醫(yī)院研究生RT-PCR技術(shù)的“三步法”科研帶教

羅 淵 梅竹松 郭丙乾 房龍梅 王廣云

解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心研究部臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142

綜合醫(yī)院都建有科研實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)集中管理大型儀器設(shè)備，達(dá)到資源共享，提高硬件使用效率和科研效益，并為醫(yī)院醫(yī)療、教學(xué)和科研提供基礎(chǔ)平臺(tái)[1-2]，這也是醫(yī)院研究生開展課題工作的主要場(chǎng)所。隨著研究生招收規(guī)模的逐年擴(kuò)大和研究型醫(yī)院的加速轉(zhuǎn)型[3-4]，在實(shí)驗(yàn)室開展課題工作的研究生數(shù)量也日益增加。因此，如何提高科研帶教質(zhì)量和效果是擺在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室?guī)Ы汤蠋熋媲暗囊坏镭巾毥鉀Q的難題。本文以目前最常用的分子生物學(xué)技術(shù)—實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)為例，結(jié)合醫(yī)院研究生的培養(yǎng)目標(biāo)和特點(diǎn)，在本實(shí)驗(yàn)室多年科研帶教經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，深入探討涵蓋“感性認(rèn)識(shí)、理性認(rèn)識(shí)和深刻認(rèn)識(shí)”的“三步法”科研帶教模式。

1 醫(yī)院研究生RT-PCR技術(shù)科研帶教過(guò)程中的主要問(wèn)題

醫(yī)院招收的研究生大都來(lái)自醫(yī)學(xué)院校的臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，雖然在本科階段的課程中已學(xué)過(guò)RTPCR技術(shù)，但他們掌握知識(shí)的情況參差不齊，尤其因?yàn)槿狈?shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，易產(chǎn)生畏難情緒。而且，研究生學(xué)習(xí)科研技能主要是跟著實(shí)驗(yàn)室老師學(xué)習(xí)，或者自己查閱工具書，又或是求助相關(guān)的網(wǎng)站，并且還需要自己反復(fù)消化才能吸收，整個(gè)過(guò)程不但耗時(shí)、費(fèi)力，而且效率低。

以上問(wèn)題導(dǎo)致醫(yī)院研究生的RT-PCR技術(shù)實(shí)踐能力整體偏弱，尤其是分析和處理實(shí)際問(wèn)題的能力不足[5]?；诖耍诙嗄陰Ы坦ぷ鞯膶?shí)踐基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)性地構(gòu)建“三步法”科研帶教模式。

2 “三步法”科研帶教模式的目的與總體設(shè)計(jì)思路

2.1 目的

針對(duì)醫(yī)院培養(yǎng)研究生的特點(diǎn)，通過(guò)總結(jié)本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)的有益做法和經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，并參考相關(guān)單位的情況[6-7]，深入討論醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室在研究生RT-PCR技術(shù)科研帶教中的最佳路徑，希望可以拋磚引玉，給其他實(shí)驗(yàn)室?guī)Ы虃円稽c(diǎn)啟發(fā)，最終讓廣大研究生受益，使他們高效完成課題工作。

2.2 總體設(shè)計(jì)思路

依照循序漸進(jìn)、由淺入深和理論聯(lián)系實(shí)際的總體原則，將醫(yī)院研究生的RT-PCR技術(shù)科研帶教工作凝練為“三步法”科研帶教模式。第一步是最初的感性認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段，從PCR技術(shù)發(fā)展的角度增加對(duì)RT-PCR技術(shù)的整體認(rèn)識(shí)；第二步是理性認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段，即在RT-PCR技術(shù)全流程帶教的基礎(chǔ)上，使其熟悉引物的設(shè)計(jì)原則和驗(yàn)證方法，并掌握基因表達(dá)的相對(duì)定量分析；第三步是深刻認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段，即經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的課題工作后，使其不但可熟練運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，而且即使遇到復(fù)雜疑難問(wèn)題也能獨(dú)立分析并盡力解決。

3 “三步法”科研帶教模式的主要內(nèi)容

3.1 感性認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段

自1985年美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）以來(lái)[8]，PCR的發(fā)展和應(yīng)用日新月異[9]?？傮w而言，PCR技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)主要階段：一是基于瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果的普通PCR技術(shù)，可進(jìn)行定性或半定量的分析；二是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的RT-PCR技術(shù)，通過(guò)引入雙鏈核酸特異染料（如SYBR Green等）或熒光探針（如TaqMan MGB等）而實(shí)現(xiàn)定性分析、相對(duì)定量或“絕對(duì)”定量[10]；三是基于微滴化反應(yīng)的數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)[11]，不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線即可通過(guò)泊松分布的統(tǒng)計(jì)處理而直接得出初始核酸的拷貝數(shù)。然而，無(wú)論何種PCR技術(shù)，其內(nèi)在的基本原理都是大致一樣的，只不過(guò)不同PCR技術(shù)有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和側(cè)重點(diǎn)[12-14]。

假設(shè)PCR的擴(kuò)增效率為e，可推導(dǎo)出循環(huán)閾值（Ct）與初始模板量的對(duì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系，其斜率為-1/log（1+e）。在理想狀態(tài)下，PCR擴(kuò)增效率為1，則該斜率為-3.322[15]。在有多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各自反應(yīng)的Ct值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行RT-PCR后也可得出相應(yīng)的Ct值，從而可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

3.2 理性認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段

與普通PCR一樣，引物設(shè)計(jì)也是RT-PCR反應(yīng)的關(guān)鍵所在[16-17]。引物可自行設(shè)計(jì)，也可直接引用相關(guān)引物數(shù)據(jù)庫(kù)中的成熟引物，還可參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中的引物序列。見表1。

表1 RT-PCR引物的主要來(lái)源

引物合成前需在NCBI Blast上進(jìn)行檢索比對(duì)，以分析其擴(kuò)增特異性；合成后仍需開展預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)引物的擴(kuò)增特異性和有效性進(jìn)行驗(yàn)證。定性分析時(shí)，只要在擴(kuò)增結(jié)束前出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線和Ct值，且在排除非特異性擴(kuò)增后即可認(rèn)為是陽(yáng)性。而相對(duì)定量分析則主要是利用2-ΔΔCt法，即對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的樣本同時(shí)檢測(cè)目的基因和一個(gè)表達(dá)相對(duì)恒定的內(nèi)參基因，相當(dāng)于用內(nèi)參基因?qū)Ω鹘M分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后再分析目的基因在組間的相對(duì)表達(dá)變化情況[15]。見圖1。

圖1 SYBR Green RT-PCR相對(duì)定量分析流程圖

3.3 深刻認(rèn)識(shí)培養(yǎng)階段

結(jié)合科研課題工作，進(jìn)行RT-PCR技術(shù)實(shí)際應(yīng)用方面的培訓(xùn)，使研究生能更好地將理論知識(shí)與實(shí)踐應(yīng)用密切結(jié)合，即使遇到問(wèn)題也能深入分析問(wèn)題并積極解決問(wèn)題[18]。

常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin和β2-微球蛋白等，在正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先確認(rèn)該基因的表達(dá)不會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程的影響。同時(shí)，運(yùn)用2-ΔΔCt相對(duì)定量分析是有前提條件的，即目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率必須大致都等于1。如果兩者擴(kuò)增效率不同，則只能重新優(yōu)化反應(yīng)條件或修改引物使擴(kuò)增效率相同后再分析，或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行絕對(duì)定量后再比較。而且，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)，每種實(shí)驗(yàn)干預(yù)都應(yīng)設(shè)置至少3個(gè)獨(dú)立批次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，而且每個(gè)批次實(shí)驗(yàn)中的不同組別也應(yīng)分別設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，并分別提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，稱為生物學(xué)重復(fù)；而每一份核酸樣本也應(yīng)進(jìn)行至少3次重復(fù)的RT-PCR反應(yīng)，稱為技術(shù)重復(fù)。此外，Bustin等學(xué)者[19-20]于2009年提出RT-PCR最低限度標(biāo)準(zhǔn)（minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments，MIQE）指南，用以規(guī)范RT-PCR相關(guān)科研工作發(fā)表文章時(shí)的信息公開。不但能更好地評(píng)估實(shí)驗(yàn)方案的有效性和科學(xué)性，也有利于其他研究者能重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 小結(jié)

從本實(shí)驗(yàn)室多年的科研帶教工作經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，通過(guò)以上三個(gè)階段由淺入深、理論結(jié)合實(shí)際的階梯式帶教，醫(yī)學(xué)研究生動(dòng)手能力的提高都很快，可快速熟練掌握RT-PCR技術(shù)的原理和操作，并能結(jié)合各自的課題方向展開實(shí)際應(yīng)用。還有一點(diǎn)要注意的是研究生剛開始接觸科研工作，對(duì)一些基本的常規(guī)操作尚不熟練，如精密移液器的使用等細(xì)節(jié)問(wèn)題，這也凸顯了技術(shù)重復(fù)的重要性。總體而言，經(jīng)過(guò)扎實(shí)的“三步法”教學(xué)，研究生都能把RT-PCR技術(shù)當(dāng)成基本的科研工具，即使遇到問(wèn)題也能獨(dú)立進(jìn)行分析并解決。隨著RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的不斷標(biāo)準(zhǔn)化和正規(guī)化，該技術(shù)將更加規(guī)范且更具可比性，真正成為醫(yī)學(xué)研究生科研工作的好幫手。