小花清風(fēng)藤醇提物的化學(xué)成分及體外抗氧化活性研究

周永強(qiáng) 趙春麗 殷鑫 周濤 韓偉 張永萍

中圖分類號 R917;R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0530-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.04

摘 要 目的 分離、鑒定小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物的化學(xué)成分，并初步評價其體外抗氧化活性。方法 采用硅膠、ODS反相硅膠、Sephadex-LH20柱色譜法及制備型高效液相色譜法等對小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物中化學(xué)成分進(jìn)行分離和純化，并結(jié)合核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）及電噴霧-質(zhì)譜（ESI-MS）等波譜方法鑒定所分離出的化合物結(jié)構(gòu)。分別采用2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基自由基（DPPH·）、2，2′-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABST+）和羥基自由基（OH·）清除法考察各化合物的體外抗氧化活性。結(jié)果 從小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物中共分離得到9個化合物，分別鑒定為蘆?。?）、鄰苯二甲酸二異壬酯（2）、鄰苯二甲酸二丁酯（3）、吐葉醇（4）、杜鵑醇（5）、槲皮素-3-O-龍膽雙糖苷（6）、水仙苷（7）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（8）、bonaroside（9）。體外抗氧化結(jié)果顯示，化合物1～9均表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性，其中化合物1、6、7、8對DPPH·、ABST+、OH·的半數(shù)清除濃度均低于70 μg/mL。結(jié)論 首次從清風(fēng)藤屬植物中分離得到吐葉醇、杜鵑醇、bonaroside;蘆丁、槲皮素-3-O-龍膽雙糖苷、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 小花清風(fēng)藤;化學(xué)成分;70%乙醇提取物;抗氧化活性

Study on chemical constituents and in vitro antioxidant activity of ethanol extract of Sabia parviflora

ZHOU Yongqiang，ZHAO Chunli，YIN Xin，ZHOU Tao，HAN Wei，ZHANG Yongping（College of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT OBJECTIVE To separate and identify the chemical constituents in 70% ethanol extract of? Sabia parviflora， and to preliminarily evaluate their in vitro antioxidant activity. METHODS The chemical constituents were separated and purified by silica gel， ODS reversed-phase silica gel， Sephadex-LH20 column and preparative high performance liquid chromatography. The structures of the isolated compounds were identified by 1H-NMR， 13C-NMR and ESI-MS. The in vitro antioxidant activities of the compounds were investigated by 2， 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical （DPPH·）， 2， 2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate）diammonium radical （ABST+）and hydroxyl radical （OH·）. RESULTS A total of 9 compounds were isolated from the 70% ethanol extracts of S. parviflora. They were identified as rutin （1）， diiononyl phthalate （2）， dibutyl phthalate （3）， vomifoliol （4）， rhododendrol （5）， quercetin-3-O-gentiobioside （6）， narcissoside （7）， kaempferol-3-O-rutinoside （8） and bonaroside （9）. The in vitro antioxidant results showed that compound 1-9 showed certain in vitro antioxidant activity， and the half scavenging concentrations of compound 1， 6， 7 and 8 to DPPH·， ABST+， OH· were lower than 70 μg/mL. CONCLUSIONS Vomifoliol， rhododendrol and bonaroside are isolated from S. parviflora for the first time， and rutin， quercetin-3-O-gentiobioside， narcissoside and kaempferol-3-O-rutinoside show good in vitro antioxidant activity.

KEYWORDS Sabia parviflora; chemical constituent; 70% ethanol extract; antioxidant activity

小花清風(fēng)藤Sabia parviflora Wall. ex Roxb.為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬的藤本植物，主要分布在貴州、廣西、云南等地區(qū)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小花清風(fēng)藤水提物能夠降低流感模型小鼠的肺指數(shù)和肺組織中的病毒滴度，從而發(fā)揮抗流感病毒的作用[2];另有研究表明，小花清風(fēng)藤膠囊具有護(hù)肝、解肝毒的活性，從而達(dá)到治療肝炎的作用[3-4]。由此表明，小花清風(fēng)藤具有較大的藥用價值。小花清風(fēng)藤所含化合物的類型主要有黃酮類、生物堿類、脂肪酸類、烷烴類和苯衍生物，其中黃酮類化合物是小花清風(fēng)藤的主要化學(xué)成分[5-6]。本課題組前期開展了小花清風(fēng)藤不同溶劑提取物的體外抗氧化、抑菌及抗炎的藥效學(xué)評價研究，發(fā)現(xiàn)小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物具有較好的抗氧化和抗炎活性;同時，本課題組前期通過薄層色譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該提取物中含有黃酮類成分。因此，本研究對小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物的化學(xué)成分開展深入研究，并對從中分離、鑒定出的化合物進(jìn)行體外抗氧化活性評價，以期為進(jìn)一步深入開展小花清風(fēng)藤化學(xué)成分及藥理活性研究，以及擴(kuò)大其藥用活性部位提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Bruker-400型超導(dǎo)核磁共振（NMR）光譜儀（德國Bruker公司）、V-5000型可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、LC-16P制備型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）、AAPI 3200型質(zhì)譜（MS）儀（美國Sciex公司）、Agilent-1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、FA2104N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

小花清風(fēng)藤于2018年8月采自云南省富寧縣，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)室孫慶文教授鑒定為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬小花清風(fēng)藤S. parviflora Wall. ex Roxb.的葉片。維生素C購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司（批號5210421，規(guī)格100 mg）;2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）購自上海麥克林生化科技有限公司;2，2′-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、葡聚糖凝膠LH-20均購自北京索萊寶科技有限公司;柱層析硅膠購自青島海洋化工廠分廠;C18反相柱填料ODS-A-HG購自日本YMC公司;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 小花清風(fēng)藤化學(xué)成分的提取分離

取干燥的小花清風(fēng)藤16.3 kg，粉碎，以70%乙醇（130.4 L/次）加熱回流提取3次、每次2 h?；厥找掖迹瑢⑺靡掖继崛∥锛铀稚⒑?，依次采用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，回收溶劑后，分別得到石油醚萃取部位（100.2 g）、乙酸乙酯萃取部位（220.42 g）和正丁醇萃取部位（530.68 g）。取正丁醇萃取部位（280 g）進(jìn)行硅膠柱（200～300目）色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（30 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、8 ∶ 1、6 ∶ 1、4 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合薄層色譜分析及合并相同組分后，得到Fr.1～Fr.35共35個組分，并對Fr.3、Fr.8、Fr.15、Fr.16這4個組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。其中，組分Fr.3進(jìn)一步用Sephadex-LH20柱色譜純化得到化合物2（16.1 mg）和化合物3（13.3 mg）;組分Fr.8進(jìn)一步用ODS反相柱色譜[甲醇（20%～100%）-水]純化得到化合物4（15.2 mg）和化合物5（14.5 mg）;組分Fr.15進(jìn)一步用ODS反相柱色譜[甲醇（20%～100%）-水]純化得到組分Fr.15-A～Fr.15-G，其中Fr.15-E經(jīng)制備型HPLC儀（58%甲醇-水）純化得到化合物8（13.6 mg）和化合物9（12.4 mg）;組分Fr.16進(jìn)一步用ODS反相柱色譜[甲醇（20%～100%）-水]純化得到組分Fr.16-A～Fr.16-H，其中組分Fr.16-C經(jīng)制備型HPLC儀（55%甲醇-水）純化得到化合物1（21.2 mg）、化合物6（11.8 mg）和化合物7（12.6 mg）。

2.2 小花清風(fēng)藤化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 化合物1 化合物1的分子式為C27H30O16，為黃色無定形粉末;鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性;電噴霧-質(zhì)譜（ESI-MS）m/z [M+H]+ 611.1;1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：12.59（1H，brs，5-OH），7.55（2H，overlapped，H-2′，H-6′），6.84（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.38（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.18（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.33（1H，d，J=7.4 Hz，HGlu-1），4.38（1H，d，J=1.0 Hz，HRha-1），0.98（3H，d，J=6.1 Hz，HRha-6）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：156.4（C-2），133.2（C-3），177.3（C-4），161.2（C-5），98.7（C-6），164.2（C-7），93.6（C-8），156.5（C-9），103.9（C-10），121.1（C-1′），115.2（C-2′），144.7（C-3′），148.4（C-4′），116.2（C-5′），121.5（C-6′），101.2（CGlu-1），74.0（CGlu-2），76.4（CGlu-3），70.5（CGlu-4），75.9（CGlu-5），66.9（CGlu-6），100.7（CRha-1），70.3（CRha-2），69.9（CRha-3），71.8（CRha-4），68.2（CRha-5），17.7（CRha-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道的基本一致，故鑒定化合物1為蘆丁，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.2 化合物2 化合物2的分子式為C26H42O4，為淡黃色油狀物;ESI-MS m/z [M+H]+ 419.3。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δH：0.89（9H，m），1.26（13H，m），1.69（2H，dd，J=12.2、6.1 Hz），4.11（2H，m），7.52（1H，dd，J=5.7、3.3 Hz），7.91（1H，dd，J=5.7、3.3 Hz）。13C-NMR（100 MHz，C5D5N）δC：11.1（C-17，C-26），14.3（C-16，C-25），23.1（C-11，C-20），24.1（C-13，C-22），29.3（C-15，C-24），30.1（C-12，C-21），32.1（C-10，C-19），39.1（C-14，C-23），68.2（C-9，C-18），129.3（C-3，C-6），131.5（C-1，C-2），133.2（C-4，C-5），168.0（C-7，C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道的基本一致，故鑒定化合物2為鄰苯二甲酸二異壬酯，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.3 化合物3 化合物3的分子式為C16H22O4，為無色油狀物;ESI-MS m/z [M+H]+ 279.1。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：7.73（2H，dd，J=5.3、3.4 Hz，H-3，H-6），7.68（2H，dd，J=5.7、3.8 Hz，H-4，H-5），4.22（4H，t，J=6.5 Hz，H-1′，H-1″），1.68（4H，m，H-2′，H-2″），1.42（4H，sextet，J=7.5 Hz，H-3′，H-3″），0.92（6H，t，J=7.4 Hz，H-4′，H-4″）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：166.9（COO-），166.9（COO-），131.6（C-1，C-2），131.5（C-4，C-5），128.6（C-3，C-6），65.0（C-1′，C-1″），29.9（C-2′，C-2″），18.6（C-3′，C-3″），13.5（C-4′，C-4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的基本一致，故鑒定化合物3為鄰苯二甲酸二丁酯，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.4 化合物4 化合物4的分子式為C13H20O3，為白色針晶;ESI-MS m/z [M+H]+ 225.1。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：5.87（1H，s，H-4），5.80（1H，m，H-7），5.79（1H，m，H-8），4.32（1H，m，H-9），2.46（1H，d，J=16.9 Hz，H-2a），2.18（1H，d，J=16.9 Hz，H-2b），1.91（3H，s，H-11），1.23（3H，s，H-10），1.04（3H，s，H-12），1.01（3H，s，H-13）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：42.4（C-1），50.8（C-2），201.2（C-3），127.1（C-4），167.4（C-5），80.0 （C-6），130.0（C-7），137.0（C-8），68.6（C-9），23.8 （C-10），19.6（C-11），23.5（C-12），24.5（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道的基本一致，故鑒定化合物4為吐葉醇，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.5 化合物5 化合物5的分子式為C11H17O2，為白色粉末;ESI-MS m/z [M+H]+ 182.1。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：1.17（3H，d，J=6.2 Hz），1.67（2H，m），2.53（2H，m），3.73（1H，m），6.68（2H，d，J=8.5 Hz），7.01（2H，d，J=8.5 Hz）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：23.5（C-1），67.9（C-2），42.4（C-3），32.3（C-4），134.5（C-1′），130.2（C-2′，C-6′），116.1（C-3′，C-5′），156.3（C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道的基本一致，故鑒定化合物5為杜鵑醇，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.6 化合物6 化合物6的分子式為C27H30O17，為黃色無定形粉末;鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性;ESI-MS m/z [M+H]+ 627.1。1H-NMR（N5D5-d6，400 MHz）δH：8.40（1H，d，J=2.2 Hz，H-2′），8.12（1H，dd，J=2.2、8.4 Hz，H-6′），7.32（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.65（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.63（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.03（1H，d，J=7.4 Hz，HGlu-1′），4.96（1H，d，J=7.8 Hz，HGlu-1″）。13C-NMR（N5D5-d6，100 MHz）δC：157.7（C-2），135.3（C-3），178.6（C-4），162.7（C-5），99.8（C-6），165.9（C-7），94.6（C-8），158.3（C-9），105.4（C-10），123.0（C-1′），116.3（C-2′），146.7（C-3′），150.7（C-4′），118.0（C-5′），122.5（C-6′），105.2（CGlu-1′），75.9（CGlu-2′），78.6（CGlu-3′），71.4（CGlu-4′），78.3（CGlu-5′），70.1（CGlu-6′），104.2（CGlu-1″），75.2（CGlu-2″），78.2（CGlu-3″），71.3（CGlu-4″），77.8（CGlu-5″），62.5（CGlu-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道的基本一致，故鑒定化合物6為槲皮素-3-O-龍膽雙糖苷，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.7 化合物7 化合物7的分子式為C28H32O16，為黃色無定形粉末;鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性;ESI-MS m/z [M+H]+ 625.2。1H-NMR（N5D5-d6，400 MHz）δH：8.39（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.91（1H，dd，J=2.0、8.4 Hz，H-6′），7.29（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.67（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），3.89（1H，s，3′-OCH3），6.27（1H，d，J=7.5 Hz，HGlu-1），4.38（1H，d，J=1.2 Hz，HRha-1），1.48（3H，d，J=5.6 Hz，HRha-6）。13C-NMR（N5D5-d6，100 MHz）δC：158.1（C-2），135.4（C-3），179.1（C-4），163.2（C-5），100.3（C-6），166.4（C-7），95.1（C-8），158.2（C-9），105.8（C-10），123.4（C-1′），114.8（C-2′），148.5（C-3′），151.7（C-4′），116.8（C-5′），122.5（C-6′），56.5（3′-OCH3），104.5（CGlu-1），76.6（CGlu-2），79.0（CGlu-3），73.1（CGlu-4），78.1（CGlu-5），68.7（CGlu-6），103.1（CRha-1），72.6（CRha-2），72.1（CRha-3），74.3（CRha-4），70.1（CRha-5），18.9（CRha-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道的基本一致，故鑒定化合物7為水仙苷，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.8 化合物8 化合物8的分子式為C27H30O15，為黃色無定形粉末;鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性;ESI-MS m/z [M+H]+ 595.2。1H-NMR（N5D5-d6，400 MHz）δH：8.45（2H，dd，J=1.9、6.9 Hz，H-2′，H-6′），7.29（1H，d，J=1.9、6.9 Hz，H-3′，H-5′），6.70（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.68（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.06（1H，d，J=7.4 Hz，HGlu-1），5.29（1H，d，J=1.0 Hz，HRha-1），1.49（3H，d，J=5.6 Hz，HRha-6）。13C-NMR （N5D5-d6，100 MHz）δC：158.2（C-2），132.4（C-3），179.1（C-4），162.2（C-5），100.3（C-6），166.4（C-7），95.1（C-8），163.2（C-9），105.7（C-10），122.4（C-1′），132.4（C-2′），116.6（C-3′），158.5（C-4′），116.6（C-5′），132.4（C-6′），105.1（CGlu-1），76.5（CGlu-2），79.1（CGlu-3），73.1（CGlu-4），77.9（CGlu-5），68.9 （CGlu-6），103.0（CRha-1），71.9（CRha-2），72.6（CRha-3），74.4（CRha-4），70.1（CRha-5），18.9（CRha-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道的基本一致，故鑒定化合物8為山柰酚-3-O-蕓香糖苷，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2.9 化合物9 化合物9的分子式為C40H77NO10，為白色粉末;ESI-MS m/z [M+H]+ 732.5。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：4.05（1H，dd，J=10.5、6.3 Hz），3.78（1H，dd，J=10.5、3.4 Hz），4.26（1H，ddd，J=5.8、4.0、3.5 Hz），3.57（1H，dd，J=6.4、6.0 Hz），4.28（1H，d，J=7.8 Hz），5.35（1H，m），5.42（1H，m），0.87（1H，t，J=7.0 Hz），0.87（1H，t，J=7.0 Hz）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：69.9（C-1），51.6（C-2），75.6（C-3），72.8（C-4），32.8（C-5），30.5（C-6），30.8（C-7），30.8（C-8），30.8（C-9），30.5（C-10），30.6（C-11），73.0（C-12），30.7（C-13），30.3（C-14），30.7（C-15），33.1（C-16），23.7（C-17），14.4（C-18），104.7（CGlu-1），75.0（CGlu-2），77.9（CGlu-3），71.6（CGlu-4），78.0（CGlu-5），62.6（CGlu-6），177.1（C-1″），35.7（C-2″），26.1（C-3″），30.8（C-4″），30.8（C-5″），30.8（C-6″），30.8（C-7″），27.2（C-8″），131.4（C-9″），131.6（C-10″），26.1（C-11″），30.7（C-12″），30.7（C-13″），33.1（C-14″），23.7（C-15″），14.4 （C-16″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道的基本一致，故鑒定化合物9為bonaroside，其結(jié)構(gòu)見圖1。

2.3 化合物1～9的抗氧化活性初步評價

2.3.1 溶液的制備 （1）樣品溶液：分別精密稱取受試化合物5.0 mg，以無水乙醇溶解并定容至5 mL量瓶中，得到各受試化合物質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的貯備液;取上述貯備液，分別用無水乙醇稀釋，制備成各化合物質(zhì)量濃度分別為160、80、40、20、10、5 μg/mL的樣品溶液，備用。（2）陽性對照品溶液：精密稱取維生素C粉末25 mg，用無水乙醇制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的陽性對照品貯備液;取上述貯備液，用無水乙醇稀釋并制成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 mg/mL的陽性對照品溶液，備用。

2.3.2 抗氧化活性評價 （1）DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定：參考文獻(xiàn)[16]方法并加以改進(jìn)后進(jìn)行測定。在試管中依次加入0.2 mL樣品溶液（或陽性對照品溶液）和0.2 mmol/L的DPPH工作液（以無水乙醇制備）4 mL，常溫避光反應(yīng)30 min，作為樣品管;對照管以水代替樣品溶液，同法操作。以0.2 mL水與4 mL無水乙醇混合作為空白對照進(jìn)行調(diào)零，在517 nm波長下測定各溶液的吸光度（A），并計算DPPH·清除率：DPPH·清除率（%）=（1-樣品管A/對照管A）×100%。（2）ABTS自由基（ABTS+）清除能力測定：參考文獻(xiàn)[17]方法并加以改進(jìn)后進(jìn)行測定。在試管中依次加入0.1 mL樣品溶液（或陽性對照品溶液）和6 mL ABTS+工作液，常溫避光反應(yīng)10 min，作為樣品管;對照管以水代替樣品溶液，同法操作。以0.1 mL水與6 mL無水乙醇混合作為空白對照進(jìn)行調(diào)零，在734 nm波長處測定各溶液的A，并計算ABTS+清除率：ABTS+清除率（%）=（1-樣品管A/對照管A）×100%。（3）OH自由基（OH·）清除能力測定：參考文獻(xiàn)[18]方法并加以改進(jìn)后進(jìn)行測定。在試管中依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵0.5 mL、9 mmol/L水楊酸0.5 mL、樣品溶液（或陽性對照品溶液）2 mL、水4 mL以及8.8 mmol/L過氧化氫溶液 0.5 mL，搖勻，在37 ℃水浴加熱15 min后取出，作為樣品管;對照管以水代替過氧化氫溶液，同法操作;空白對照管以2 mL無水乙醇替代樣品溶液，同法操作。在510 nm波長下測定各溶液的A，并計算OH·清除率：OH·清除率（%）=1-[（樣品管A-空白對照管A）/對照管A]×100%。采用GraphPad Prism 5軟件計算各化合物對以上3種自由基的半數(shù)清除濃度（IC50），結(jié)果見表1。

由表1可知，小花青風(fēng)藤70%乙醇提取物中分離、鑒定出的9個單體化合物對DPPH·、ABST+和OH·均表現(xiàn)出一定的清除能力。其中，化合物2、3的抗氧化活性較弱，對3種自由基的IC50均大于100 μg/mL;化合物1、6、7、8的抗氧化活性相對較強(qiáng)，對3種自由基的IC50均小于70 μg/mL。

3 討論

從中藥次生代謝產(chǎn)物中探尋天然抗氧化活性成分已成為人工合成新的抗氧化試劑的重要途徑[19]。目前，已從小花清風(fēng)藤中分離、鑒定出的化學(xué)成分有生物堿類、黃酮類及萜類等。其中，生物堿成分種類較多，包括吡咯類生物堿、芐基四氫異喹啉類生物堿、苯酞類四氫異喹啉類生物堿、阿樸菲堿類生物堿、普羅托品類生物堿及其他類生物堿，這些成分多具有抗腫瘤、抗病毒及抗炎等生物活性[20-21]。最新研究報道了小花清風(fēng)藤藥材的指紋圖譜與其抗氧化活性的譜效關(guān)系，證實(shí)了小花清風(fēng)藤中含有豐富的黃酮類成分，且具有自由基清除活性[22]。為進(jìn)一步確定小花清風(fēng)藤中抗氧化活性成分，本研究系統(tǒng)地提取、分離了小花清風(fēng)藤中化學(xué)成分，并進(jìn)行了體外抗氧化活性研究。

從黃酮類、酚類及揮發(fā)油等次生代謝產(chǎn)物中篩選出較強(qiáng)的抗氧化活性成分，從而獲得天然抗氧化試劑已成為研究熱點(diǎn)[23-25]。本研究從小花清風(fēng)藤的70%乙醇提取物中分離、鑒定出9個化合物，包括4個黃酮類化合物、1個萜類化合物、1個酚類化合物、1個酰胺類化合物和2個苯甲酸酯類化合物。根據(jù)已有研究，本研究所得到的黃酮類化合物具有抑菌、清除自由基、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等活性[26-28]，萜類化合物具有免疫抑制活性[29]，酰胺類化合物具有黃嘌呤氧化酶抑制活性[15]。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物1～9均具有一定的體外抗氧化活性。其中，黃酮類化合物1、6、7、8的體外抗氧化活性優(yōu)于其他幾個化合物，對DPPH·、ABTS+和OH·的IC50均小于70 μg/mL;特別是化合物6，其對上述3種自由基的IC50均小于45 μg/mL，具有一定的研究意義。

綜上所述，本研究從小花清風(fēng)藤70%乙醇提取物中共分離、鑒定出9個化合物，主要以黃酮類化合物為主。其中，化合物4、5、9首次從清風(fēng)藤屬植物中分離得到，化合物1、6、7、8表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。本課題組后期將以抗氧化活性為導(dǎo)向，進(jìn)一步對小花清風(fēng)藤的化學(xué)成分進(jìn)行分離、鑒定，并對黃酮類化合物進(jìn)行富集、分離，然后結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，篩選抗氧化作用強(qiáng)的有效成分，并進(jìn)一步研究小花清風(fēng)藤的抗氧化作用機(jī)制。

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（收稿日期：2021-10-05 修回日期：2022-01-13）

（編輯：林 靜）

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