)基因甲基化是一種潛在的CRC篩查的非侵入性生物標志物，糞便硫酸類肝素蛋白多糖2(Syndecan-2，SDC2)基因甲基化檢測也可作為大腸癌早期篩查的無創(chuàng)診斷方法。鑒于此，本研究分析糞便SDC2聯(lián)合SFRP2基因甲基化檢測在CRC篩查中的應用價值，為臨床診斷提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至2021年9月在齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科或消化內(nèi)科接受診治的CRC患者51例為CRC組，其中男性27例，女性24例；年齡34～78歲，平均(55.23±10.38)歲；近端17例，遠端34例；腫瘤直徑11～48 mm，平均(31.23±5.32)mm；TNM分期中，Ⅰ-Ⅱ期21例，Ⅲ-Ⅳ期30例；低分化15例，中高分化36例。選取同期進展期腺瘤患者61例為進展期腺瘤組，其中男性34例，女性27例；年齡32～79歲，平均(55.34±10.45)歲。選取同期健康體檢者50例為正常對照組，其中男性26例，女性24例；年齡31～78歲，平均(55.21±10.38)歲。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。病例納入標準[9]：所有CRC及進展期腺瘤患者均經(jīng)病理檢查確診；入組前尚未接受相關(guān)治療；均為成年人。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；伴有重要臟器嚴重病變者；)意識障礙或合并精神疾病者；研究期間因故退出或失訪者。入組研究對象均于同意書上簽名。醫(yī)院倫理委員會已批準本研究。

1.2 研究方法 首先采集所有受試者的新鮮糞便2～5 g，分別置于兩管之中，一管為干燥采樣管，另一管為裝有15 ml糞便保存液的采樣管，充分混勻。保存于常溫條件下，3 d內(nèi)完成相關(guān)處理。遵循QIAamp DNA Stool Mini Kit(批號：51504，德國QIAGEN公司)說明書完成標本DNA提取。隨后，根據(jù)說明書完成糞便DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化操作。最后采用實時熒光定量PCR法完成SDC2、SFRP2基因甲基化的檢測。反應體系35 μl，組成如下：17.5 μl PCR反應預混試劑，2.5 μl反應液，15 μl重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA。反應液的構(gòu)成包括探針、引物以及ddH2O。且SDC2、SFRP2及內(nèi)參基因(GAPDH)分別有相應反應液。CpGenome Universal Methylated DNA(批號：S7821，德國默克公司)和Unmethylated DNA(批號：S7822，德國默克公司)也經(jīng)亞硫酸化處理，以此作為陽性對照及陰性對照。由Beacon Designer 8完成正、反向引物的設(shè)計與合成。

1.3 觀察指標 比較三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況；分析糞便SDC2及SFRP2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系；分析糞便SDC2及SFRP2甲基化篩查CRC的效能。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理工具選擇SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件。計數(shù)資料以[例(%)]表示，行χ2檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測篩查CRC的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況比較 見表1。CRC組患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于進展期腺瘤組和正常對照組，且進展期腺瘤組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于正常對照組(均P<0.05)。

表1 三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況比較[例(%)]

2.2 糞便SDC2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。TNM分期Ⅲ-Ⅳ期CRC患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者(均P<0.05)。而性別、年齡、病變部位、腫瘤大小以及分化程度均與CRC患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化無相關(guān)性(均P>0.05)。

表2 糞便SDC2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測篩查CRC的效能 見表3。ROC曲線分析顯示，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化單項檢測篩查CRC的效能較高，且兩者聯(lián)合檢測的效能高于單項檢測。

表3 糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測篩查CRC的效能

3 討 論

迄今為止，關(guān)于CRC的具體病因及發(fā)病機制尚存在一定爭議，目前普遍認為可能和遺傳、生活方式以及精神壓力等因素有關(guān)[10-12]。因其發(fā)病早期無特異性癥狀，絕大多數(shù)患者一經(jīng)確診便已是中晚期，臨床治療效果較差，預后不良[13-14]。由此可見，加強對人群CRC的篩查，提高早期腫瘤的檢出率，顯得尤為重要，亦是降低CRC發(fā)病率及改善預后的重中之重。結(jié)腸鏡檢查是得到廣泛認可的篩查CRC金標準，但其屬于有創(chuàng)檢查，且在檢查前需要較為復雜的腸道準備，加之檢查過程中會對患者造成不同程度的痛苦，具有一定的出血或(和)穿孔風險，從而導致患者檢查依從性較低[15-16]。而糞便DNA檢測是近年來所發(fā)展起來的一種早期篩查手段，其主要通過采集糞便中脫落細胞DNA，繼而明確CRC過程中的基因變化，具有無創(chuàng)性、無需腸道準備等優(yōu)勢[17-18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC組患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于良性進展期腺瘤組和正常對照組，且進展期腺瘤組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于正常對照組，這提示了CRC及進展期腺瘤中存在異常的SDC2和SFRP2基因甲基化。究其原因，SDC2基因參與了細胞分裂、遷移等過程，且有研究[19]證實腫瘤組織內(nèi)的SDC2目標區(qū)域甲基化水平明顯高于成對相鄰非腫瘤組織中的SDC2目標區(qū)域，因此該基因甲基化異常可成為CRC早期檢測的腫瘤標志物之一。SFRP2基因定位于染色體4q31.3上，含有2個內(nèi)含子及3個外顯子，且第1外顯子周圍分布高密度CpG島，和腫瘤細胞DNA甲基化息息相關(guān)，是Wnt信號通路的信號拮抗因子，而Wnt信號通路又在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。另外，本研究結(jié)果還顯示了TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期CRC患者糞便SDC2、SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者，這反映了糞便SDC2、SFRP2基因甲基化和CRC患者臨床分期密切相關(guān)，即隨著上述基因甲基化的發(fā)生，CRC患者病情加劇，兩者具有作為評估CRC患者病情嚴重程度的潛在價值。分析其原因，可能是上述兩項基因甲基化頻繁發(fā)生于CRC中，在腫瘤的分化、繁殖過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，多項研究[20-22]發(fā)現(xiàn)，糞便基因SDC2基因甲基化和CRC患者TNM分期無關(guān)，本研究結(jié)果與其不一致，其原因可能與研究樣本量、基因組DNA來源不同有關(guān)。此外，經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化單項檢測篩查CRC的效能較高，且兩者聯(lián)合檢測的效能高于單項檢測，與柏愚等[23]研究結(jié)果一致。究其原因，雙基因聯(lián)合檢測可覆蓋多種腫瘤形成的分子途徑，進一步為臨床診斷提供更為全面、可靠的數(shù)據(jù)，繼而達到提高檢測靈敏度及特異度的目的。

綜上所述，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測有助于篩查CRC，具有較高的臨床推廣應用價值。