山藥塊莖發(fā)育階段基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及階段特異性分析

殷劍美　張鉛　蔣璐　張培通

摘要： 山藥是一種藥食同源作物，塊莖是其主要產(chǎn)品器官，其發(fā)育機(jī)制對(duì)于山藥產(chǎn)量和品質(zhì)提升相關(guān)育種有著重要的指導(dǎo)作用。以不同生長階段（塊莖膨大第1 d、第11 d、第21 d、第31 d、第41 d、第51 d，T1～T6）的山藥塊莖為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)從頭（de novo）組裝后獲得42 042個(gè)unigenes，利用七大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，鑒定后發(fā)現(xiàn)山藥塊莖形成過程中涉及大量基因，包括激素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因。階段特異性分析結(jié)果表明，塊莖形成初始階段為塊莖發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期;加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，在山藥塊莖形成初期及后期，激素相關(guān)基因的表達(dá)特別活躍，脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）是山藥塊莖生長發(fā)育的重要激素。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究山藥塊莖膨大分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 山藥;轉(zhuǎn)錄組測序;階段特異性基因;基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào)： S632.101 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0030-09

Abstract： Chinese yam is a crop with hamology of medicine and food， and tuber is its main product organ. The development mechanism of tubers plays an important guiding role in the breeding related to the improvement of yield and quality of yam. Based on transcriptome sequencing of tubers at different growth stages （T1-T6）， after de novo assembly， 42 042 unigenes were obtained and annotated using seven databases. After identification， it was found that a large number of genes were involved in the process of tuber formation， including hormone synthesis-related genes， signal transduction-related genes， and so on. The results of stage specificity analysis showed that the initial stage of tuber formation was a critical period. The results based on the weighted gene co-expression network analysis （WGCNA） showed that the expression of hormone-related genes was very active in the early and late stages of tuber growth. Abscisic acid （ABA） and jasmonic acid （JA） were important hormones for the growth and development of yam tubers. The results lay a foundation for further study on the molecular mechanism of tuber enlargement of yam.

Key words： yam;transcriptome sequencing;stage-specific gene;weighted gene co-expression network analysis

參薯山藥（Dioscorea alata）是薯蕷科薯蕷屬藥食同源的作物，其地下塊莖是參薯山藥的主要產(chǎn)品器官[1]，具有高鉀、低纖維、高蛋白質(zhì)、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[2]。參薯山藥塊莖在發(fā)育過程中邊膨大邊積累養(yǎng)分，關(guān)于其塊莖形成的分子機(jī)制研究較少。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們可以從分子水平研究植物的動(dòng)態(tài)發(fā)育[3-4]，包括激素和次生代謝物形成的分子機(jī)制等[5]。目前，關(guān)于地下塊莖發(fā)育的研究主要集中在馬鈴薯、甘薯等作物上，且塊莖發(fā)育與激素密切相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，ABR1在芥菜塊莖中的表達(dá)量顯著增加，脫落酸（ABA）介導(dǎo)的信號(hào)參與了塊莖膨大[6];在馬鈴薯塊莖膨大早期，調(diào)控赤霉素（GA）降解的基因表達(dá)量上調(diào)，GA含量迅速下降，從而促進(jìn)塊莖膨大[7]。Sarker等[8]認(rèn)為，茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA）在馬鈴薯塊莖形成中起著重要作用。筆者之前對(duì)參薯山藥塊莖不同發(fā)育時(shí)期激素含量的研究發(fā)現(xiàn)，GA在塊莖形成初期的含量較高，可以抑制塊莖形成;ABA和JA對(duì)塊莖膨大具有促進(jìn)作用[9]。

本研究以不同生長時(shí)期參薯山藥塊莖為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，采用階段特異性（Stage specific，SS）方法分析塊莖發(fā)育過程中相關(guān)激素基因的表達(dá)，構(gòu)建其基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（Weighted gene co-expression network analysis， WGCNA），以期為揭示參薯山藥塊莖形成的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為米易山藥（Dioscorea alata L.），引自四川省米易縣，屬于國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，于2018年4月26日種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地，當(dāng)年10月24日收獲。塊莖于9月4日（播種后132 d）開始膨大，分別于塊莖膨大的第11 d（9月14日）、21 d（9月24日）、31 d（10月4日）、41 d（10月14日）、51 d（10月24日）取地下塊莖，每次取3株混合，用液氮速凍后保存于-70 ℃冰柜中備用。

1.2 RNA和cDNA文庫的制備

采用TRIzol法（Invitrogen，USA）進(jìn)行總RNA的提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否降解及污染，用Nano光度計(jì)（IMPLEN，USA）檢測RNA的純度（OD260/280），用QubitRNA試劑盒（Life Technologies，USA）測定RNA的濃度，用RNA Nano 6000試劑盒（Agilent Technologies，USA）評(píng)估RNA的完整性。

取1.5 μg RNA，用poly-T寡聚物磁珠純化mRNA。利用隨機(jī)六聚體引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNase H）合成第1鏈cDNA，用DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成第2鏈cDNA。用TruSeq PE Cluster Kit v3 cBot HS（Illumia）在cBot聚類生成系統(tǒng)上對(duì)索引編碼樣品進(jìn)行聚類。在Illumina Hiseq平臺(tái)上對(duì)文庫進(jìn)行測序，獲得大小為125 bp/150 bp的雙端reads。

1.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估

對(duì)測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除接頭（未知堿基比例>10%，Qphred值≤20的堿基數(shù)>50%）。

1.4 拼接及功能注釋

采用Grabherr[10]對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，獲得unigene，隨后進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫（包括NR、NT、PFAM、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO）功能的注釋，同時(shí)基于斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)（Spearman correlation coefficient，SCC）進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

1.5 基因表達(dá)量的計(jì)算和差異基因的篩選

采用基因表達(dá)水平估算方法[11]對(duì)readcount（read數(shù)）進(jìn)行每百萬堿基對(duì)測序的每千堿基轉(zhuǎn)錄序列片段（fragments）數(shù)目（FPKM）估算，計(jì)算公式如下：

FPKM=total exon fragmentsmapped reads × exon length

式中，total exon fragments表示總外顯子片段數(shù)，mapped reads表示定位read數(shù)（百萬）;exon length表示外顯子長度（kB）。

以P值<0.05且 |log2FoldChange|>1為閾值篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）。

SS（i，j）=1-MaxEikEij，1≤k≤6，k≠j

1.6 階段特異基因的篩選及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過階段特異性（Stage specific，SS）算法[12]，篩選得分>0.5的unigene作為階段特異基因。對(duì)基因變異系數(shù)>0.5的基因進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）[13]。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

采用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成cDNA，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量的差異，隨機(jī)挑選8個(gè)基因，使用Primer 5.0（Premier BIosoft International，USA）設(shè)計(jì)引物，選擇DaActin作為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)程序：95? ℃ 30 min;95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。通過定量反應(yīng)的熔解曲線，驗(yàn)證引物的特異性是否滿足試驗(yàn)要求。RT-qRCR反應(yīng)在Light Cycle 480熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（Roche， 瑞士）中進(jìn)行，依據(jù)2-△△Ct算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析與基因注釋

將測序的原始數(shù)據(jù)過濾后，平均每個(gè)文庫含有50 266 758個(gè)clean reads，共獲得186 793個(gè)transcripts和42 042個(gè)unigenes。不同F(xiàn)PKM區(qū)間的unigene數(shù)量如圖1所示，可以看出，在不同時(shí)期，大部分基因的FPKM值為 0～0.10、0.31～3.57。

T1：塊莖膨大第1 d;T1：塊莖膨大的第11 d;T3：塊莖膨大的第21 d;T4：塊莖膨大的第31 d;T5：塊莖膨大的第41 d;T6：塊莖膨大的第51 d。

分別有46.48%、24.15%、14.62%、56.74%、35.30%、46.48%和44.01%的基因在GO、KEGG（KO）、KOG、NR、NT、PFAM和SwissProt數(shù)據(jù)庫中得到注釋。其中在NR數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果表明，與參薯山藥比對(duì)率較高的植物是棕櫚（23.6%）、海棗（18.7%）、菠蘿（7.1%）、小果野蕉（6.8%）和蘆筍（5.6%），它們與參薯山藥均屬于單子葉植物，具有較相似的基因信息。

由圖2可以看出，在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到55個(gè)富集條目，其中包括25個(gè)“生物學(xué)過程”、20個(gè)“細(xì)胞組成”和10個(gè)“分子功能”?！吧飳W(xué)過程”基因主要富集在“細(xì)胞過程”（GO：0009987）、“代謝過程”（GO：0008152）和“單一組織過程”（GO：0044699）;“細(xì)胞組成”基因主要富集在“細(xì)胞”（GO：0005623）、“部分細(xì)胞”（GO：0044464）和“細(xì)胞器官”（GO：0043226）;“分子功能”基因主要富集在“結(jié)合”（GO：0005488）和“催化活性”（GO：0003824）。

共有10 154個(gè)unigenes注釋到130個(gè)KEGG通路中，可分為新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和組織系統(tǒng)5類，其中大部分基因注釋到新陳代謝的代謝通路中（圖3）。

主成分分析結(jié)果顯示，6個(gè)樣本可明顯分為T1時(shí)期、T2～T6時(shí)期，T1時(shí)期和其他各時(shí)期的相關(guān)性較低，T2～T6時(shí)期較為聚集;塊莖在生長早期（T1時(shí)期）和后期（T2～T6時(shí)期）存在較大差異（圖4）。

2.2 塊莖發(fā)育過程中不同表達(dá)基因和階段特異基因分析

分析差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，兩兩樣品之間的DEGs數(shù)量為442～6 774個(gè)，其中與T5時(shí)期相比，T1時(shí)期的DEGs數(shù)量最多，有3 790個(gè)上調(diào)基因，2 984個(gè)下調(diào)基因（表1）。共獲得8 222個(gè)階段特異表達(dá)基因，數(shù)量范圍為599～3 621個(gè)（圖5）。GO分析發(fā)現(xiàn)，T1時(shí)期的大多數(shù)基因與蛋白質(zhì)磷酸化、去磷酸化、細(xì)胞蛋白修飾過程、蛋白質(zhì)修飾過程、生長素應(yīng)答、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、激素應(yīng)答等有關(guān)。

柱旁數(shù)據(jù)表示注釋到相應(yīng)基因的數(shù)量。

2.3 T1時(shí)期差異表達(dá)基因及特異基因分析

主成分分析和不同發(fā)育階段特異基因分析結(jié)果顯示，T1時(shí)期和T2～T6時(shí)期之間存在明顯差異，在其有表達(dá)差異的基因中，共有211個(gè)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中36個(gè)基因編碼AP2/ERF，另外編碼WRKY、C2H2、MYB、NAC、bHLH、bZIP的基因均表現(xiàn)為高表達(dá)。

通過比較T1時(shí)期外的其他時(shí)期與T1時(shí)期發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的基因達(dá)9 701個(gè)，其中4 546個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)，5 181個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)。GO分析結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)的基因與細(xì)胞壁構(gòu)建、細(xì)胞骨架構(gòu)建、DNA復(fù)制、焦磷酸酶活性、染色體、DNA代謝過程調(diào)控有關(guān);下調(diào)表達(dá)的基因與核糖核酸結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白激酶磷酸化活性、大分子代謝、初級(jí)代謝及氮化合物過程的調(diào)控、細(xì)胞大分子和大分子調(diào)節(jié)及細(xì)胞生物合成過程有關(guān)。KEGG分析結(jié)果表明，上調(diào)表達(dá)的基因主要與次生代謝物生物合成、氨基酸合成、代謝和降解、檸檬酸循環(huán)有關(guān);下調(diào)表達(dá)的基因主要涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙氨酸生物合成、酪氨酸生物合成、脂肪酸降解、色氨酸生物合成、玉米素生物合成、生物合成酯類代謝。

2.4 激素相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜分析

對(duì)所有時(shí)期的特異基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與GA相關(guān)的3個(gè)關(guān)鍵基因在整個(gè)生長期的表達(dá)量均較低，0

2.5 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對(duì)20 988個(gè)基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，可將其分為圖6中的25個(gè)不同模塊。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，模塊1（綠黃模塊，181個(gè)基因）與T1時(shí)期高度相關(guān)，其中有18個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，包括轉(zhuǎn)錄因子BHLH148、WRKY與乙烯應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ERF036 like等。構(gòu)建T1時(shí)期特征模塊基因間聯(lián)通性的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，詳見圖7。

T1-1、T1-2、T1-3：T1時(shí)期取樣塊莖的3個(gè)重復(fù)，其他處理以此類推。共分為25個(gè)不同模塊，其中模塊1（綠黃模塊，181個(gè)基因）與T1時(shí)期高度相關(guān);圖例數(shù)據(jù)表示模塊與樣本間的相關(guān)性。

正方形節(jié)點(diǎn)：核心基因;菱形節(jié)點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控激酶基因;正六邊形節(jié)點(diǎn)：合成和代謝相關(guān)基因;圓形節(jié)點(diǎn)：其他基因。

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證

以Actin為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取8個(gè)基因進(jìn)行RT-qPCR，測定其表達(dá)量。引物序列見表3，基因表達(dá)量見圖8?；驘晒舛勘磉_(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

左縱坐標(biāo)：基于熒光定量法的基因相對(duì)表達(dá)水平;右縱坐標(biāo)：基于轉(zhuǎn)錄組測序的FPKM值。A：NCED基因（cluster-5213.7062）;B：CYP707A基因（cluster-5213.14981）;C：GID1C基因（cluster-5213.13061）;D：OPR基因（cluster-5213.15137）;E：AOS基因（cluster-5213.15182）;F：LOG基因（cluster-5213.2615）;G：GBSS基因（cluster-5213.17103）;H：SSS基因（cluster-5213.22318）。T1、T2、T3、T4、T5、T6見圖1注。不同發(fā)育時(shí)期標(biāo)有不同小寫字母的表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 山藥塊莖發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期分析

DEGs主要發(fā)生在塊莖形成初期，T1時(shí)期的特異基因數(shù)量最多，推測塊莖形成初期是最重要的階段，這與馬鈴薯相關(guān)研究結(jié)果[15]一致。T1時(shí)期上調(diào)表達(dá)的DEGs在蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白激酶途徑中顯著富集，而蛋白質(zhì)磷酸化作為細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的重要組成部分，經(jīng)常參與許多生物過程，如植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、刺激反應(yīng)和抗應(yīng)激調(diào)節(jié)[16]。T1時(shí)期的特異基因編碼211個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，揭示許多編碼TFs的基因參與塊莖形成。另外T1時(shí)期表達(dá)的大部分基因與激素有關(guān)，說明激素與塊莖形成關(guān)系密切。

3.2 參與山藥塊莖發(fā)育過程的激素相關(guān)基因分析

植物激素的協(xié)同作用對(duì)塊莖的形成和生長調(diào)節(jié)具有重要意義。GA和ABA是1對(duì)經(jīng)典的植物激素組合，它們的前體都是甲戊龍酸，對(duì)種子休眠和萌發(fā)、根系發(fā)育和開花有拮抗作用，GA和ABA之間的平衡和相互調(diào)節(jié)在植物生長發(fā)育中起著重要作用[17]。關(guān)于GA對(duì)塊莖生長的影響有不同觀點(diǎn)，但一般認(rèn)為，GA可以抑制或延緩塊莖的發(fā)育。GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過環(huán)境和內(nèi)部條件整合GA受體GID1和抑制因子DELLA，形成GA-GID1-DELLA三聚體復(fù)合體，從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[18]。已發(fā)現(xiàn)的DELLA蛋白包括擬南芥GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3[19]以及小麥RHT[20]、大麥SLN1[21]和水稻SLR1[22]等。本研究發(fā)現(xiàn)，編碼DELLA蛋白的GAI在T1時(shí)期高表達(dá)，推測塊莖開始形成時(shí)，GA就開始受到抑制，導(dǎo)致T2時(shí)期的GA含量迅速下降后，在以后生育期處于較低水平[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，NCED3高表達(dá)顯著增加擬南芥的ABA含量[23];ZEP參與擬南芥種子發(fā)育中ABA的合成[24];CYP707A[25]編碼ABA8′羥化酶。本研究發(fā)現(xiàn)，1個(gè)NCED基因在T1～T5時(shí)期下調(diào)表達(dá)，但在T6期強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá);3個(gè)ZEP基因中有2個(gè)基因在早期高表達(dá);3個(gè)CYP707A基因在T1時(shí)期上調(diào)表達(dá)，在T2～T6期的表達(dá)量顯著降低。在塊莖形成過程中，調(diào)控ABA的基因的表達(dá)一直較活躍，含量保持上升[9]。對(duì)水稻的研究發(fā)現(xiàn)，高ABA含量會(huì)誘導(dǎo)淀粉積累量增加[26]，在山藥塊莖發(fā)育后期ABA含量持續(xù)增長，不僅有利于塊莖生長，而且有利于淀粉積累。

丙二烯氧化物合酶（AOS）是JA合成途徑中的第1個(gè)特異性酶，可以催化氧化丙二烯的合成，12-氧-植物二烯酸還原酶（OPR）是JA合成的關(guān)鍵酶，AOS基因的過度表達(dá)可增加馬鈴薯中JA含量[27]。在本研究中，AOS、OPR在整個(gè)生育期一直高表達(dá)，尤其在T1時(shí)期，推測在山藥塊莖的整個(gè)發(fā)育過程中，JA的合成和代謝相對(duì)較強(qiáng)，使得塊莖中的JA含量較高[9]。

共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，在T1時(shí)期的特異性模塊中，乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子ERF036 like、真核細(xì)胞翻譯起始因子等基因的表達(dá)水平較高。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族參與多種生物過程，包括激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、代謝及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)[28-30]，推測在參薯山藥塊莖發(fā)生初期涉及多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在T6時(shí)期的特異性模塊中，含有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（WRKY71、WRKY79）編碼基因。在水稻胚、糊粉層細(xì)胞中，WRKY71表達(dá)由ABA誘導(dǎo)并被GA抑制，α-淀粉酶amy32B和赤霉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子GAMYB協(xié)同表達(dá)[31];WRKY79在玉米中過度表達(dá)會(huì)增加茉莉酸和乙烯途徑、活性氧清除中相關(guān)基因及其他相關(guān)基因的表達(dá)量[32]，推測在塊莖發(fā)育后期，激素相關(guān)基因的表達(dá)特別活躍。

4 結(jié)論

本研究對(duì)山藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，在山藥塊莖形成初期，尤其是T1時(shí)期為塊莖發(fā)育的重要時(shí)期，階段特異基因數(shù)目最多，上調(diào)的DEGs與細(xì)胞生長、激素均密切相關(guān);塊莖發(fā)育后期激素相關(guān)基因表達(dá)特別活躍，ABA和JA是塊莖生長發(fā)育的重要激素。研究結(jié)果與之前關(guān)于塊莖發(fā)育中激素含量的研究結(jié)果一致，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合生理測定結(jié)果可以為進(jìn)一步分析山藥塊莖膨大的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）