乙肝疫苗接種無(wú)應(yīng)答者免疫因素的研究進(jìn)展①

趙梅娥 張 慧 甄宏斌 黃煥源 王春霞 謝小冬（蘭州市第一人民醫(yī)院，蘭州 730000）

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的以肝臟炎癥性病變?yōu)橹鞯膫魅静?，可引起多器官損害，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。世界衛(wèi)生組織全球病毒性肝炎報(bào)告顯示，2015年全球范圍內(nèi)約2.57億人患有慢性HBV感染，約134萬(wàn)人因乙型病毒性肝炎死亡，且死亡人數(shù)逐年增加［1］。預(yù)防乙肝病毒感染傳統(tǒng)且有效的策略是接種乙肝疫苗，但健康人群按0、1、6個(gè)月常規(guī)接種程序接種三劑乙肝疫苗，仍有5%～10%接種者未產(chǎn)生乙肝病毒表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）或產(chǎn)生的抗-HBs滴度＜10 U/L而呈無(wú)應(yīng)答狀態(tài)［2-4］，還有部分接種者產(chǎn)生的抗-HBs滴度＜100 U/L，在體內(nèi)持續(xù)存在時(shí)間較短，呈低應(yīng)答狀態(tài)。既往HBV疫苗無(wú)應(yīng)答相關(guān)研究主要集中于疫苗因素、機(jī)體自身特征及環(huán)境特征、遺傳因素、免疫相關(guān)分子特征等方面，本文主要對(duì)HBV疫苗接種無(wú)應(yīng)答者的免疫相關(guān)遺傳因素及免疫細(xì)胞分子特征研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，旨在為HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 HBV疫苗誘導(dǎo)抗體形成的機(jī)制

目前我國(guó)普遍使用的重組HBV表面抗原由于僅含HBsAgS蛋白，免疫原性較弱，必須與免疫佐劑——明礬聯(lián)合使用。研究報(bào)道，明礬能夠延長(zhǎng)抗原在注射部位的存在時(shí)間，從而增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞攝取提呈能力［5-7］。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗-HBs的過(guò)程依賴于多重信號(hào)刺激，注射HBV疫苗后，樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被激活，捕獲抗原后遷移至近端淋巴結(jié)發(fā)育成熟并處理抗原，將HBsAg以肽-MHCⅡ復(fù)合物形式呈遞給T細(xì)胞，激活CD4+T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并分泌Th2細(xì)胞因子，從而激活B細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，分泌抗-HBs［8］。另外，BCR也可識(shí)別并結(jié)合抗原使B細(xì)胞共受體［BCR-CD79a/b（BCRIgα/β）和CD19/CD21/CD81］胞內(nèi)基序ITAM活化，B細(xì)胞活化后與Th細(xì)胞表面多對(duì)共刺激分子（如CD40/CD40L）相互作用，促進(jìn)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-21、IL-6等，進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體或分化為記憶性B細(xì)胞［9-10］。

2 HBV疫苗無(wú)應(yīng)答者的免疫因素

2.1 HLA對(duì)HBV疫苗免疫應(yīng)答的影響HLA，即人類白細(xì)胞抗原，其基因區(qū)域位于6號(hào)染色體短臂21.3區(qū)域，是3.6 Mb的高度多態(tài)性基因區(qū)域，含有270多個(gè)基因，其中幾乎一半為假基因或非編碼RNA。按編碼分子特性不同，這些基因可分為三類，即HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類及HLA-Ⅲ類［11］。其中，HLA-Ⅱ基因負(fù)責(zé)將外源抗原呈遞給CD4+Th細(xì)胞，由于多個(gè)HLA-Ⅱ基因變異與HBV疫苗接種、持續(xù)性HBV感染和自發(fā)性HBV清除有關(guān)而備受關(guān)注［12-15］。研究發(fā)現(xiàn)，HLA在決定疫苗免疫應(yīng)答強(qiáng)度中起關(guān)鍵作用，參與調(diào)節(jié)嬰幼兒及成人抗-HBs生成［16-18］。JAFARZADEH等［12］分 析 了HLA基 因 與HBV疫苗免疫應(yīng)答相關(guān)性的一系列研究，總結(jié)出HLA-Ⅰ類（HLA-A、B、C等）、HLA-Ⅱ類（HLA-DP、DR、DQ等）及HLA-Ⅲ類（c2、c4等）基因中存在調(diào)控HBV疫苗免疫應(yīng)答的基因，但在不同種族人群間不盡相同。幾項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示，HLA-Ⅱ基因與疫苗應(yīng)答有關(guān)，如位于HLA-DRBI基因上游12 kb的SNP（rs477515）是與中國(guó)漢族人群HBV疫苗無(wú)/低應(yīng)答相關(guān)的獨(dú)立標(biāo)記及HLA-DR區(qū)可能是HBV疫苗誘導(dǎo)免疫的關(guān)鍵易感位點(diǎn)［13］；位于與HLA-Ⅱ類區(qū)域相鄰的HLA-Ⅲ類基因富集區(qū)域中BTNL2基因（rs4248166、P55.51310212）與HBV疫苗應(yīng)答顯著相關(guān)，HLA-Ⅱ類等位基因DQB1*04：01、DPB1*05：01及3種DRB1-DQB1單體型（DRB1*04：05-DQB1*04：01，DRB1*08：03-DQB1*06：01、DRB1*14：06-DQB1*03：01）與日本人群HBV疫苗無(wú)/低應(yīng)答相關(guān)［4］。

2.2 輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞（Th）對(duì)HBV疫苗免疫應(yīng)答的影響

2.2.1 TCR克隆頻率 宋玉國(guó)等［19］報(bào)道，HBV疫苗無(wú)應(yīng)答組TCR Vβ基因（Vβ2、Vβ8、Vβ9、Vβ11和Vβ17）單克隆改變頻率明顯低于有應(yīng)答組，而無(wú)應(yīng)答者CD4+T細(xì)胞Vβ5S2-3基因單克隆改變頻率高于應(yīng)答者，且TCRVβ基因?qū)BsAg的反應(yīng)具有個(gè)體特異性。

2.2.2 Th1/Th2細(xì)胞的分子差異Th1/Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子差異可影響Th1/Th2平衡，最終控制疫苗接種應(yīng)答差異［20］。正常情況下，各亞群相互促進(jìn)、相互拮抗處于平衡狀態(tài)［21-22］。研究提示，HBV疫苗無(wú)應(yīng)答者HBsAg特異性Th1細(xì)胞缺少，或T細(xì)胞雖存在對(duì)HBsAg具有特異性的TCR但對(duì)HBsAg肽-MHC復(fù)合物無(wú)反應(yīng)［23-25］；Th1和/或Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-4缺乏而TGF-β增多［25-27］。此外，CD4+Th細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答需一些共刺激分子協(xié)同刺激才能充分啟動(dòng)，研究顯示，乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答者共刺激分子CD25、CD69、CD25/CTLA4、CD80/CD86、CD40/CD40L、CD54及其配體LFA-1（ITGAL和ITGB）、CD58和CD2表達(dá)降低［28-31］。

2.2.3 濾泡輔助T細(xì)胞（Tfh）對(duì)HBV疫苗免疫應(yīng)答的影響Tfh主要分泌轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴瘤6（Bcl-6）、IL-21和IL-6受體（IL-6R），通過(guò)控制生發(fā)中心形成和細(xì)胞增殖分化在B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞、產(chǎn)生抗體和Ig類別轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用，是輔助B細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，在體液免疫中起重要作用［21-22］。Tfh高表達(dá)CD44、CXCR5、ICOS、PD1、Bcl-6、IL-21、IL-6R，低表達(dá)CD62L、CCR7、PSGL1，Tfh發(fā)育依賴于IL-6、IL-21和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），而不依賴于其他已知對(duì)Th1、Th2或Th17細(xì)胞分化很重要的細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子［22］。Tfh與HBV疫苗免疫應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道較少。研究報(bào)道，HBV疫苗強(qiáng)應(yīng)答組Tfh表達(dá)ICOS增強(qiáng)和IL-21分泌增多［32］；慢性HBV患者外周血CD4+CXCR5+Tfh頻率顯著增高［33-34］；IL-21可增強(qiáng)HBV特異性CD8+T細(xì)胞的抗病毒作用，促使HBV病毒清除和HBeAg/抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換［35-36］，提示Tfh在抗HBV感染免疫應(yīng)答中起重要作用。

2.3 Treg在HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答中的特征Treg主要在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，對(duì)效應(yīng)細(xì)胞增殖、免疫活性發(fā)揮起抑制作用。SAKAGUCHI等［37］將Treg的功能歸納為免疫無(wú)能性和免疫抑制性。Treg不僅抑制CD8+T細(xì)胞增殖，且抑制其分泌細(xì)胞因子及殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Treg分泌TGF-β作用于CD8+效應(yīng)T細(xì)胞表面的Ⅱ型TGF-β受體，引起免疫抑制，同時(shí)，分泌的IL-10可抑制Th1和Th2細(xì)胞合成IL-2等細(xì)胞因子［38-39］。濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（follicular regulatory T cells，Tfr）是一類專門(mén)在生發(fā)中心調(diào)控GCB和Tfh細(xì)胞應(yīng)答的CD4+T細(xì)胞，來(lái)源于常規(guī)Treg，并同時(shí)兼具Tfh細(xì)胞表型特征（FOXP3+BCL6+CXCR5+Tfr）。葉麗林團(tuán)隊(duì)鑒定了mTORC1信號(hào)可在Treg磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT3，磷酸化后的STAT3啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子TCF-1生成，最終促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6產(chǎn)生，從而推動(dòng)Treg向Tfr分化，并最終通過(guò)調(diào)控生發(fā)中心反應(yīng)調(diào)節(jié)抗體生成［40］。但Treg在HBV疫苗無(wú)應(yīng)答反應(yīng)中的具體機(jī)制尚未明確。研究報(bào)道，HBV疫苗低/無(wú)應(yīng)答者體內(nèi)存在Treg過(guò)度表達(dá)，但這些Treg是否具有HBsAg特異性及如何引起機(jī)體對(duì)疫苗低反應(yīng)需進(jìn)一步研究［41］。楊燕等［42］研究發(fā)現(xiàn)，HBV疫苗無(wú)應(yīng)答者外周血Treg PD-1表達(dá)顯著高于應(yīng)答者，提示Treg可能通過(guò)PD-1/PD-L1途經(jīng)發(fā)揮抑制效應(yīng)。

2.4 B細(xì)胞功能障礙對(duì)HBV疫苗免疫應(yīng)答的影響B(tài)細(xì)胞不僅能通過(guò)產(chǎn)生抗體發(fā)揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原提呈細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)。另外，B細(xì)胞還表達(dá)多種含有ITIM的受體，這些受體招募負(fù)調(diào)節(jié)磷酸酶（如SHIP1和SHP1），抑制BCR信號(hào)［9-10］。VALATS等［43］研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答者分泌IgG型抗HBsAg抗體的細(xì)胞數(shù)明顯多于無(wú)應(yīng)答者，但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)自應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者的B淋巴細(xì)胞獲得漿細(xì)胞表型的能力相同。SALIMZADEH等［44］研究發(fā)現(xiàn)，急、慢性HBV感染者體內(nèi)存在一類功能障礙的HBsAg特異性B細(xì)胞，其特征為CD21和CD27低表達(dá)，但抑制性標(biāo)志物如PD-1和轉(zhuǎn)錄因子T-bet卻高表達(dá)。HBV疫苗低應(yīng)答者體內(nèi)是否也存在功能障礙的B細(xì)胞仍需要更深入的依據(jù)。

2.5 樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答的作用 VERKADE等［45］在對(duì)慢性腎病患者接種HBV疫苗后的無(wú)應(yīng)答者進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)應(yīng)答者體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞——單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，moDC）的成熟活化標(biāo)志MHCⅡ和CD83分子表達(dá)顯著低于應(yīng)答者，低活化的moDC影響抗原提呈，同時(shí)moDC刺激抗原特異性T細(xì)胞的能力也較應(yīng)答者下降，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)HBV抗原的低反應(yīng)性。而采用GM-CSF與乙肝抗原共同注射對(duì)HBV疫苗低應(yīng)答的B10.M小鼠，GM-CSF可通過(guò)募集和激活樹(shù)突狀細(xì)胞使小鼠產(chǎn)生高水平乙肝抗體，從另一方面證實(shí)HBV疫苗無(wú)應(yīng)答中樹(shù)突狀細(xì)胞發(fā)揮重要作用［46］。

2.6 CD8+T細(xì)胞在HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答中的免疫特征HBV疫苗不僅可引起體液免疫應(yīng)答，也會(huì)引起細(xì)胞免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞通常稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），主要通過(guò)兩種途徑發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，一種途徑是通過(guò)釋放細(xì)胞毒素，如穿孔素、顆粒酶及顆粒溶解素誘發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)，另一種途徑是通過(guò)CTL表面的FAS配體與目標(biāo)細(xì)胞FAS受體結(jié)合誘發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)［47］。病毒特異性長(zhǎng)壽CD8+T細(xì)胞在一些抗病毒疫苗（如黃熱病毒、登革熱病毒）引起的免疫應(yīng)答中扮演重要角色［48］，而有關(guān)HBV疫苗無(wú)應(yīng)答者CD8+T細(xì)胞的研究較少。WATANABE等［49］報(bào)道，CD8+T細(xì)胞影響無(wú)應(yīng)答者接種HBV疫苗后T細(xì)胞增殖并在HLABw54-DR4-DRw53-DQw4單體型決定的個(gè)體乙肝疫苗無(wú)應(yīng)答中發(fā)揮作用。NOWICKI等［50］發(fā)現(xiàn)無(wú)應(yīng)答者CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增多，而VINGERHOETS等［51］發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞未參與無(wú)應(yīng)答過(guò)程。

3 小結(jié)與展望

綜上，機(jī)體通過(guò)復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)正向和負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制限定抗原刺激產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)度、范圍、作用程度及持續(xù)時(shí)間。國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別從機(jī)體各類免疫細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞因子分泌、分子表達(dá)水平等方面與HBV疫苗免疫應(yīng)答強(qiáng)度的相關(guān)性進(jìn)行了大量研究，為研究HBV疫苗無(wú)應(yīng)答機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。但各研究采取的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法、方案和研究對(duì)象及數(shù)量不同，各類免疫細(xì)胞及其亞群在HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答中發(fā)揮的作用仍存在爭(zhēng)議，并缺乏深層次的功能性研究，HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答的分子機(jī)制仍是疫苗領(lǐng)域的空白。因此隨著分子生物學(xué)技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為進(jìn)一步闡明HBV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答的分子遺傳機(jī)制及開(kāi)發(fā)更有效的HBV疫苗，有必要在多組學(xué)領(lǐng)域?qū)BV疫苗免疫無(wú)應(yīng)答的機(jī)制進(jìn)行多中心大樣本量聯(lián)合研究，并對(duì)相關(guān)分子進(jìn)行功能驗(yàn)證。