植物在非生物脅迫下代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究進(jìn)展

張菡倩，秦玉瑩，黃 凱，陳建軍

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201）

0 引言

非生物脅迫是所有不利于植物生長(zhǎng)的非生物條件的總稱，它指與植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育的條件相比，會(huì)破壞植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡現(xiàn)象的條件。如鹽分、紫外線輻射、水分、重金屬、極端溫度等［1］。當(dāng)植物處于逆境條件下，非生物脅迫會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，植物必須根據(jù)當(dāng)前的應(yīng)激條件對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行配置，維持必要的代謝，采用新的穩(wěn)態(tài)來(lái)適應(yīng)逆境［2］。植物對(duì)環(huán)境脅迫的細(xì)胞和分子反應(yīng)已經(jīng)得到了廣泛的研究［3］。理解植物感知環(huán)境信號(hào)并將信號(hào)傳遞給細(xì)胞以產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制，對(duì)生物學(xué)具有基礎(chǔ)的重要性［4］。

植物細(xì)胞產(chǎn)生不同的脅迫誘導(dǎo)的自衛(wèi)機(jī)制，以減少脅迫的影響。這些防御機(jī)制是通過改變基因表達(dá)模式來(lái)發(fā)展的，造成蛋白質(zhì)合成的定性和定量偏差，從而影響某些代謝和防御途徑的調(diào)節(jié)［5］。目前代謝組學(xué)發(fā)展迅速，已經(jīng)被應(yīng)用于植物［6］、動(dòng)物［7］和醫(yī)學(xué)［8］等研究領(lǐng)域。新的代謝分析技術(shù)為生物學(xué)家了解植物在脅迫條件下的防御機(jī)制提供了支撐［9］。代謝組學(xué)技術(shù)目前能夠使用不同的多變量分析，這些分析來(lái)自各種聯(lián)用和色譜發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)，例如氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，或以核磁共振（NMR）為基礎(chǔ)的系統(tǒng)［3］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究對(duì)于理解基因組的功能成分和揭示細(xì)胞的分子組成是必不可少的［10］；轉(zhuǎn)錄組學(xué)是基于DNA微陣列技術(shù)的mRNA表達(dá)水平的高通量測(cè)序技術(shù)［11］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了定性定量分析多種mRNA基因表達(dá)差異的能力［12］。其主要目標(biāo)是精確全面地描述轉(zhuǎn)錄組，包括所有種類轉(zhuǎn)錄本的注釋、基因轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的測(cè)定以及不同條件下每個(gè)轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)水平的量化［13］。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)已廣泛應(yīng)用于植物學(xué)［14］、生物學(xué)［15］和醫(yī)學(xué)［16］等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。

1 代謝組學(xué)

1.1 代謝組學(xué)的概念

代謝組學(xué)（Metabolomics或Metabonomics）是全面了解生物體代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的有力工具，為我們提供了植物關(guān)鍵成分對(duì)非生物脅迫的代謝反應(yīng)的全面概述［17］。代謝組學(xué)可以對(duì)一定時(shí)空下植物的特定組織或細(xì)胞進(jìn)行代謝產(chǎn)物的定性定量分析，可以從宏觀角度研究植物的脅迫機(jī)制，更有利于揭示各種脅迫下植物代謝的復(fù)雜性［18］。

1.2 代謝組學(xué)的技術(shù)平臺(tái)

由于生物體內(nèi)小分子代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性種類繁多，因此至今仍沒有單一的技術(shù)可以對(duì)所有這些分子進(jìn)行鑒定和定量。即使是最全面的方法，也只能檢測(cè)到1 000~2 000個(gè)分子特征［19-20］。代謝組學(xué)的各種檢測(cè)手段通常結(jié)合使用，因?yàn)樗鼈冊(cè)诤艽蟪潭壬吓c每個(gè)獨(dú)立的方法互補(bǔ)，優(yōu)先覆蓋不同類型的代謝物［21］。其常用方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性如表1。

表1 代謝組學(xué)的主要技術(shù)平臺(tái)及其特點(diǎn)［22］

1.3 代謝組學(xué)在植物抗逆性研究中的應(yīng)用

隨著技術(shù)的發(fā)展，各種組學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于植物研究中［23］。長(zhǎng)期以來(lái)，初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是基因和蛋白質(zhì)活性的最終產(chǎn)物，與其他組學(xué)技術(shù)相比，代謝組學(xué)可以更全面地了解代謝網(wǎng)絡(luò)是如何調(diào)控的，可以直接反映出生物體的生理生化功能［24］。目前代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于植物［25］、食品［26］、微生物［27］和醫(yī)學(xué)［28］等相關(guān)領(lǐng)域。

植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖需要陽(yáng)光、氧氣、水分和礦質(zhì)元素等條件，但當(dāng)這些條件超過了植物的需求時(shí)，就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生脅迫，同時(shí)植物也會(huì)對(duì)這些脅迫條件作出相應(yīng)的響應(yīng)，這些響應(yīng)便是植物的抗逆性。Rabara等［29］對(duì)煙草和大豆進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，證明了4-羥基2-酮戊二酸和香豆雌酚分別可以作為茄科植物和豆科植物響應(yīng)干旱脅迫的代謝標(biāo)記物。Yang等［30］對(duì)兩個(gè)品種的大豆進(jìn)行代謝組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)普通野生大豆主要通過刺激檸檬酸循環(huán)從而產(chǎn)生更多的ATP來(lái)忍耐鹽脅迫，而耐鹽性的大豆主要是通過調(diào)控氨基酸和有機(jī)酸的代謝來(lái)產(chǎn)生更多的可溶性物質(zhì)從而忍耐鹽脅迫。Cevallos等［31］通過對(duì)柑橘葉片在患黃龍病和缺鋅條件下的差異代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，柑橘葉片在黃龍病下具有區(qū)別于缺鋅條件下的生物標(biāo)志物，如α-草烯、β-欖香烯、脯氨酸和反-丁香油烴等，這些物質(zhì)可以作為柑橘葉片黃龍病的重要診斷依據(jù)。Wang Y等［32］分別對(duì)鎘、鉛脅迫下的蘿卜根進(jìn)行代謝組學(xué)研究，結(jié)果表明鉛或鎘脅迫會(huì)引起糖、氨基酸和有機(jī)酸等代謝物的改變；通過KEGG對(duì)代謝通路的富集研究表明，在鉛脅迫下碳水化合物代謝、能量代謝和谷胱甘肽代謝發(fā)生了顯著變化，而在鎘脅迫下能量代謝、氨基酸代謝及氧化磷酸化相關(guān)途徑發(fā)生了變化。對(duì)逆境下植物的代謝組學(xué)的研究，擴(kuò)展了植物對(duì)逆境的分子響應(yīng)機(jī)制，有助于進(jìn)一步剖析植物在逆境下的耐受機(jī)制。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的概念

轉(zhuǎn)錄組是生物體及細(xì)胞在特定時(shí)空下完整的RNA轉(zhuǎn)錄本，代表了表型與DNA編碼信息之間的重要聯(lián)系，可以揭示生物過程中的分子機(jī)理［33］。自提出以來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在各學(xué)科研究領(lǐng)域中發(fā)展迅速，如植物育種［34］、食品安全工程［35］、環(huán)境與微生物的相互作用［36］等。轉(zhuǎn)錄組方法對(duì)于理解應(yīng)激響應(yīng)中發(fā)生的分子和細(xì)胞變化非常重要。這些方法主要依靠采用Northern blot / RNA blot和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等傳統(tǒng)方法，可以研究不同組織和細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，而其表達(dá)程度的確認(rèn)可通過定量PCR或?qū)崟r(shí)PCR來(lái)實(shí)現(xiàn)［37］。此外，全基因組表達(dá)譜分析工具，如微陣列分析、下一代測(cè)序和RNA測(cè)序等，在這方面提供了巨大的幫助。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)平臺(tái)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)都是開放平臺(tái)，旨在以高通量、低成本的方式直接對(duì)核酸進(jìn)行測(cè)序［38］。每個(gè)平臺(tái)都采用了不同的方法，但都保持了3個(gè)主要策略：模板準(zhǔn)備、測(cè)序和成像以及序列的對(duì)齊和組裝。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)所用的主要技術(shù)及其特點(diǎn)如表2所示。

表2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要技術(shù)平臺(tái)及其特點(diǎn)

2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物抗逆性中的應(yīng)用

在分子水平上，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)于植物的調(diào)節(jié)過程非常重要，決定了植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)植物的逆境響應(yīng)研究已經(jīng)從表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的適應(yīng)發(fā)展到微觀的內(nèi)在生理適應(yīng)、生理適應(yīng)網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平等分子層面上。目前轉(zhuǎn)錄組被廣泛應(yīng)用在大豆［42］、小麥［43］等糧食作物，草坪草［44］等園藝植物及藥用植物［45］等上。

在非生物脅迫下，植物通過改變自身形態(tài)、生理生化水平從而適應(yīng)不利的生存環(huán)境。Kovalchuk等［46］對(duì)長(zhǎng)期暴露于鎘和鉛脅迫的植物的全球基因組表達(dá)分析表明，Cd脅迫下分別有65個(gè)基因上調(diào)和338個(gè)基因下調(diào)，Pb脅迫下有19上調(diào)基因和76個(gè)下調(diào)基因；其中，在經(jīng)過Pb處理的植物中，半數(shù)改變其表達(dá)的基因在經(jīng)過Cd處理的植物中也發(fā)生了改變；與Pb相比，Cd調(diào)控的基因數(shù)量越多，說明植株的基因組不穩(wěn)定性越高，吸收能力也越強(qiáng)。張國(guó)儒等［47］對(duì)鹽脅迫下的番茄葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，測(cè)序樣品中共4367個(gè)基因在樣品間表達(dá)出顯著差異，經(jīng)過通路富集分析，認(rèn)為Solyc02g014190.2、Solyc03g083420.2、Solyc08g 066270.1、Solyc09g082890.1和Solyc10g018530.1為番茄的耐鹽相關(guān)基因。Wang等［48］使用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄q-PCR技術(shù)對(duì)鐵缺乏條件下的擬南芥進(jìn)行研究，結(jié) 果 表 明BHLH038、BHLH039、BHLH100和BHLH101可能參與介導(dǎo)缺鐵誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)或與植物體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)。

3 植物對(duì)不同非生物脅迫的響應(yīng)

當(dāng)植物面臨不利的生長(zhǎng)條件時(shí)，非生物脅迫會(huì)阻礙植物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力。植物會(huì)根據(jù)當(dāng)前的壓力狀況重新配置代謝網(wǎng)絡(luò)，以維持必需的代謝并通過采用新的穩(wěn)態(tài)來(lái)適應(yīng)環(huán)境［49］。植物對(duì)逆境的響應(yīng)涉及到不同的信號(hào)感受、信號(hào)傳導(dǎo)以及基因的表達(dá)與調(diào)控，具有龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［50］。溫度、水分及重金屬等是對(duì)植物生長(zhǎng)和作物生產(chǎn)有不利影響的常見脅迫條件。

3.1 植物在溫度脅迫下的代謝與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

溫度脅迫幾乎可對(duì)植物生長(zhǎng)的所有階段造成嚴(yán)重?fù)p害，溫度脅迫不僅使植物的生長(zhǎng)發(fā)育受阻，還會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的不可逆損害、代謝途徑的破壞、結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的降解以及細(xì)胞膜脂過氧化，造成細(xì)胞死亡，甚至可能導(dǎo)致植物的死亡［51］。

在高溫脅迫下，植物主要通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)、熱激蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)這四部分來(lái)適應(yīng)高溫環(huán)境［52］。李川等［53］的研究結(jié)果表明熱激轉(zhuǎn)錄因子（Hsfs）、熱激蛋白（Psps）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸基因家族（PIP2）和生長(zhǎng)素（IAA）基因在花粒期玉米對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)過程中起重要作用。Rizhsky等［54］對(duì)高溫脅迫下擬南芥進(jìn)行GC-MS研究，結(jié)果表明丙氨酸、甘油、麥芽糖、蔗糖和海藻糖含量均增加。除此之外，植物激素如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和乙烯等，也與不同植物中的HS信號(hào)有關(guān)［55］。Larkindale等［56］的研究表明，在豌豆和匍匐草本植物從熱脅迫處理恢復(fù)過程中，ABA水平出現(xiàn)峰值；同時(shí)，測(cè)量到了對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)而升高的SA水平［57］。Liu等［58］的研究表明，SA作用于ABA下游和磷脂酰肌醇4，5二磷酸特異性磷脂酶。HSPs是植物中一種熱休克蛋白，所有主要SHSP的轉(zhuǎn)錄本在熱脅迫期間均大量積累，并且特定的SHSP也在發(fā)育和其他一些脅迫下表達(dá)［59］。Sanmiya等［60］研究表明線粒體HSPs的過表達(dá)增強(qiáng)了煙草的耐熱性。高溫脅迫誘導(dǎo)了植物體內(nèi)的多種分子和離子進(jìn)行傳感和信號(hào)傳遞，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高是溫度脅迫下的主要信號(hào)［61］。鈣離子濃度和鈣依賴性蛋白（CDPK）可以調(diào)節(jié)熱休克蛋白的表達(dá)［62］。此外，胞漿中的Ca2+濃度的增加有助于植物細(xì)胞在熱損傷期間更好地存活，這是通過增加抗氧化劑的活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞的滲透平衡［63］。

3.2 植物在水分脅迫下代謝與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

水分是生命中不可缺少的物質(zhì)，水分虧缺對(duì)植物造成的影響最大，且植物對(duì)水分虧缺較敏感。在水分脅迫下植物體內(nèi)氨基酸的水平會(huì)有不同程度的上升，氨基酸不僅是植物的組成部分，也是植物的重要代謝物，具有信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收和重金屬解毒等多種功能［64］。Deluc等［65］的研究表明氨基酸的水平會(huì)在水分脅迫下發(fā)生變化。王征宏等［66］研究表明，經(jīng)NaCl處理后的玉米葉片的游離氨基酸總量急劇上升，與對(duì)照相比，處理后第4天游離氨基酸含量的提高了兩倍，達(dá)到峰值。

植物對(duì)水分脅迫的響應(yīng)范圍非常廣，除抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等普遍適應(yīng)逆境的響應(yīng)外，光合作用、氮代謝也是響應(yīng)水分脅迫的重要環(huán)節(jié)。王曉嬌等［67］對(duì)水分脅迫下的苗期馬鈴薯根系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，結(jié)果表明在中度水分脅迫及重度水分脅迫下分別有1488、5241個(gè)顯著表達(dá)差異的基因，在兩個(gè)水分脅迫條件下共同出現(xiàn)的差異基因有369個(gè)，通過KEGG代謝富集分析，這些基因富集在谷胱甘肽代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。劉永紅等［68］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致花期玉米葉片的葉綠素含量降低，光化學(xué)效率和光系統(tǒng)潛在活性大大降低。Hsiao［69］研究發(fā)現(xiàn)，水分虧缺可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解酶性大大增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量分解并增加可溶活性氮含量。棉花在水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄組共有519個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因與脅迫、防御、代謝有關(guān)，同時(shí)與熱休克蛋白和活性氧有關(guān)的途徑也受到影響［70］。Padmalatha等［71］對(duì)干旱脅迫下纖維伸長(zhǎng)過程中的棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，結(jié)果表明編碼轉(zhuǎn)錄因子、滲透調(diào)節(jié)劑、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、熱休克蛋白和激素生物合成的基因也高度上調(diào)，參與苯丙酸合成、類黃酮生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝途徑的基因下調(diào)等過程。

3.3 植物在重金屬脅迫下代謝與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

通常，重金屬會(huì)抑制植物細(xì)胞酶的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化和代謝紊亂，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至在極端情況下導(dǎo)致植物死亡［72］。重金屬脅迫會(huì)影響植物細(xì)胞分裂、光合作用、蒸騰作用、種子萌發(fā)及根系生長(zhǎng)等多種生理過程［73］；還會(huì)使植物產(chǎn)生氧化脅迫，催化苔騰反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，導(dǎo)致脂類、蛋白質(zhì)和DNA受到損害［74］；同時(shí)，在重金屬脅迫下，植物可合成各種代謝物及信號(hào)分子，如抗氧化物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、有機(jī)酸、酚類物質(zhì)等［75］。

玉米在鎘、銅、鉛等脅迫處理下，綠原酸、蘆丁等酚類物質(zhì)的含量均上升［76］。由于酚類化合物中羥基與羧基的存在，這些羥基和羧基可以與金屬離子結(jié)合，所以在重金屬脅迫條件下，酚類化合物可以螯合重金屬離子，從而抑制苔騰反應(yīng)［77］。除此以外，氨基酸及其衍生物可以螯合重金屬離子，從而提高植物對(duì)重金屬的耐受性，其中脯氨酸與組氨酸可以螯合細(xì)胞和木質(zhì)部汁液中的金屬離子［78］。Bhagyawan等［79］研究表明在重金屬脅迫下鷹嘴豆幼苗體內(nèi)脯氨酸含量增加。在重金屬脅迫下脯氨酸含量的增加可以減少自由基的形成，并通過提高谷胱甘肽的水平維持氧化還原環(huán)境［80］。Ahmad等［81］研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的鉛脅迫會(huì)降低玉米的光合速率和水分利用效率，增強(qiáng)蒸騰效率。Norton等［82］對(duì)砷有不同耐性的兩個(gè)水稻品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄因子、應(yīng)激蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)出現(xiàn)差異，其中參與谷胱甘肽合成、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因反應(yīng)表明，谷胱甘肽結(jié)合和砷酸鹽甲基化可能是水稻對(duì)砷的重要應(yīng)激反應(yīng)。植物受到重金屬脅迫下，MAPK級(jí)聯(lián)對(duì)激素合成中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要意義［83］。Jonak等［84］研究表明，紫花苜蓿在銅或鎘脅迫下4種MAPK亞型均被激活，且MAPK級(jí)聯(lián)對(duì)激素合成中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要意義。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，迄今為止的試驗(yàn)使我們能夠?qū)Ψ巧锩{迫下的大量代謝物變化進(jìn)行分類研究。應(yīng)激反應(yīng)的代謝變化可分為3個(gè)階段：環(huán)境變化的直接影響、對(duì)應(yīng)激條件的短暫適應(yīng)和在長(zhǎng)期應(yīng)激條件下建立的新的穩(wěn)態(tài)。但由于上游反應(yīng)的上調(diào)和下游反應(yīng)的下調(diào)都會(huì)導(dǎo)致代謝物的累積，代謝物的分布并不能準(zhǔn)確地揭示相關(guān)代謝途徑是上調(diào)還是下調(diào)，因此，代謝組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聯(lián)用可以揭示有關(guān)植物在非生物脅迫下的各種變化，對(duì)植物非生物脅迫的耐受性有一個(gè)清晰的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析廣泛應(yīng)用于比較作物的親緣關(guān)系，有助于改善馴化作物［85］。將已經(jīng)獲得的結(jié)果、同位素試驗(yàn)和全面的植物測(cè)量進(jìn)一步與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相結(jié)合，可以進(jìn)一步加深我們對(duì)這些關(guān)鍵過程的理解。

目前對(duì)于植物在脅迫下的應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限。未來(lái)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)可以采用多學(xué)科的方法，將不同組學(xué)技術(shù)整合到一起，將分子信息與植物表征變化聯(lián)系到一起，可以在一定程度上揭示植物的抗逆綜合生化網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而應(yīng)用到基因工程中，為植物抗逆境基因的挖掘提供理論依據(jù)，增強(qiáng)經(jīng)濟(jì)作物對(duì)各種非生物脅迫的耐受性，同時(shí)對(duì)糧食作物的食品安全也有重要意義。