蘆竹莖對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析

孫源長(zhǎng)，羅 琳，林 輝，林冬梅，林占熺

(福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002)

【研究意義】隨著全球人口的急劇增長(zhǎng)以及科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對(duì)能源的需求量逐漸增大。石油和煤炭等不可再生能源日益減少，因此迫切需要開發(fā)利用可再生能源，而生物質(zhì)能是其重要組成部分。目前,一些作物和生物量較大的植物作為生物能源被廣泛應(yīng)用，但這兩者競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，不適合一起種植在耕地中，將適應(yīng)能力強(qiáng)、生物量大的植物種植到鹽漬地等生長(zhǎng)環(huán)境惡劣的區(qū)域是很好的選擇。最近，研究表明全球超過10×108hm2的土地受鹽分影響，約占地球陸地表面的7%，并且還在持續(xù)蔓延。近期研究結(jié)果表明，伊朗西北部水土流失和鹽漬化問題嚴(yán)重[1]，而亞洲(中國、印度、巴基斯坦)、美洲(美國)、非洲(南非)等地的土壤鹽含量也嚴(yán)重超標(biāo)[2]。土壤鹽分是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育最嚴(yán)重的非生物脅迫之一，鹽度主要以兩種方式影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。滲透脅迫是在高濃度鹽環(huán)境下根表面的水勢(shì)降低，導(dǎo)致植物吸水量減少，擾亂植物的正常生命過程；離子脅迫是植物細(xì)胞內(nèi) Na+/ K+的失衡引起的，許多生化反應(yīng)將不能進(jìn)行[3-4]。蘆竹又稱“荻蘆竹”，為禾本科蘆竹亞科蘆竹屬的多年生草本植物，已在亞洲、南歐和北非等地種植上千年，能夠適應(yīng)各種不同環(huán)境，在溫帶地區(qū)可以長(zhǎng)期在寒冷、鹽堿、干旱和澇漬等條件下生存而不會(huì)造成重大損失[5-7]。這種植物能夠耐受鹽脅迫，在高鹽度下仍保持較高的光合作用和生物量，不會(huì)對(duì)光化學(xué)反應(yīng)以及葉片結(jié)構(gòu)和完整性造成較大損傷[8]。因此，探究蘆竹莖的鹽響應(yīng)方式，鑒定出參與鹽響應(yīng)的重要基因，對(duì)未來分子育種，提高植物耐鹽性，減輕能源壓力具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動(dòng)物可以移動(dòng)遷徙來應(yīng)對(duì)即將和已經(jīng)發(fā)生的脅迫，而植物卻只能通過調(diào)節(jié)自身狀態(tài)來應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化[9]。自身狀態(tài)的調(diào)節(jié)主要是通過基因的表達(dá)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)，并且這種表達(dá)調(diào)控是動(dòng)態(tài)的。為應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中產(chǎn)生了多種自我保護(hù)和防御機(jī)制。例如當(dāng)環(huán)境發(fā)生劇烈變化時(shí)，植物會(huì)調(diào)整一系列信號(hào)通路，來提高自身生存率[10-11]；通過關(guān)閉氣孔來調(diào)節(jié)葉片的光合過程[10]；通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)消除多余的活性氧，維持體內(nèi)氧化還原平衡[10-11]；通過細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)改變細(xì)胞內(nèi)水勢(shì)，維持一定的滲透壓，從而保護(hù)植物在鹽脅迫下的持續(xù)生長(zhǎng)[10]；植物激素通過協(xié)同或拮抗作用來調(diào)節(jié)自身[12]；轉(zhuǎn)錄因子(TF)與啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[13]。同樣，蘆竹主要也是通過這些方式來減輕外界不利環(huán)境對(duì)自身的影響。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于蘆竹鹽響應(yīng)的相關(guān)研究并不多，所以迫切需要對(duì)其進(jìn)行深入研究以豐富蘆竹的耐鹽基因資源，為未來的分子育種奠定基礎(chǔ)。RNA測(cè)序 (RNA-Seq) 一直是研究應(yīng)激耐受分子機(jī)制的有效方法，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[14-18]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以不同濃度NaCl鹽溶液處理的“綠洲1號(hào)”蘆竹的莖為材料，利用RNA-seq手段分析，探究蘆竹莖的鹽響應(yīng)方式，鑒定出參與鹽響應(yīng)的重要基因，進(jìn)一步加深對(duì)蘆竹耐鹽分子機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心選取生長(zhǎng)6個(gè)月并且長(zhǎng)勢(shì)一致的“綠洲1號(hào)”蘆竹(原產(chǎn)地：萊索托)組培幼苗，之后移栽到溫室(在30 ℃/25 ℃以14 h光照/10 h黑暗的光周期生長(zhǎng)，濕度為60%，光照強(qiáng)度為350 μmol/(m2·s)并用1/5霍格蘭營養(yǎng)液水培1個(gè)月進(jìn)行緩苗，之后分別用0、50、100、150和200 mmol/L NaCl鹽濃度溶液處理，處理時(shí)間為36 h。

1.2 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

分別收集不同NaCl鹽濃度溶液處理后的“綠洲1號(hào)”莖，每個(gè)重復(fù)由2～4株蘆竹自下往上數(shù)第1～8節(jié)混合獲取，共3次重復(fù)。樣品用液氮研磨成粉末狀混勻。

稱取樣品粉末0.2 g，用Trizol試劑提取莖的總RNA。取2 μL RNA在1%瓊脂糖凝膠上初步評(píng)估RNA降解程度及污染情況。通過Nano Drop 2000?分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度與濃度。使用Agilent2100(Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。對(duì)合格的樣品委托諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。簡(jiǎn)要流程如下：用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA。之后進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終文庫。對(duì)合格的樣本在Illumina Novaseq 6000平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序，讀長(zhǎng)為150 bp。

表1 用于qPCR反應(yīng)的引物

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制與組裝

為了得到更加完整的轉(zhuǎn)錄本，此次組裝額外使用了本實(shí)驗(yàn)室同一品種的15個(gè)葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)(Raw reads)由FastQC(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。任何低質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)和接頭序列均通過Trimmomatic[19]軟件過濾，最終得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Clean data)。使用Trinity-v2.13.2[20]軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，利用CD-HIT[21]軟件去冗余(相似性設(shè)置為0.95)得到最終單基因簇(Unigenes)序列。

1.4 基因表達(dá)定量和差異表達(dá)分析

使用Bowtie2和RSEM對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)定量[22-23]。在R中使用DESeq2[24]進(jìn)行差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)的檢測(cè)。DEGs的過濾標(biāo)準(zhǔn)是|log2FoldChange|≥1并且P≤ 0.05。

1.5 GO和KEGG富集分析

使用clusterProfiler[25]R包對(duì)DEGs進(jìn)行GO與KEGG富集分析。參數(shù)設(shè)置為校正后的P<0.05, Unigene的注釋來源為eggNOG5.0[26]數(shù)據(jù)庫。

1.6 轉(zhuǎn)錄因子鑒定

所有差異表達(dá)基因均通過iTAK(v1.6)[27](http://itak.feilab.net/cgi-bin/itak/online_itak.cgi)在線程序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)，比對(duì)類型為核酸序列。

1.7 基因的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是否可靠。根據(jù)Michele等[28]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取較為穩(wěn)定的RPN6基因作為內(nèi)參基因，所有基因通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，qPCR引物見表1。使用TransScript?Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qPCR反應(yīng)根據(jù)PerfectStart?Green qPCR SuperMIX試劑盒說明書進(jìn)行。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[29]，用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的組裝結(jié)果

使用Trinity[20]軟件對(duì)Clean data進(jìn)行De novo組裝，共產(chǎn)生971 309個(gè)轉(zhuǎn)錄本，GC含量為47.14%。對(duì)組裝后的結(jié)果文件用CD-HIT[21]軟件去冗余，得到最終的Unigenes。Transcript contigs的N30達(dá)到2053 bp, N50達(dá)到1228 bp，contig 平均長(zhǎng)度為823.47 bp；Unigene contigs的N30達(dá)到1915 bp, N50達(dá)到1126 bp，contig平均長(zhǎng)度為769.52 bp。轉(zhuǎn)錄本和基因的長(zhǎng)度數(shù)量分布統(tǒng)計(jì)情況見圖1。以上結(jié)果表明此次轉(zhuǎn)錄本組裝效果優(yōu)良，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 轉(zhuǎn)錄本和單基因簇長(zhǎng)度數(shù)量分布統(tǒng)計(jì)Fig.1 Length and number distribution statistics of transcripts and unigenes

2.2 不同鹽濃度脅迫下的基因表達(dá)量化和差異表達(dá)分析

在R中通過 DESeq2包分析“綠洲1號(hào)”響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)基因。在葉片中檢測(cè)到的差異表達(dá)基因?yàn)?305個(gè)，其數(shù)量分布情況見圖2。隨著鹽濃度的增加，上調(diào)差異表達(dá)基因、下調(diào)差異表達(dá)基因與總的差異表達(dá)基因的數(shù)量都逐漸增加。上調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目始終大于下調(diào)的差異表達(dá)基因數(shù)目。以上結(jié)果表明“綠洲1號(hào)”莖在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，隨著鹽濃度的增加其調(diào)控過程越來越復(fù)雜，并且主要通過基因的上調(diào)起作用。

圖2 不同鹽濃度下莖差異表達(dá)基因的數(shù)目Fig.2 Number of differentially expressed genes in stems under different salt concentrations

由圖3可知，在莖中有104個(gè)基因是不同濃度鹽處理下的差異表達(dá)基因所共有的，將它們作為蘆竹鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因。隨著鹽濃度的增加，各個(gè)組別中特有的差異表達(dá)基因數(shù)目也逐漸增加。stem_CK_vs_50 mmol/L到stem_CK_vs_100 mmol/L、stem_CK_vs_150 mmol/L、stem_CK_vs_200 mmol/L的特異性差異表達(dá)基因數(shù)目分別從111個(gè)上升到292、1141、3347個(gè)。這可能是由于隨著脅迫程度的加深，越來越多特定的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制被激活。以上結(jié)果表明莖存在一些較為保守的基因來響應(yīng)鹽脅迫，并且隨著鹽濃度的增加越來越多的特異性差異表達(dá)基因參與到表達(dá)調(diào)控中來。

圖3 不同鹽濃度下莖差異表達(dá)基因的Venn圖Fig.3 Venn plot of differentially expressed genes in stems under different salt concentrations

2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

由圖4可知，在蘆竹莖響應(yīng)鹽脅迫過程中，50 mmol/L 鹽濃度下差異表達(dá)基因主要富集到鉀離子穩(wěn)態(tài)、硝酸鹽響應(yīng)、細(xì)胞壁修飾、水楊酸合成相關(guān)條目。100 mmol/L 鹽濃度下，臭氧、泛素化、滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)條目富集到的基因數(shù)目最多。150 mmol/L鹽濃度下富集到對(duì)硝酸鹽、無機(jī)陰離子、光形態(tài)、端粒酶活性等條目。與150 mmol/L鹽濃度下富集結(jié)果類似，200 mmol/L鹽濃度下除了富集到無機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目還富集到與水響應(yīng)、光反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的條目。

圖4 莖中差異表達(dá)基因的GO富集Fig.4 GO enrichment of differentially expressed genes in stems

由圖5可知，在莖中，50 mmol/L鹽濃度只富集到了單萜生物合成途徑；而100、150和200 mmol/L鹽濃度富集到氮代謝、晝夜節(jié)律、萜類合成、玉米素合成和維生素B6代謝等通路。

圖5 莖中差異表達(dá)基因的KEGG富集Fig.5 KEGG enrichment of differentially expressed genes in stems

2.4 鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因分析

由圖6可知，在蘆竹莖中大部分鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因上調(diào)，只有少數(shù)基因下調(diào)；并且與下調(diào)基因相比上調(diào)基因的差異倍數(shù)更大。說明蘆竹響應(yīng)鹽脅迫主要是通過基因上調(diào)起作用,并且上調(diào)基因的反應(yīng)更加強(qiáng)烈。在莖中88315_c0_g1_i1、1200_c2_g1_i1、13330_c0_g1_i8、46571_c0_g1_i7、3434_c0_g1_i11和713_c0_g1_i32的差異倍數(shù)最大。這些基因在“綠洲1號(hào)”莖基礎(chǔ)鹽響應(yīng)過程中發(fā)揮極其重要的作用，注釋的具體情況見表2。

圖6 莖中核心差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)分析Fig.6 Fold analysis of core genes expression differences in stems based on log2FoldChange

表2 莖中重要的鹽響應(yīng)核心差異表達(dá)基因

2.5 轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

對(duì)莖參與鹽響應(yīng)表達(dá)調(diào)控的差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，一共預(yù)測(cè)到41個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，家族成員數(shù)目最多的是AP2/ERF-ERF家族，共94個(gè)；其次是MYB-related家族和WRKY家族，家族成員分別為65、57個(gè)(圖7)。

圖7 莖中差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)數(shù)目Fig.7 Predicted numbers of transcription factors of differentially expressed genes in stems

為探究AP2/ERF-ERF、MYB-related和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的表達(dá)模式，對(duì)其基因表達(dá)差異倍數(shù)進(jìn)行分析，AP2/ERF-ERF的log2FoldChange在-1.85～10.88；MYB-related的log2FoldChange在-3.00～7.85；WRKY的log2FoldChange在-1.58～6.13。并且這3類轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)大部分呈上調(diào)狀態(tài)，說明其主要通過增加基因的表達(dá)起作用(圖8)。

A：AP2/ERF-ERF；B：MYB-related；C：WRKY圖8 轉(zhuǎn)錄因子家族的差異倍數(shù)分析Fig.8 Fold analysis of transcription factor families in stems based on log2FoldChange

對(duì)前8個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)較大的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析(表3)，AP2/ERF-ERF、MYB-related和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族差異倍數(shù)最大的轉(zhuǎn)錄因子分別為：18947_c0_g1_i3、7562_c1_g1_i2和24870_c0_g1_i2，平均log2FoldChange達(dá)到7.88、5.81和5.28,它們?cè)谔J竹響應(yīng)鹽脅迫時(shí)可能發(fā)揮著重要作用。

表3 差異表達(dá)倍數(shù)較大的轉(zhuǎn)錄因子

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑選5個(gè)差異表達(dá)基因?qū)D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，可以看出這些基因的相對(duì)表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因表達(dá)模式基本一致(圖9)，也說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較為可靠。

左側(cè)縱坐標(biāo)為qPCR相對(duì)表達(dá)量，右側(cè)縱坐標(biāo)為TPM值。A：13361_c0_g1_i15；B: 14873_c0_g1_i6；C: 70740_c0_g1_i2；D: 129260_c0_g2_i1；E：122017_c0_g1_i1The left ordinate is the relative expression level of qPCR, and the right ordinate is the TPM value. A: 13361_c0_g1_i15; B: 14873_c0_g1_i6; C: 70740_c0_g1_i2; D: 129260_c0_g2_i1; E: 122017_c0_g1_i1圖9 差異表達(dá)基因qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.9 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes

3 討 論

如果為植物提供如光照、溫度和水分等適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，植物就會(huì)相對(duì)高產(chǎn)，反之有可能導(dǎo)致植物發(fā)育不良甚至死亡。而產(chǎn)量與植物發(fā)育過程中的非生物脅迫條件呈負(fù)相關(guān)[30]。在全球范圍內(nèi)，由于非生物脅迫(干旱、鹽漬、洪水、霜凍、營養(yǎng)缺乏等因素)導(dǎo)致的損失估計(jì)為每年1.2×1011美元[31](http://www.fao.org/docrep/008/y5800e/Y5800E06.htm)。鹽脅迫是降低作物產(chǎn)量最重要的非生物脅迫之一，因此，對(duì)植物進(jìn)行鹽脅迫的相關(guān)研究將有利于篩選出耐鹽的關(guān)鍵基因，對(duì)提高植物的耐鹽性和產(chǎn)量具有重要意義。蘆竹具有較強(qiáng)的抗逆性，能夠在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)以“綠洲1號(hào)”蘆竹的莖為材料，使用不同濃度的NaCl鹽溶液進(jìn)行處理，利用RNA-seq手段分析蘆竹莖的鹽響應(yīng)方式，鑒定出重要的鹽響應(yīng)相關(guān)基因，為以后的遺傳改良提供指導(dǎo)。

3.1 蘆竹鹽響應(yīng)不同鹽環(huán)境的轉(zhuǎn)錄差異

本研究共檢測(cè)到7305個(gè)鹽脅迫差異表達(dá)基因，隨著鹽溶液濃度的增加,差異表達(dá)基因的數(shù)目也相繼增加，并且越來越多的特異性差異表達(dá)基因參與到表達(dá)調(diào)控中來。以上結(jié)果表明不同濃度的鹽環(huán)境均可誘導(dǎo)大量的基因來響應(yīng)鹽脅迫，隨著濃度的增加表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜程度也可能隨之上升。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析，與代謝產(chǎn)物相關(guān)的條目主要富集到與萜類合成、玉米素合成、亞油酸代謝和水楊酸生物合成途徑，這些代謝物質(zhì)作為調(diào)節(jié)劑在植物應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用[32-34]，對(duì)提高蘆竹的鹽耐受性有重要作用。無論從低鹽還是高鹽環(huán)境都富集到與萜類合成相關(guān)的條目，可以推測(cè)蘆竹能通過快速調(diào)節(jié)萜類化合物合成來應(yīng)對(duì)鹽環(huán)境的變化。富集到鉀離子穩(wěn)態(tài)、與細(xì)胞壁相關(guān)[35]、調(diào)節(jié)對(duì)滲透壓的反應(yīng)、對(duì)鹽脅迫反應(yīng)的正調(diào)節(jié)、應(yīng)對(duì)缺水的正調(diào)控、無機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸根離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等條目，將對(duì)蘆竹感應(yīng)鹽脅迫、維持細(xì)胞的滲透壓穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路有所幫助。在鹽濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，即較高鹽環(huán)境下，還富集到了維生素B6代謝途徑。維生素B6近些年來被廣泛研究，它是多種代謝酶的必需輔酶，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫等一系列過程。它還是一種有效的抗氧化劑，研究表明維生素B6在植物體內(nèi)抗氧化防御中具有作用，在強(qiáng)光下限制1O2積累并防止1O2介導(dǎo)的氧化損傷[36]。

3.2 蘆竹鹽響應(yīng)過程中的關(guān)鍵基因

共篩選到104個(gè)鹽響應(yīng)的核心差異表達(dá)基因，其中大部分基因上調(diào)，只有少數(shù)基因下調(diào)，說明這些基因主要是通過增加表達(dá)量來響應(yīng)鹽脅迫。對(duì)其中差異倍數(shù)最大的基因進(jìn)行注釋，其中GATL1編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，有助于木聚糖的生物合成。此外，植物糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑻翘砑拥叫》肿又?，例如植物激素[37]、水楊酸[38]和類黃酮[39]。而木聚糖與細(xì)胞壁合成相關(guān)，細(xì)胞壁參與了鹽分脅迫的感知和響應(yīng)，對(duì)于細(xì)胞的壓力保護(hù)和反應(yīng)都至關(guān)重要；CRF4是ERF/AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族，之前的研究表明它在響應(yīng)非生物脅迫中起著重要作用[40]；SF3B5A編碼剪接因子3B亞基5/RDS3復(fù)合亞基，在選擇性剪接中起作用；SYR1為系統(tǒng)素受體，主要位于質(zhì)膜上，有助于植物防御過程中系統(tǒng)素介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[41]。

3.3 蘆竹鹽響應(yīng)過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子

植物編碼大量轉(zhuǎn)錄因子，它們主要按照 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類[42]。越來越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)多種生物過程，例如各種生物及非生物脅迫、光和壓力信號(hào)、種子成熟和花發(fā)育等[43]。目前已經(jīng)鑒定到了一系列的轉(zhuǎn)錄因子家族在鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，例如bZIP、AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、NAC和bHLH等[44]。

為篩選出在蘆竹鹽響應(yīng)過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，本實(shí)驗(yàn)對(duì)差異基因進(jìn)行研究，共注釋到41個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，推測(cè)它們可能在蘆竹對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)中起重要作用，其中成員數(shù)目最多的包括AP2/ERF-ERF、MYB-related和WRKY家族。AP2/ERF-ERF家族是植物所特有的一類基因家族，該家族中的每一個(gè)成員都具有單個(gè)或2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期和生物及非生物脅迫過程，廣泛參與脫落酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素等信號(hào)通路。MYB-related家族是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù) DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相鄰重復(fù)的數(shù)量可分為四大類，在植物的發(fā)育和脅迫反應(yīng)中起重要作用[45]。WRKY家族是調(diào)節(jié)植物生物過程信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，通常作為抑制因子和激活因子發(fā)揮作用，在調(diào)節(jié)植物的許多脅迫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。例如，在水稻中，熱休克誘導(dǎo)型HSP101啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的OsWRKY11過表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致耐熱和耐旱性增強(qiáng)[46]。同樣，OsWRKY45的過表達(dá)除了提高抗病性外，還導(dǎo)致耐鹽性和耐旱性增強(qiáng)[47]。此外，NAC、bZIP、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子家族也在本研究中被發(fā)現(xiàn)，這與前人的研究一致，并且這些轉(zhuǎn)錄因子絕大部分通過上調(diào)表達(dá)量來響應(yīng)鹽脅迫。以上結(jié)果表明AP2/ERF-ERF、MYB-related和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在“綠洲1號(hào)”蘆竹響應(yīng)鹽脅迫的過程中可能具有重要的調(diào)控功能。

4 結(jié) 論

對(duì)0、50、100、150和200 mmol/L NaCl鹽溶液進(jìn)行處理的“綠洲1號(hào)”蘆竹的莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析，共篩選到10個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)較大的基因和一些差異表達(dá)倍數(shù)較大的轉(zhuǎn)錄因子，它們可能在蘆竹響應(yīng)鹽脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究豐富了蘆竹的耐鹽基因資源，為分子育種提供了理想的改造靶點(diǎn)。