枸杞類胡蘿卜素指紋圖譜的建立及其抗氧化活性譜效關(guān)系研究

王靜 王杰 阿娜爾 李彤 楊冬平 戴俊東 董玲

中圖分類號 R284.1 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0575-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.11

摘 要 目的 建立枸杞類胡蘿卜素高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并考察其共有峰與抗氧化活性的譜效關(guān)系。方法 采用HPLC法進行檢測，根據(jù)《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）建立34批不同產(chǎn)地枸杞類胡蘿卜素的指紋圖譜，并進行相似度評價和共有峰指認。以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，考察枸杞類胡蘿卜素的體外抗氧化活性，并采用灰色關(guān)聯(lián)度法分析枸杞類胡蘿卜素各共有峰與抗氧化活性的譜效關(guān)系。結(jié)果 34批枸杞類胡蘿卜素共有4個共有峰，相似度均不低于0.903;并指認出1號峰為玉米黃質(zhì)、4號峰為玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯。其對DPPH自由基的清除率為1.792%～3.160%。枸杞類胡蘿卜素各共有峰與DPPH自由基清除率均呈正相關(guān)，關(guān)聯(lián)度均大于0.6;2號峰、4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯）與DPPH自由基清除率的關(guān)聯(lián)度均大于0.8。根據(jù)關(guān)聯(lián)度確定各共有峰對DPPH自由基清除率的貢獻大小依次為2號峰>4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯）>1號峰（玉米黃質(zhì)）>3號峰。結(jié)論 本研究成功建立了枸杞類胡蘿卜素的HPLC指紋圖譜，指認了2個共有峰，其中2號峰所代表化學(xué)成分和玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯可能是枸杞類胡蘿卜素抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 枸杞;類胡蘿卜素;指紋圖譜;譜效關(guān)系

Establishment of carotenoid fingerprint in Lycium barbarum and study on its antioxidant activity spectrum-effect relationship

WANG Jing，WANG Jie，Anaer，LI Tong，YANG Dongping，DAI Jundong，DONG Ling（College of Life Science， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of carotenoid in Lycium barbarum， and to investigate the spectrum-effect relationship between its common peak and antioxidant activity. METHODS HPLC method was adopted. The fingerprints of carotenoid in 34 batches of L. barbarum from different producing areas were established by Similarity Evaluation System of TCM Fingerprint （2012 edition）， and similarity evaluation and common peak identification were carried out. Taking scavenging rate of DPPH free radical as index， in vitro antioxidant activity of carotenoid in L. barbarum was investigated. The spectrum-effect relationship between the common peaks of carotenoids in L. barbarum and antioxidant activity was analyzed by grey correlation method. RESULTS There were 4 common peaks in the fingerprints of carotenoids in 34 batches of? ? ?L. barbarum， and the similarity was not less than 0.903. Peak 1 was identified as zeaxanthin， and peak 4 as zeaxanthin dipalmitate. The scavenging rates of them to DPPH free radical were 1.792%-3.160%. The common peaks of carotenoids in L. barbarum were positively correlated with scavenging rate of DPPH free radical， and the correlation degree was greater than 0.6; the correlation degree of peak 2 and peak 4 （zeaxanthin dipalmitate） with scavenging rate of DPPH free radical was greater than 0.8. According to the correlation degree， the contribution of each common peak to scavenging rate of DPPH free radical was determined as peak 2>peak 4 （zeaxanthin dipalmitate）>peak 1 （zeaxanthin）>peak 3. CONCLUSIONS In this study， HPLC fingerprint of carotenoid in L. barbarum is successfully established， and two common peaks are identified. The chemical components represented by peak 2 and zeaxanthin palmitate may be the material basis of antioxidant activity of carotenoid in L. barbarum.

KEYWORDS? ?Lycium barbarum; carotenoid; fingerprint; spectrum-effect relationship

枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有悠久的藥用歷史。《本草綱目》載曰：“枸杞，補腎生精，養(yǎng)肝，明目，令人長壽”[1] ，其藥用價值備受歷代醫(yī)家的推崇?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，枸杞中主要活性成分為多糖、類胡蘿卜素及其衍生物，其次還有生物堿類、黃酮類化合物[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞的活性成分具有抑菌、降血脂、降血糖、抗衰老等藥理作用[4]。其中，枸杞類胡蘿卜素具有清除羥自由基、超氧自由基和過氧化氫的能力[5-7]。但是，具體是枸杞類胡蘿卜素中哪種成分發(fā)揮上述作用，尚不明確。

中藥譜效關(guān)系研究將指紋圖譜與中藥藥效相結(jié)合，可更全面評價中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[8]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V（HPLC）法建立枸杞類胡蘿卜素的指紋圖譜，并借助灰色關(guān)聯(lián)分析，研究指紋圖譜中共有峰與抗氧化活性的譜效關(guān)系，以期為進一步闡明枸杞類胡蘿卜素抗氧化活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究主要儀器有1206型HPLC儀（美國Agilent公司），SB25-12DTDN 型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），SQP型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 主要藥品與試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑（批號201424）、玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯對照品（批號Z08M10H82528，純度≥95%）、玉米黃質(zhì)對照品（批號K13D8S50509，純度≥85%）、葉黃素對照品（批號F07A9M66853，純度≥98%）、β-類胡蘿卜素對照品（批號T28A9H60248，純度≥98%）均購自上海源葉生物技術(shù)科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，二氯甲烷、無水乙醇、丙酮為分析純，水為純凈水。

本研究采集了不同產(chǎn)地枸杞樣品34批（編號S1～S34，樣品來源信息見表1），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫志蓉教授鑒定為茄科植物枸杞 L. barbarum L.的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸杞類胡蘿卜素的制備

將枸杞藥材粉碎，過篩，取細粉2 g ，精密稱定，加正己烷-無水乙醇-丙酮-二氯甲烷（體積比10 ∶ 6 ∶ 7 ∶ 7）40 mL，超聲（頻率60 kHz，功率300 W）20 min，振搖30 min，在避光條件下皂化 12 h;收集上層溶液，下層樣品重復(fù)上述提取工藝，直至下層無色;合并多次提取的上層溶液，加入20 g無水硫酸鈉脫水過濾，于35 ℃濃縮蒸干，再于真空凍干成粉末，即得枸杞類胡蘿卜素[9]。

2.2 色譜條件

色譜柱為YMC C30（250 mm×4.6 mm，5 μm）;以二氯甲烷-甲基叔丁基醚（體積比1 ∶ 1）為流動相A、甲醇-乙腈-水（體積比84 ∶ 11 ∶ 5）為流動相B，進行梯度洗脫（0～22 min，70%B;22～50 min，50%B;50～55 min，70%B）;流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為517 nm，進樣量為20 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取枸杞類胡蘿卜素粉末1.0 g置于錐形瓶中，加入二氯甲烷 5 mL溶解，濾過;取濾液2 mL，置于10 mL量瓶中，以無水乙醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)對照品各1.0 mg，置于同一10 mL量瓶中，以無水乙醇溶解并定容，即得混合對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取枸杞類胡蘿卜素粉末（編號S18樣品）1.0 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。以4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯，該峰分離度良好、峰面積大且穩(wěn)定）為參照，記錄各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的 RSD 均小于0.4%，相對峰面積的RSD均小于3.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取枸杞類胡蘿卜素粉末（編號S18樣品）1.0 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。以4號峰為參照，記錄各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.6%，相對峰面積的RSD均小于3.1%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 取枸杞類胡蘿卜素粉末（編號S18樣品）1.0 g，共6份，按“2.3.1”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。以4號峰為參照，記錄各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的 RSD 均小于1.5%，相對峰面積的RSD均小于4.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 枸杞類胡蘿卜素HPLC指紋圖譜的生成、相似度評價和共有峰指認

2.5.1 指紋圖譜的生成 取34批枸杞類胡蘿卜素粉末各1.0 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對34批枸杞類胡蘿卜素的HPLC圖進行分析，得到枸杞類胡蘿卜素HPLC對照指紋圖譜（R）和疊加指紋譜圖，詳見圖1、圖2。

2.5.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行相似度評價。結(jié)果顯示，34批枸杞類胡蘿卜素的HPLC圖整體峰形一致，相似度均不低于0.903，提示不同產(chǎn)地枸杞中類胡蘿卜素成分差異較小，具有較好的一致性。結(jié)果見表2。

2.5.3 共有峰的指認 取“2.3.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖3）。與圖1和圖2比對可知，34批枸杞類胡蘿卜素的HPLC疊加指紋圖譜中有4個共有峰，指認出1號峰為玉米黃質(zhì)、4號峰為玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯。

2.6 枸杞類胡蘿卜素的抗氧化活性考察

稱取DPPH 19.72 mg，加無水乙醇溶解并稀釋至0.001 9 mg/mL，避光低溫保存。精密稱取枸杞類胡蘿卜素粉末1.0 g，置于錐形瓶中，按“2.3.1”項下方法制備溶液;取1 mL置于25 mL量瓶中，加水稀釋，制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的樣品溶液。精密移取樣品溶液1 mL和DPPH 溶液1 mL置于10 mL 比色管中，避光反應(yīng)20 min 后，采用紫外分光光度計于517 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)i;另移取樣品溶液1 mL 和水1 mL置于10 mL 比色管中，避光反應(yīng)20 min后，采用上述方法測定吸光度值A(chǔ)j;另移取DPPH溶液1 mL 與水1 mL置于10 mL比色管中，避光反應(yīng) 20 min，采用上述方法測定吸光度值A(chǔ)0。上述試驗平行操作3次，取平均值，并計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-（Ai-Aj）]/A0×100%。結(jié)果顯示，34批枸杞類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率為1.792%～3.160%，詳見表3。

2.7 枸杞類胡蘿卜素的抗氧化活性譜效關(guān)系研究

2.7.1 數(shù)據(jù)處理 參考文獻[10]方法，將枸杞類胡蘿卜素指紋圖譜的共有峰與DPPH自由基清除率數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化和歸一化處理，再將歸一化后的DPPH自由基清除率數(shù)據(jù)作為參考序列[記為Y（k）]，將共有峰數(shù)據(jù)作為比較序列[記為Xi（k）]，計算參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)[記為Ai（k）][11]，計算公式為：Ai（k）=[Δi（k）min+ρ×Δi（k）max]/ [Δi（k）+ρ× Δi（k）max]，其中ρ表示分辨系數(shù)（通常取 0.5），Δi（k）=? ? |Y（k）-Xi（k）|，i 表示枸杞類胡蘿卜素指紋圖譜中的共有峰編號（i=1，2，3……）。

2.7.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 根據(jù)“2.7.1”項下處理后的結(jié)果，分別計算各參考序列與比較序列之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)Ai（k）的平均值，即灰色關(guān)聯(lián)度。將關(guān)聯(lián)度按大小排序所得的關(guān)聯(lián)序，可直觀反映枸杞類胡蘿卜素指紋圖譜中各共有峰對DPPH自由基清除率的貢獻大小，揭示其主要藥效物質(zhì)：當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.6時，表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有關(guān)聯(lián)性;當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8時，表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有較大關(guān)聯(lián)性[10]。結(jié)果顯示，枸杞類胡蘿卜素中4個共有峰與DPPH自由基清除率均呈正相關(guān)，關(guān)聯(lián)度均大于0.6;2號峰、4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯）與DPPH自由基清除率的關(guān)聯(lián)度均大于0.8。根據(jù)關(guān)聯(lián)度，確定各共有峰（成分）對DPPH自由基清除率的貢獻大小依次為2號峰>4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯）>1號峰（玉米黃質(zhì)）>3號峰。結(jié)果見表4。

3 討論

指紋圖譜法利用其能夠顯示藥材多種成分含量，并能特征性地表達藥材成分復(fù)雜性的特殊優(yōu)勢，成為當(dāng)前最有效、最快捷的中藥質(zhì)量控制與評價方法[12]。鑒于此，本課題組從整體角度出發(fā)，采用HPLC法，建立了34批枸杞類胡蘿卜素的指紋圖譜及對照指紋圖譜，確定了4個共有峰，計算得相似度為0.903～0.999;通過與對照品進行比對，指認出了1號峰為玉米黃質(zhì)、7號峰為玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯。這為枸杞類胡蘿卜素的質(zhì)量控制與評價提供了參考依據(jù)。

其次，筆者在枸杞類胡蘿卜素HPLC指紋圖譜共有峰與其抗氧化活性數(shù)據(jù)量化的基礎(chǔ)上，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對枸杞類胡蘿卜素指紋圖譜共有峰與抗氧化活性進行相關(guān)性研究。結(jié)果顯示，枸杞類胡蘿卜素各成分均具有抗氧化活性，2號峰（未知成分）和4號峰（玉米黃質(zhì)雙棕櫚酸酯）與DPPH自由基清除率的關(guān)聯(lián)度大于0.8，由此可知，2號峰所代表的化學(xué)成分和玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯是枸杞類胡蘿卜素抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。這一研究結(jié)果初步探明了枸杞類胡蘿卜素抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為后續(xù)建立化學(xué)特征關(guān)聯(lián)功效活性的評價方法來評價不同產(chǎn)地枸杞的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功建立了枸杞類胡蘿卜素的HPLC指紋圖譜，指認了2個共有峰，其中2號峰所代表化學(xué)成分和玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯可能是枸杞類胡蘿卜素抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-10-13 修回日期：2022-01-06）

（編輯：唐曉蓮）

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