糙皮側(cè)耳對培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素的降解研究

劉 芹,胡素娟,崔 筱,康源春,張玉亭,孔維麗

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

我國是農(nóng)業(yè)大國，秸稈資源豐富，對秸稈的綜合利用有利于減少農(nóng)村面源污染，促進(jìn)社會可持續(xù)發(fā)展［1］。秸稈的主要成分是木質(zhì)纖維素（纖維素、木質(zhì)素、半纖維素），其結(jié)構(gòu)復(fù)雜堅固，難以破壞，傳統(tǒng)的化學(xué)處理工藝復(fù)雜且易造成環(huán)境污染［2］。利用農(nóng)作物秸稈培養(yǎng)食用菌，不僅可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)林副產(chǎn)物的無害化、減量化、資源化利用，還可以收獲優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

玉米產(chǎn)量在我國糧食作物中居第3位，僅次于稻、麥，該作物主要分布于黃淮海、東北和西南山區(qū)。玉米芯約占玉米產(chǎn)量的21%，是一種產(chǎn)量巨大的農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣泛，價廉易得［3］。目前，玉米芯除少部分用于制備糠醛、木糖醇外，絕大部分被直接燃燒或隨意堆置，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。玉米芯組織均勻、硬度適宜、吸水性強(qiáng)，可用于黑木耳、雙孢蘑菇、糙皮側(cè)耳、杏鮑菇等食用菌的栽培［2-4］。糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）年產(chǎn)量居世界食用菌產(chǎn)量的前列［5］，具有豐富的營養(yǎng)（如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素），顯著的抗氧化、抗病毒、提高免疫力等生物活性，深受消費(fèi)者的青睞［6］。糙皮側(cè)耳易于栽培，可以在各種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物（玉米芯、秸稈、稻草等）上生長，其年產(chǎn)量在世界范圍內(nèi)持續(xù)快速增長［2］。在生長發(fā)育過程中，糙皮側(cè)耳可以通過分泌多種胞外酶如纖維素酶、木聚糖酶、漆酶等將培養(yǎng)料中的木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解，使其變成相對簡單的營養(yǎng)物質(zhì)，以利于糙皮側(cè)耳的吸收利用［7］。

本研究以玉米芯為主料栽培糙皮側(cè)耳，檢測了糙皮側(cè)耳在不同生長期間對培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素的降解以及相關(guān)降解酶的活性變化，并采用掃描和透射電子顯微鏡對培養(yǎng)料的微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了觀察，旨在為研究糙皮側(cè)耳的營養(yǎng)生理，以及提高培養(yǎng)料的利用率、減少農(nóng)業(yè)面源污染提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）由河南省食用菌種質(zhì)資源庫提供。

1.2 培養(yǎng)料配方

玉米芯84%，麩皮10%，石灰5%，尿素1%，含水量68%。

1.3 試劑與儀器

玉米芯、麩皮、石灰、尿素購自本地農(nóng)貿(mào)市場；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、樺木木聚糖、ABTS和藜蘆醇購自美國Sigma公司；檸檬酸、硫酸錳、DNS試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。BSA124S-CW天平（美國Sartorius公司）、D3024R高速冷凍離心機(jī)（美國Scilogex公司）、高速組織搗碎機(jī)（美國Cole-Parmer公司）、普析GWB-1純水儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、PS-60AL超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（龍口市先科儀器公司）、UV-2550紫外-可見分光光度儀（美國Lab Tech公司）。

1.4 糙皮側(cè)耳的栽培和取樣

根據(jù)以往的報道［8－9］，制備糙皮側(cè)耳栽培用的發(fā)酵培養(yǎng)料。按照河南省地方標(biāo)準(zhǔn)《平菇發(fā)酵料栽培技術(shù)規(guī)程》（DB 41/T 1211─2016）進(jìn)行糙皮側(cè)耳的栽培。分別在糙皮側(cè)耳菌絲萌發(fā)（T1）、發(fā)菌中期（T2）、發(fā)菌末期（T3）、現(xiàn)蕾期（T4）、子實(shí)體采收（T5，子實(shí)體七成熟）5個時期進(jìn)行取樣。在每個生長時期各隨機(jī)選取9個不同的栽培袋，將其中的培養(yǎng)料揉碎，混合均勻后作為1個代表性的樣品，每個時期設(shè)3個重復(fù)。

1.5 培養(yǎng)料木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量的測定

取在50 ℃下烘干的培養(yǎng)料樣品，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3494─2019《農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測定》進(jìn)行木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量的測定。

1.6 培養(yǎng)料木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的結(jié)構(gòu)表征

1.6.1 培養(yǎng)料木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的單糖組成分析 根據(jù)張瑞［10］的方法進(jìn)行木質(zhì)素、纖維素、半纖維素組分的分離和提取，各組分的單糖組成分析通過裝備有Dionex ICS-5000 HPIC系統(tǒng)的離子交換層析儀進(jìn)行［11］。對樣品（5.0 mg）采用2 mol/L的三氟乙酸在110 ℃下水解4 h，用甲醇去除三氟乙酸后，將水解產(chǎn)物溶于蒸餾水中；然后以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集水解液，經(jīng)0.22 μm尼 龍 膜（MSI， Westborough， MA， USA）過濾后進(jìn)樣。進(jìn)樣體積10 μL，進(jìn)樣方式為自動進(jìn)樣。色譜柱為Dionex CarboPac PA-200陰離子交換柱（3 mm×250 mm），洗脫液為1 mmol/L NaOH，洗脫速度為0.45 mL/min。柱溫為30 ℃。與L-阿拉伯糖（Ara）、D-半乳糖（Gal）、D-葡萄糖（Glu）、D-木糖（Xyl）、D-甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（Glua）和半乳糖醛酸（Gala）標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間比較進(jìn)行單糖組分鑒定，并根據(jù)各吸收峰的峰面積計算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.6.2 培養(yǎng)料木質(zhì)素、纖維素、半纖維素組分的分子量測定 木質(zhì)素、纖維素、半纖維素分子量分布采用高效凝膠色譜（High performance gel permeation chromatography，HPGPC）進(jìn)行檢測。將樣品上樣到配備有TSK-GEL G3000 SWXL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，柱溫35.0 ℃±0.1 ℃）的Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent， Santa Clara， CA， USA）， 采 用0.05 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.7，加0.05% NaN3）洗脫，流速為0.5 mL/min，洗脫峰采用示差折光檢測器檢測。參試樣品的分子量根據(jù)多糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量（738、5800、1.22×104、2.37×104、4.80×104、1.00×105、1.86×105、3.80×105和8.53×105Da）和保留時間進(jìn)行計算［12］。

1.7 木質(zhì)纖維素酶活力的檢測

1.7.1 粗酶液的制備 稱取培養(yǎng)料樣品10 g，加入5倍體積的蒸餾水，冰浴抽提2 h后進(jìn)行勻漿，在4℃下以10000 r/min離心15 min，收集上清液作為粗酶樣品，用于酶活力的測定。

1.7.2 木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）活性的測定 在0.4 mL酶液中加入0.2 mL 10 mmol/L藜蘆醇溶液、0.4 mL 0.25 mol/L酒石酸緩沖液（pH值3.0），混勻，加入20 μL 20 mmol/L H2O2溶液，然后啟動反應(yīng)，以未加H2O2溶液的反應(yīng)體系為對照，檢測在波長310 nm處5 min前后反應(yīng)液吸光值的變化［13］。將酶活力單位（U）定義為每分鐘每毫升反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化1 μmol藜蘆醇所需的酶量。

1.7.3 錳過氧化物酶（MnP）活性的測定 在0.2 mL酶液中加入0.8 mL 10 mmol/L MnSO4溶液，混勻，再加入20 μL 20 mmol/L H2O2溶液，然后啟動反應(yīng)，以未加H2O2溶液的反應(yīng)體系為對照，檢測在波長290 nm處5 min前后反應(yīng)液吸光值的變化［14］。將酶活力單位（U）定義為每分鐘每毫升反應(yīng)體系中將1 μmol Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需要的酶量。

1.7.4 漆酶（Laccase）活性的測定 在10 μL酶液中加入190 μL 1 mmol/L ABTS溶液（pH值4.6），在30 ℃下反應(yīng)10 min；再加入300 μL 5%三氯乙酸終止反應(yīng)，測定在波長405 nm處的吸光值［15］。對照組采用10 μL加熱失活的酶液，其余條件相同。將酶活力單位（U）定義為每分鐘每毫升反應(yīng)體系產(chǎn)生1個吸光值所需要的酶量。

1.7.5 木聚糖酶（Xylanase）活性的測定 在1 mL酶液中加入1 mL 1%的木聚糖溶液，在50 ℃下反應(yīng)10 min；再加入2 mL DNS試劑，沸水浴10 min；取出立即冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，測定波長520 nm處的吸光值［16］。還原糖含量根據(jù)木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。將酶活力單位（U）定義為每分鐘每毫升反應(yīng)體系產(chǎn)生1 μmol木糖所需要的酶量。

1.7.6 纖維素酶（Cellulase）活性的測定 在0.25 mL酶液中加入0.75 mL 1%的CMC-Na溶液，在50 ℃下反應(yīng)10 min；再加入0.75 mL DNS試劑，沸水浴10 min；取出立即冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，測定波長520 nm處的吸光值［17］。還原糖含量根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。將酶活力單位（U）定義為每分鐘每毫升反應(yīng)體系產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.8 電鏡觀察分析

1.8.1 掃描電鏡分析 取材固定：隨機(jī)選取培養(yǎng)料中的玉米芯顆粒，切取組織面積不超過3 mm2，迅速投入電鏡固定液固定。將固定好的樣品采用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）漂洗4次，每次20 min。在用1%鋨酸后固定2 h后，再用雙蒸水漂洗樣品2次，每次15 min。將樣品采用不同濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%）的乙醇進(jìn)行逐級脫水，每次15 min；再用乙酸異戊酯脫水15 min。樣品經(jīng)二氧化碳臨界點(diǎn)干燥、噴金后，用Hitachi S3000 N掃描電子顯微鏡（日本經(jīng)營電子電氣公司）觀察采圖［5］。

1.8.2 透射電鏡分析 后固定：將1.8.1節(jié)中固定好的樣品放入用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）配制的1%鋨酸中在避光、室溫下進(jìn)行后固定7 h。經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后，將樣品用不同濃度（30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%）的 乙 醇 進(jìn)行逐級脫水，每次1.0 h；然后用無水乙醇∶丙酮=3∶1的混合液脫水0.5 h；用無水乙醇∶丙酮=1∶1脫水0.5 h；用無水乙醇∶丙酮=1∶3脫水0.5 h；最后用丙酮脫水1.0 h。滲透包埋：先用丙酮∶812包埋劑=3∶1在37 ℃下包埋2~4 h；用丙酮∶812包埋劑=1∶1在37 ℃下滲透過夜；再用丙酮∶812包埋劑=1∶3在37 ℃下包埋2~4 h；最后用純812包埋劑在37 ℃下包埋5~8 h；將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后于37 ℃烤箱過夜。聚合：將包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。超薄切片：將樹脂塊于超薄切片機(jī)上進(jìn)行超薄（60~80 nm）切片，用150目方華膜銅網(wǎng)撈片。染色：將銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液中避光染色8 min；用70%酒精清洗3次；用超純水清洗3次；用2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；最后用超純水清洗3次，用濾紙稍吸干。將銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)在室溫下干燥過夜［5］。在Hitachi H-7500透射電子顯微鏡（日本經(jīng)營電子電氣公司）下觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用IBM SPSS統(tǒng)計軟件（Version 20； IBM Institute， Armonk， New York， USA）進(jìn)行單因素方差分析， P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的變化

分別對糙皮側(cè)耳菌絲萌發(fā)（T1）、發(fā)菌中期（T2）、發(fā)菌末期（T3）、現(xiàn)蕾（T4）、子實(shí)體采收（T5）5個階段糙皮側(cè)耳培養(yǎng)料中的木質(zhì)纖維素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。隨著糙皮側(cè)耳的生長，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量均顯著降低，從T1到T5，三者的含量分別下降了9.21%、21.25%和3.95%，半纖維素含量的下降趨勢最為明顯。

圖1 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的變化

2.2 培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素降解酶活性的變化

如圖2所示，在糙皮側(cè)耳生長前期，培養(yǎng)料中的纖維素酶活性較低；但隨著糙皮側(cè)耳的生長，培養(yǎng)料中的纖維素酶活性不斷增加，且在子實(shí)體采收期（T5）達(dá)到高峰（3.37 U/mL）。與纖維素酶活性的變化趨勢相似，隨著糙皮側(cè)耳的生長，培養(yǎng)料中的木聚糖酶活性不斷增加，并在采收期（T5）達(dá)到高峰（4.17 U/mL）。但是，隨著糙皮側(cè)耳的生長，培養(yǎng)料中漆酶活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，在發(fā)菌末期（T3）達(dá)到峰值（3.38 U/mL），此后呈不斷下降的趨勢。培養(yǎng)料中的MnP活性變化與漆酶類似，隨糙皮側(cè)耳的生長而不斷增加，并在發(fā)菌末期（T3）達(dá)到最高值（1.62 U/mL）。培養(yǎng)料中的LiP活性較低，與菌絲萌發(fā)期（T1）相比，LiP的活性在發(fā)菌中期（T2）時上升，隨后逐漸下降，但在采收期（T5）又有所增加。

圖2 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素降解酶活性的變化

2.3 培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分的結(jié)構(gòu)表征

表1~表3顯示了在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分中單糖的組成變化。結(jié)果表明，纖維素中的單糖主要是Glu，還有微量的Xyl、Man、Gal和Ara，這可能是由于該分離提取的纖維素含有微量的半纖維素。纖維素中的Glu含量隨糙皮側(cè)耳的生長而逐漸降低（81.06%~73.60%）。半纖維素中的主要單糖是Xyl（64.30%~73.21%）和Ara（11.02%~14.70%），且 兩者的含量均在采收期（T5）最低。在糙皮側(cè)耳5個生長時期的培養(yǎng)料木質(zhì)素中均檢測到Glu和Xyl，在現(xiàn)蕾期（T4）兩者的含量最高，而且與其他4個時期相比，在現(xiàn)蕾期（T4）和子實(shí)體采收期（T5）的木質(zhì)素中新出現(xiàn)了Ara和Gal這2種單糖。

表1 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中纖維素組分的單糖含量 %

表2 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中半纖維素組分的單糖含量 %

表3 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中木質(zhì)素組分的單糖含量 %

從培養(yǎng)料中提取的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分的分子量分布變化如表4~表6所示。纖維素Mn的變化表現(xiàn)為T4＞T1＞T2＞T3＞T5，Mw表 現(xiàn)為T1＞T2＞T4＞T3＞T5，D表現(xiàn)為T1＞T2＞T3＞T4＞T5；半纖維素Mn的變化表現(xiàn)為T1＞T2＞T4＞T3＞T5，即隨著糙皮側(cè)耳的生長而不斷下降，Mw表現(xiàn)為T2＞T1＞T4＞T3＞T5，D表現(xiàn)為T5＞T4＞T2＞T3＞T1；纖維素和半纖維素的Mn和Mw均在子實(shí)體采收期最低。木質(zhì)素的Mn變化表現(xiàn)為T4＞T1＞T5＞T2＞T3，Mw表現(xiàn)為T4＞T5＞T1＞T2＞T3，均在菌絲生長期（T2和T3）最低，在現(xiàn)蕾期（T4）最高。

表4 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中纖維素組分的重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）和分散度（D）

表5 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中半纖維素組分的重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）和分散度（D）

表6 在糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中木質(zhì)素的重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）和分散度（D）

2.4 掃描電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察在糙皮側(cè)耳生長過程中培養(yǎng)料中玉米芯組織的縱切面（圖3a~圖3j）和橫切面（圖3k~圖3t）的形態(tài)學(xué)變化。從中可以看出，在糙皮側(cè)耳菌絲剛萌發(fā)（T1）時，玉米芯維管集聚，其橫截面呈不規(guī)則圓形且結(jié)構(gòu)清晰，維管內(nèi)由上至下布滿微孔（圖3a、圖3b）；管徑較粗且厚實(shí)，纖維表面光滑，管與管之間相切排列，界限清晰，結(jié)構(gòu)緊密（圖3k、圖3l）。這些維管的結(jié)構(gòu)特征有利于植物對空氣、水分和養(yǎng)分的吸收及交換利用。隨著糙皮側(cè)耳的生長，玉米芯維管明顯變得表面粗糙、孔洞多、結(jié)構(gòu)疏松、質(zhì)地松散，并且其中的糙皮側(cè)耳菌絲明顯增多（圖3c~圖3j和圖3m~圖3t）。尤其是在糙皮側(cè)耳子實(shí)體采收期（T5），玉米芯的維管遭到明顯腐蝕和破壞，其橫切面的圓形管壁變薄甚至塌陷，壁上微孔無法辨識（圖3i、圖3j）；管徑變細(xì)，相互交錯且界限模糊，維管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，且中間布滿了糙皮側(cè)耳菌絲（圖3s、圖3t）。這可能是由于糙皮側(cè)耳菌絲將維管壁上的木質(zhì)纖維素降解并吸收利用，從而導(dǎo)致維管結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞。

圖3 掃描電鏡觀察糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中玉米芯的顯微形態(tài)學(xué)變化

2.5 透射電鏡觀察

采用透射電鏡觀察糙皮側(cè)耳生長過程中玉米芯組織的超微結(jié)構(gòu)變化。從圖4a~圖4c可以看出，糙皮側(cè)耳菌絲剛萌發(fā)時（T1）培養(yǎng)料中的玉米芯細(xì)胞形狀規(guī)則，排列緊密；細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為完整，表面平滑。隨著糙皮側(cè)耳菌絲的生長，玉米芯細(xì)胞形狀逐漸變得無規(guī)則，甚至完全被破壞（圖4d~圖4l）。圖中淺色部分為發(fā)生降解的細(xì)胞壁，深色部分是未降解的細(xì)胞壁。隨著糙皮側(cè)耳的生長，玉米芯細(xì)胞壁逐漸透明或消失，說明其結(jié)構(gòu)明顯被降解并出現(xiàn)斷裂。從圖4h、圖4i可以看出，糙皮側(cè)耳菌絲可以進(jìn)入細(xì)胞壁的內(nèi)部，進(jìn)而降解其中的物質(zhì)。這可能是因?yàn)椴谄?cè)耳菌絲優(yōu)先分泌的木質(zhì)素降解酶（漆酶、MnP）降解了玉米芯細(xì)胞壁上的木質(zhì)素，引起其結(jié)構(gòu)的破壞，從而使得糙皮側(cè)耳菌絲可以進(jìn)入到細(xì)胞壁內(nèi)部，通過分泌纖維素酶和木聚糖酶使其中的纖維素和半纖維素發(fā)生降解并開始被菌體利用。尤其是在糙皮側(cè)耳子實(shí)體采收期（T5），玉米芯內(nèi)集聚了大量的糙皮側(cè)耳菌絲，細(xì)胞之間結(jié)合松弛且排列紊亂，骨架結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞（圖4m~圖4o）。

圖4 透射電鏡觀察糙皮側(cè)耳不同生長時期培養(yǎng)料中玉米芯的超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論與結(jié)論

糙皮側(cè)耳適應(yīng)性強(qiáng)，可以廣泛利用農(nóng)林副產(chǎn)物（木屑、玉米芯、麥麩和甘蔗渣等）作為培養(yǎng)料進(jìn)行人工栽培［2］。糙皮側(cè)耳作為木腐型真菌，可以分泌木質(zhì)纖維素降解酶（Cellulase、Xylanase、Laccase、MnP和LiP等）來降解培養(yǎng)料中的木質(zhì)纖維素（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素），以獲取生長所需的碳源［18-19］。因此，隨著糙皮側(cè)耳的生長，培養(yǎng)料中纖維素和半纖維素的比例顯著降低，尤其是在采收子實(shí)體時，其降解程度分別達(dá)到9.21%和21.25%。纖維素和半纖維素在相關(guān)的降解酶的作用下轉(zhuǎn)化為小分子糖，可以為糙皮側(cè)耳菌絲和子實(shí)體的生長提供碳源［20］。與半纖維素和纖維素相比，木質(zhì)素含量的降低程度較低（3.95%），類似的結(jié)果也出現(xiàn)在白靈側(cè)耳（Pleurotus tuoliensis）［20］和鳳尾菇（Pleurotus pulmonarius）［21］的栽培上。這一現(xiàn)象可以通過白腐真菌對木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解特性來解釋。植物組織的纖維素和半纖維素被木質(zhì)素緊密包圍，形成一種天然的抗降解的屏障，起到保護(hù)纖維素和半纖維素的作用，使其不易被微生物破壞［22］。即使少量木質(zhì)素被降解，纖維素和半纖維素的可接觸性也大大提高，有利于發(fā)生進(jìn)一步的酶解和脫聚，因此纖維素和半纖維素的降解程度較高［23］。HPAEC-PAD的檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)料中的纖維素主要是由Glu組成的，半纖維素主要是由Xyl和Ara組成的，隨著糙皮側(cè)耳的生長，纖維素中的Glu含量以及半纖維素中的Xyl含量逐漸降低，并且在子實(shí)體采收期達(dá)到最低值。同時纖維素和半纖維素的分子量也在子實(shí)體采收期最小，這進(jìn)一步說明糙皮側(cè)耳對兩者進(jìn)行了顯著降解。而木質(zhì)素的單糖主要是由Glu和Xyl組成的，且其含量在現(xiàn)蕾期達(dá)到峰值，說明在這個時期木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了某種顯著的變化。而各組分的總含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于100%，是因?yàn)樵谀举|(zhì)素的結(jié)構(gòu)中糖單元的含量較苯丙烷結(jié)構(gòu)低得多，而HPAEC-PAD檢測只能對其中的糖單元進(jìn)行測定。同時木質(zhì)素的分子量在發(fā)菌期間較低，在現(xiàn)蕾期最大，其可能的原因是糙皮側(cè)耳在發(fā)菌過程中菌絲大量利用培養(yǎng)料中的木質(zhì)素組分，使得木質(zhì)素發(fā)生部分降解，降解后的木質(zhì)素在現(xiàn)蕾期發(fā)生結(jié)構(gòu)重組，從而導(dǎo)致木質(zhì)素分子量上調(diào)［10］。

糙皮側(cè)耳可以分泌大量的氧化酶和水解酶如Cellulase、Xylanase、Laccase、LiP和MnP以 降 解培養(yǎng)料中的大分子物質(zhì)，滿足生長所需，這些酶活性的變化可以反映糙皮側(cè)耳利用木質(zhì)纖維素的規(guī)律。木質(zhì)素降解酶類如漆酶和MnP的活性隨糙皮側(cè)耳生長而快速升高并最先達(dá)到最大值，這表明木質(zhì)素可能較先發(fā)生降解［12］。這一現(xiàn)象在香菇（Lentinula edodes）［24］、巴西蘑菇（Agaricus blazei）［25］、灰樹花（Grifola frondosa）［26］等食用菌上也有發(fā)生。當(dāng)菌絲萌發(fā)時，作為糙皮側(cè)耳主要碳源的纖維素在培養(yǎng)料中的含量為24.32%。因此，較高的纖維素酶活性有利于降解培養(yǎng)料中的纖維素，以提供糙皮側(cè)耳生長所需的碳源。纖維素酶的活性隨糙皮側(cè)耳栽培時間的延長而逐漸升高，并于子實(shí)體采收期達(dá)到最高，說明這一階段培養(yǎng)料中的纖維素大量被降解，這與四孢蘑菇（Agaricus campestris）［27］栽培基質(zhì)的降解特性相似。半纖維素也可以為糙皮側(cè)耳的生長提供一定的碳源，培養(yǎng)料中的半纖維素含量約為14.21%。木聚糖酶是水解半纖維素的主要酶，其活性隨糙皮側(cè)耳的生長而不斷升高，這有利于菌絲細(xì)胞降解培養(yǎng)料中的半纖維素組分，最大程度地利用培養(yǎng)料中的碳源，這與人們對雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）［27］、榆耳（Gloeostereum incarnatum）［24］等食用菌的研究結(jié)果相似。

玉米芯是培養(yǎng)料中的主要成分（84%），其結(jié)構(gòu)的變化可以間接反映栽培糙皮側(cè)耳過程中培養(yǎng)料的結(jié)構(gòu)變化。SEM結(jié)果顯示，栽培糙皮側(cè)耳后玉米芯的結(jié)構(gòu)松散、孔洞較多、表面粗糙，維管部分被消化并出現(xiàn)斷裂，維管之間結(jié)合松弛且排列紊亂。結(jié)合TEM可以發(fā)現(xiàn)，玉米芯細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模糊，其中含有的物質(zhì)（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）逐漸透明或消失。玉米芯微觀結(jié)構(gòu)的變化印證了培養(yǎng)料化學(xué)組分的變化。這說明糙皮側(cè)耳通過分泌各種木質(zhì)纖維素降解酶，大幅降解玉米芯中的木質(zhì)纖維素（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）為小分子物質(zhì)并被自身吸收利用。

根據(jù)以上結(jié)果，筆者推測糙皮側(cè)耳優(yōu)先利用培養(yǎng)料中的葡萄糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，然后分泌木質(zhì)素降解酶（Laccase和MnP）降解培養(yǎng)料中的木質(zhì)素組分，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的被破壞使糙皮側(cè)耳菌絲得以進(jìn)入木質(zhì)纖維素內(nèi)部，并開始分泌Cellulase和Xylanase以降解纖維素和半纖維素，從而滿足其生長所需。

本文對糙皮側(cè)耳生長過程中培養(yǎng)料中木質(zhì)纖維素及相關(guān)降解酶的活性變化進(jìn)行了研究，所獲得的研究結(jié)果可以為提高糙皮側(cè)耳的生產(chǎn)力和培養(yǎng)料的利用率，減少由工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)物造成的潛在環(huán)境污染提供理論支撐。