蘋果黃蚜抗藥性快速測定方法初探

封云濤，郭曉君，李 婭，庾 琴，張潤祥

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

蘋果黃蚜（Aphis citricolavan der Goot）又名繡線菊蚜，屬半翅目蚜科，是世界各地蘋果園常發(fā)害蟲之一，在我國分布于北起黑龍江、內(nèi)蒙古，南至廣西、廣東等20 多個(gè)省。該蟲寄主植物有蘋果、桃、梨、山楂、柑橘、繡線菊等多種薔薇科、蕓香科和菊科植物，生產(chǎn)上尤以為害蘋果樹造成經(jīng)濟(jì)損失重大而備受關(guān)注。其主要以成蟲及若蟲群集在寄主嫩葉背面和新梢嫩芽上刺吸汁液，影響光合作用，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致早期落葉、樹勢衰弱及誘發(fā)霉污病[1-2]。目前對蘋果黃蚜的防治仍主要以化學(xué)防治為主，但是長期頻繁不合理用藥，導(dǎo)致蘋果黃蚜對有機(jī)磷類、菊酯類、新煙堿類的多種藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性[3-5]。室內(nèi)生物測定是快速而準(zhǔn)確地獲得某種殺蟲劑對昆蟲毒力大小的手段[6]，通過生物測定可以明確蚜蟲等多種害蟲的抗性水平，為田間合理選藥提供一定依據(jù)。蘋果黃蚜室內(nèi)生物測定常用的方法有點(diǎn)滴法和浸葉法[7-8]，但是這2種方法不僅需要采集大量試蟲，測定時(shí)間至少需要24 h，且浸葉法由于蘋果黃蚜的趨嫩性需要采摘大量無蟲、完好未接觸藥劑的嫩葉，點(diǎn)滴法由于點(diǎn)滴時(shí)操作技術(shù)要求較高，均不適用于蘋果黃蚜的田間抗藥性快速檢測，因此，需要探索更為快速簡便的檢測方法。玻璃管藥膜法是近年興起的一種新型快速的生物測定方法，已經(jīng)報(bào)道用于褐飛虱Nilaparvata和二化螟Chilo suppressalis[9]、煙粉虱Bemisia tabaci[10]、禾谷縊管蚜Rhopalosiphum和麥長管蚜Sitobion avenae[11]、桃蚜Myzus persicae[12]、柑橘木虱Diaphorina citri（Kuwayama）[13]等多種害蟲的抗性水平檢測及快速測定選藥試劑盒的研究。目前防治蚜蟲農(nóng)藥登記產(chǎn)品多達(dá)2 742個(gè)，有效成分主要包括吡蟲啉、啶蟲脒、高效氯氟氰菊酯、噻蟲嗪等[14]，其中，吡蟲啉用于登記防治多種作物上蚜蟲、粉虱、飛虱等刺吸式口器類害蟲，高效氯氟氰菊酯用于防治多種作物上蚜蟲及鱗翅目類害蟲，2 種藥劑均為目前生產(chǎn)上防治蚜蟲的主要藥劑。

為了探索適用于蘋果黃蚜的抗藥性快速測定方法，筆者以玻璃管為載體對吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯進(jìn)行了抗性診斷劑量的研究，以2種藥劑對蘋果黃蚜敏感品系的毒力為基礎(chǔ)，同時(shí)設(shè)置了多個(gè)備選劑量，通過室內(nèi)毒力和防治試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確性測定，并采用不同田間種群進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在為蘋果黃蚜抗藥性的快速評估和科學(xué)選藥提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥劑

97.3%吡蟲啉（Imidacloprid）購自江蘇常隆農(nóng)化有限公司；96.1%高效氯氟氰菊酯（Lambdacyhalothrin）購自江蘇皇馬農(nóng)化有限公司。

1.2 供試種群

蘋果黃蚜相對敏感品系：采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）龍城校區(qū)玻璃溫室紅富士蘋果苗上，未曾施過藥，現(xiàn)采現(xiàn)用。田間種群：于2019—2020年5—7月分別采自山西省運(yùn)城市臨猗縣蘋果園、山西省晉中市太谷縣蘋果園、山東省棲霞市臧家莊鎮(zhèn)蘋果園、陜西省咸陽市禮泉縣蘋果園。

1.3 試驗(yàn)方法

診斷劑量確定及室內(nèi)防治效果試驗(yàn)于2019年5—7 月，田間種群驗(yàn)證試驗(yàn)于2020 年5—7 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲抗藥性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3.1 浸葉法 在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用丙酮將原藥溶解并配制成母液，用蒸餾水將藥劑依次配成5～7 個(gè)濃度梯度。將蘋果幼嫩葉片于藥液中浸泡5 s，用吸水紙吸取多余藥液，挑選個(gè)體一致的健康無翅成蚜放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行飼養(yǎng)，24 h后檢查死蟲數(shù)，用毛筆輕觸蟲體，以不能正常爬行為死亡，每處理重復(fù)4 次，每重復(fù)20～25 頭蟲。根據(jù)Probit 幾率值分析法，計(jì)算毒力回歸方程、LC50值及95%置信限等，對照死亡率控制在10%以下。

1.3.2 玻璃管藥膜法 用微量移液器在長3.8 cm、直徑2 cm 的10 mL 帶蓋玻璃樣品瓶（內(nèi)表面積為27.01 cm2）中加入用200μL 丙酮溶解的藥液，緩慢傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)使藥液在指形管底面及管壁范圍內(nèi)形成均勻藥膜；晾干后每瓶中接入大小一致的蘋果黃蚜25頭，蓋好蓋子；置于溫度（25±1）℃、光周期L∶D＝14 h∶10 h的光照培養(yǎng)箱中，每濃度重復(fù)4次。1 h后調(diào)查蚜蟲死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。對照死亡率在10%以下有效。重復(fù)得到3次毒力測定的穩(wěn)定數(shù)據(jù)后，合并數(shù)據(jù)得到毒力回歸方程。

1.4 抗性診斷劑量的確定

1.4.1 快速診斷劑量的初篩 為了獲得較為準(zhǔn)確的快速診斷劑量，本研究根據(jù)玻璃管藥膜法測定得到的毒力回歸方程，分別計(jì)算 LC90、2×LC90、4×LC90、LC99值和對應(yīng)的理論死亡率，再用這些劑量采用玻璃管藥膜法重新測試敏感品系試蟲的實(shí)際死亡率，分別重復(fù)3次，取平均值，初步篩選出快速診斷劑量。

1.4.2 快速診斷劑量進(jìn)一步篩選 在敏感品系蘋果黃蚜的盆栽蘋果苗上分別噴施吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯藥液，噴施濃度分別為LC90、LC99、2×LC90、4×LC90的劑量，每棵蘋果苗為一個(gè)處理，空白對照蘋果苗同時(shí)噴施清水。處理前調(diào)查蟲口基數(shù)，分別于施藥后連續(xù)3 d 調(diào)查蟲口數(shù)，并計(jì)算防治效果。結(jié)合1.4.1 的試驗(yàn)結(jié)果，選擇理論死亡率與實(shí)際校正死亡率接近，且防治效果優(yōu)異的劑量作為殺蟲劑的抗性診斷劑量。

1.5 診斷劑量田間驗(yàn)證

分別用2 種殺蟲劑的抗性診斷劑量處理蘋果黃蚜敏感品系及4個(gè)田間種群，檢測不同種群試蟲的死亡率，并與浸葉法測得的抗性水平進(jìn)行比較，比較分析2種方法結(jié)果的一致性，以驗(yàn)證診斷劑量的準(zhǔn)確性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Probit幾率值分析法，計(jì)算毒力回歸方程、LC50、LC90、LC99、2×LC90及4×LC90值及95%置信限及卡方等。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯對蘋果黃蚜的抗性診斷劑量

從表1可以看出，2種藥劑的LC50分別為16.22、3.28 ng/cm2。根據(jù)毒力回歸方程得到2 種藥劑的LC90～LC99。其中，吡蟲啉的LC90、2×LC90、4×LC90、LC99分別為193.85、387.71、775.42、1 461.37 ng/cm2；高效氯氟氰菊酯分別為37.25、74.49、148.98、269.09 ng/cm2。由表2可知，采用2種殺蟲劑上述的理論診斷劑量分別處理敏感品系蘋果黃蚜，發(fā)現(xiàn)試蟲的校正死亡率在87.12%～98.80%，說明室內(nèi)蘋果黃蚜敏感品系對2種殺蟲劑敏感性較高，且與理論死亡率（90%～99%）差異均較小，因此，各理論劑量均可作為2種殺蟲劑的抗性診斷劑量。

表1 玻璃管藥膜法測定2種殺蟲劑對蘋果黃蚜敏感品系的毒力Tab.1 The virulence of two insecticides to Aphis citricola susceptible strains determined by residual film method in glass tube

表2 2種殺蟲劑對蘋果黃蚜診斷劑量及校正死亡率Tab.2 Diagnostic doses and corrected mortality of two insecticides to Aphis citricola

2.2 抗性診斷劑量進(jìn)一步確定

2種藥劑各理論診斷劑量對蘋果黃蚜的室內(nèi)防治效果如表3 所示，結(jié)果表明，吡蟲啉4 個(gè)劑量2～3 d 防治效果均能達(dá)到89.2%～100%，因此，吡蟲啉的4 個(gè)理論診斷劑量均可作為抗藥性診斷劑量，考慮田間適用范圍，選擇LC90劑量193.85 ng/cm2作為最終診斷劑量；高效氯氟氰菊酯4×LC90處理2～3 d 防治效果達(dá)90.5%～93.9%，高于其他處理，因此，其劑量148.98 ng/cm2可作為最終診斷劑量。

表3 2種藥劑理論診斷劑量對蘋果黃蚜的室內(nèi)防治效果Tab.3 Laboratory control efficacy of theoretical diagnostic doses of two insecticides to Aphis citricola

2.3 診斷劑量的田間驗(yàn)證

用吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯的診斷劑量分別處理4個(gè)蘋果黃蚜田間種群，結(jié)果表明（表4），吡蟲啉處理后4 個(gè)種群的死亡率分別為山西晉中（89.53%）＞陜西咸陽（73.50%）＞山西運(yùn)城（60.30%）＞山東棲霞（58.22%），死亡率越高，敏感性越高，抗性水平越低，該結(jié)果與浸葉法測得的結(jié)果相一致。高效氯氟氰菊酯診斷劑量處理后死亡率也與相應(yīng)的浸葉法結(jié)果得到了一致的趨勢，表明可以通過2 種藥劑的診斷劑量獲得田間種群的死亡率趨勢，從而快速掌握蘋果黃蚜田間種群的敏感性變化。

表4 蘋果黃蚜田間種群在2種殺蟲劑診斷劑量下的死亡率與浸葉法測定抗性結(jié)果Tab.4 The mortality of Aphis citricola filed populations under the diagnostic doses of two insecticides and resistance determined by leaf dipping method

3 結(jié)論與討論

本研究采用玻璃管藥膜法探索了蘋果黃蚜對殺蟲劑抗藥性的快速測定方法。結(jié)果表明，通過玻璃管藥膜法獲得的抗性快速測定的診斷劑量，可以快速評估蘋果黃蚜田間種群對吡蟲啉和高效氯氟氰菊酯抗藥性。

殺蟲劑抗性測定方法主要有生物測定法和分子生物學(xué)法[15]，其中生物測定法為傳統(tǒng)方法，應(yīng)用比較廣泛。玻璃管藥膜法屬于生物測定方法之一，該方法適用于具有觸殺活性藥劑的毒力測定，害蟲接觸藥膜一定時(shí)間后，通過計(jì)算死亡率評估抗性，操作快捷簡單，結(jié)果直觀，重復(fù)性強(qiáng)。

田間害蟲由于施藥背景復(fù)雜而往往具有多抗性，做到精確的抗性評估是比較困難的，抗性快速測定的目的是為了了解害蟲田間種群的整體抗性程度和藥劑的適合度，進(jìn)行快速有效預(yù)判，以更好的指導(dǎo)田間用藥，為抗性治理提供技術(shù)支撐。