常用中藥材鑒別方法的研究進(jìn)展*

李春華，陶靜雨，李玉虹，趙 燕，王京賢，王 婷，閆玉鑫

(云南師范大學(xué) 職業(yè)技術(shù)教育學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，云南 昆明 650092)

中藥主要來源于天然藥及其加工品，包括植物藥、動物藥、礦物藥及部分化學(xué)、生物制品類藥物。我國中藥應(yīng)用歷史悠久，資源豐富，種類繁多，來源復(fù)雜，品種易混淆，存在問題頗多，如一藥多種來源，本末難分;形態(tài)相似的藥材，可能造成誤收、誤用等。近年來，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，加上我國中藥種類繁多，且各自形態(tài)特征差異不明顯，時(shí)常發(fā)現(xiàn)以次充好、以假充真的現(xiàn)象，使得準(zhǔn)確鑒定藥材困難，容易導(dǎo)致市場用藥品種混亂。2020年，國家藥品抽檢在全國范圍內(nèi)共抽取8個中藥飲片品種，分別為：廣藿香、制川烏、巴戟天、秦艽、射干、前胡、紅景天和黃精?？偣?368批次檢驗(yàn)樣品，其中不合格樣品30批，不合格率為2.19%;其中，性狀項(xiàng)不符合規(guī)定的有23批(1.68%)，薄層鑒別項(xiàng)不符合規(guī)定的4批(0.29%)[1]。董麗榮等[2]對昆明市近5年內(nèi)中藥飲片及中藥材的抽驗(yàn)，共抽驗(yàn)中藥材及飲片1556批，不合格152批次，其中有58批性狀不合格，39批鑒別項(xiàng)不合格，60批有含量測定不合格。如果不能正確鑒別中藥，將直接影響到臨床用藥的準(zhǔn)確性與安全性，輕則造成資源浪費(fèi)，重則產(chǎn)生毒副作用，甚至威脅人的生命。因此開展中藥的品種評價(jià)，研究制定中藥的鑒別依據(jù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使中藥標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，確保臨床用藥的安全有效。中藥鑒別主要是通過對中藥材的外觀、品質(zhì)、性狀、組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)部成分等進(jìn)行鑒別以確定中藥材的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣。本文將分別從性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別以及分子鑒別四種鑒別方法對常用中藥材的鑒別研究進(jìn)展綜述如下。

1 性狀鑒別

1.1 傳統(tǒng)性狀鑒別

性狀鑒別，是通過眼睛觀看、手觸摸、鼻子聞、口嘗味、水試、火試等十分簡便的鑒別方法，對生物的性質(zhì)、外觀形狀、顏色光澤、表面特征、斷面、質(zhì)地、氣、味等作為依據(jù)對中藥進(jìn)行真實(shí)性鑒別[3]。此方法具有簡單易行、方便迅速等優(yōu)點(diǎn)，是常用而且行之有效的鑒別方法之一。

張宗良[4]根據(jù)中藥材的外觀性狀、科屬種別等方面特征，對幾種容易混淆的中藥如金銀花和山銀花、半夏和水半夏、雞血藤和大血藤等的形狀鑒別要點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，以為臨床安全使用中藥材提供參考。張燕等[5]對冬蟲夏草、西紅花、阿膠三種名貴藥材及其偽品，從來源、形狀、大小、表面特征等多個方面進(jìn)行性狀鑒別和分析，為中藥材的鑒別分析奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。馮菲[6]運(yùn)用豐富的工作經(jīng)驗(yàn)，選取威靈仙、天麻、杜仲、蘇木等10種中藥材，總結(jié)對其進(jìn)行快速經(jīng)驗(yàn)鑒別的方法，為中藥鑒別提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1.2 仿生技術(shù)性狀鑒別

仿生技術(shù)是一種在不損傷藥材、不取樣的情況下利用傳感器技術(shù)判斷和鑒別中藥材真?zhèn)?、質(zhì)量好壞的方法[7]。近年來，電子鼻、電子舌等諸多仿生技術(shù)逐漸應(yīng)用于中藥鑒別領(lǐng)域。

電子舌技術(shù)[8]是一種模擬人類的舌頭及其神經(jīng)系統(tǒng)信息處理的智能味覺仿生系統(tǒng)，具有客觀、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。電子舌在中藥鑒別的領(lǐng)域，主要用于鑒別藥材的氣味、種類、儲存時(shí)間等，評價(jià)中藥的五味、掩味效果、以及臨床試驗(yàn)中氣味劑的味道等方面。

電子鼻作為一種潛力十足的鑒別工具已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)控和公共安全等領(lǐng)域。田卉玄等以易霉變的肉豆蔻為研究對象，利用電子鼻檢測不同霉變程度樣品氣味，同時(shí)通過HS-GC-MS對樣品粉末進(jìn)行揮發(fā)性成分測定，建立電子鼻與樣品氣味物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)性，結(jié)合主成分分析確定不同霉變程度的肉豆蔻在揮發(fā)性成分上存在差異。為快速區(qū)分不同霉變程度肉豆蔻的氣味變化及其物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，也為電子鼻在中藥鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用和研究提供一定的理論與實(shí)際參考[9]。

雖然仿生技術(shù)通過仿生設(shè)備表達(dá)出中藥氣味的響應(yīng)值，在一定程度上彌補(bǔ)了人類僅憑靠感官鑒別中藥的不足，但是仿生技術(shù)無法直接體現(xiàn)出中藥材的氣味和其化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)性，不能夠以定量或者定性的方式制定中藥材質(zhì)量的鑒別標(biāo)準(zhǔn)，難以保障中藥材的用藥安全和實(shí)際療效，再加上仿生技術(shù)的應(yīng)用造價(jià)成本昂貴，所以仿生技術(shù)在中藥鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用有待挖掘[7]。

1.3 微性狀鑒別

中藥微性狀鑒別是借助體視顯微鏡、生物顯微鏡等儀器觀察中藥材表面等肉眼不易察覺的細(xì)微性狀特征，并以此作為依據(jù)的一種鑒別方法[10]。微性狀鑒別是傳統(tǒng)的性狀鑒別法向微觀領(lǐng)域的延伸與拓展。微性狀鑒定法與顯微鑒定法的不同之處在于光線。顯微鑒定法的光線是穿透藥材，進(jìn)行檢材后形成的直射影像，能夠清楚地反映細(xì)胞組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)，但也會呈現(xiàn)出組織不同層面影像的重疊，給具體判斷藥材帶來一定的障礙。而微性狀鑒定的光線不會穿透檢材，只是光線投射到藥材表面后經(jīng)過反射形成的影像，能夠清楚地展現(xiàn)藥材表面的紋理、形狀、色澤和起伏。運(yùn)用微性狀鑒別法能夠快速且清晰地展現(xiàn)藥材表面及斷面的微性狀特征，對于形態(tài)相似易混淆的藥材，也能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別方法的不足，明顯提高藥材鑒別的準(zhǔn)確性。因此，微性狀鑒別法從經(jīng)濟(jì)方面、操作方面、鑒別結(jié)果方面、普適性等方面，都具有其他鑒別方法所難以具有的綜合優(yōu)勢[11]。

劉屹[11]針對摻雜中藥材和霉變藥材，運(yùn)用微性狀鑒別法，在儀器下觀察到霉變藥材表面殘留的少許菌絲體和芽孢，并且對藥材組織中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)都有了一定的掌握。袁仕君等[12]將36種礦物類中藥粉末按顏色不同大致分為4類，利用體視顯微鏡的立體圖像處理方法，分別對這4類礦物中藥粉末進(jìn)行微性狀觀察，得到了一系列鑒別結(jié)果，并比較和總結(jié)其鑒別特征，表明多數(shù)礦物類中藥粉末可以通過體視顯微鏡觀察到較明顯的微性狀特征，能夠用于中藥材的鑒別。梁珊珊等[13]根據(jù)中藥微性狀鑒定法，利用手機(jī)顯微鏡分別對五谷蟲的不同部位進(jìn)行圖像采集和整理，對五谷蟲的微性狀特征進(jìn)行研究分析，表明中藥微性狀鑒別法能夠鑒別中藥五谷蟲，且具有準(zhǔn)確度高，操作簡便，效率高的優(yōu)點(diǎn)。

2 顯微鑒別

顯微鑒別是利用顯微鏡來觀察分析中藥內(nèi)部的細(xì)胞性狀、組織構(gòu)造以及細(xì)胞內(nèi)含物特征，鑒定中藥的真?zhèn)位蛑贫@微鑒別的依據(jù)。由于中藥的內(nèi)部構(gòu)造較穩(wěn)定，多具有種的特異性，易于正確鑒別。該法適用于外形相似不易于區(qū)別的多來源中藥、破碎和呈粉末狀的中藥，以及用粉末制成的丸、散、片、膠囊等中成藥。顯微鑒別通過光電子系統(tǒng)對人眼難以觀察的微小細(xì)節(jié)進(jìn)行觀測，對不同中藥加以區(qū)分，在不斷實(shí)踐中將顯微鑒別分為2類：組織結(jié)構(gòu)與粉末鑒定、半顯微性狀鑒別[14]?！吨腥A人民共和國藥典》收載的5種海馬粉末通過顯微鑒別，能夠觀察到特有的顯微特征，例如橫紋肌顯微、皮膚碎片和骨碎片特征等。對羚羊角、穿山甲、珍珠、地龍、海馬等珍稀藥物粉末進(jìn)行顯微特征研究能夠明確附注顯微特征圖[15]。掃描電鏡具有較高的分辨率，放大倍數(shù)變化范圍大，能使物質(zhì)的圖像呈現(xiàn)顯著的表面立體結(jié)構(gòu)(三維空間)的特征，觀察的樣品制備操作又較簡易，所以在藥材鑒定，特別是同科屬種間的表面結(jié)構(gòu)的鑒別比較上，已成為一種新的手段。盧廣英等[16]簡要介紹了掃描電鏡在植物類、動物類及礦物類中藥真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用，并表明掃描電鏡可快速、有效地鑒別出僅通過普通光學(xué)顯微鏡等傳統(tǒng)方法而難以辨別真?zhèn)蝺?yōu)劣的中藥，為市場出現(xiàn)的較為混亂的中藥材及飲片來源提供了更簡便、精確、可靠的鑒別技術(shù)手段。

3 理化鑒別

理化鑒別是利用物理的或化學(xué)的分析方法，對中藥及其制品中所含有效成分或指標(biāo)性成分進(jìn)行定性和定量分析，以鑒別中藥的真?zhèn)魏推焚|(zhì)優(yōu)劣的一種方法與手段。

3.1 一般理化鑒別

一般理化鑒別主要包括呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、顯微化學(xué)反應(yīng)、微量升華、熒光分析、物理常數(shù)測定等。

3.1.1 呈色反應(yīng)

利用中藥所含化學(xué)成分能與某些試劑產(chǎn)生特殊顏色反應(yīng)的性質(zhì)鑒別中藥。一般在試管中進(jìn)行，也可直接在中藥切片或粉末上滴加各種試劑觀察呈現(xiàn)的顏色，用以判斷中藥中是否有某類或某種化學(xué)成分。

3.1.2 沉淀反應(yīng)

利用中藥的化學(xué)成分能與某些試劑產(chǎn)生某種性狀的沉淀反應(yīng)來鑒別中藥。如黃芩的乙醇提取液，加醋酸鉛試液生成橘黃色沉淀，表示黃芩含有黃酮或黃酮苷類成分。

3.1.3 顯微化學(xué)反應(yīng)

利用植物細(xì)胞后含物可與某些化學(xué)試劑發(fā)生反應(yīng)的性質(zhì)，將中藥的少量粉末、切片或浸出液置于載玻片上，滴加某種化學(xué)試液后，通過顯微鏡觀察產(chǎn)生的顏色變化、沉淀或結(jié)晶的生成、氣體逸出等化學(xué)反應(yīng)現(xiàn)象鑒別中藥。如黃連粉末滴加稀鹽酸，鏡檢可見簇狀鹽酸小檗堿結(jié)晶;若滴加30%硝酸，可見針狀小檗堿硝酸鹽結(jié)晶析出。

3.2 色譜法

現(xiàn)代色譜分析技術(shù)具有分離、分析雙重功能，特別適用于含有復(fù)雜化學(xué)成分中藥的定性、定量鑒別，在制定中藥及其制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、評價(jià)中藥的有效性和安全性中得到越來越廣泛的重視和應(yīng)用。薄層色譜法是中藥鑒別中最為常用的定性鑒別方法，高效液相色譜法和氣相色譜法是常用的定性定量分析方法。

3.2.1 薄層色譜法

將中藥或中藥制品用適當(dāng)溶劑提取并處理后制成供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)對照品溶液或標(biāo)準(zhǔn)對照藥材溶液點(diǎn)于同一薄層板上。在層析缸內(nèi)用展開劑展開，使供試品中的化學(xué)成分層析分離。用顯色劑顯色或紫外燈照射(254 nm 或 365 nm)下檢視，或在薄層硅膠中加入熒光物質(zhì)，采用熒光猝滅法檢視。通過比較供試品溶液與對照物的色譜圖進(jìn)行鑒別。劉世欣等[17]采用TLC法對腎康寧膠囊進(jìn)行定性鑒別研究，在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了澤瀉、丹參、茯苓和鎖陽的專屬性TLC鑒別方法，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)研究，提高臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供技術(shù)支撐。

3.2.2 氣相色譜法

采用氣體為流動相(載氣)，樣品注入進(jìn)樣器加熱氣化，被載氣帶入色譜柱內(nèi)各成分得到分離，先后進(jìn)入檢測器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理器記錄色譜圖，進(jìn)行中藥化學(xué)成分的定性、定量分析。氮、氦、氫氣可用作載氣;色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱;氣相色譜法最常用的檢測器有熱導(dǎo)檢測器和火焰離子化檢測器。氣相色譜法最適用于含有揮發(fā)性及其它揮發(fā)性成分，或制成可氣化的衍生物的非揮發(fā)性成分的中藥的定性、定量分析。如丁香按照其相色譜法測定，以聚乙二醇20000(PEG-20M)為固定相，含丁香酚(C10H12O2)不得少于11.0%。高溫下不能氣化的成分不能進(jìn)行分析。

3.2.3 高效液相色譜法

系采用高壓輸液泵將流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對樣品進(jìn)行分離測定的色譜分析方法。根據(jù)中藥所含化學(xué)成分的性質(zhì)，選用不同的色譜柱及適宜的流動相。高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、靈敏度和準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，適用各類化學(xué)成分的分析等特點(diǎn)和優(yōu)勢，是中藥化學(xué)成分定性定量、分析的首選方法。李雨昕等[18]參考相關(guān)文獻(xiàn)和2020年版《中國藥典》(一部)，建立了生三七及其炮制品的HPLC指紋圖譜。通過HPLC指紋圖譜及相似度評價(jià)發(fā)現(xiàn)，15批生三相似度為0.911～1.000，共16個共有峰;15批炮制品相似度為0.862～1.000，共25個共有峰。經(jīng)對比，生三七與炮制品中共有12個共有峰相同;經(jīng)與對照品對比，共指認(rèn)了其中3個共有峰，分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1。

3.3 分光光度法

分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長或一定波長范圍內(nèi)的光吸收度而進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的方法有下列幾種：

3.3.1 紫外-可見分光光度法

根據(jù)有機(jī)化合物對200～760 nm 波長范圍電磁波的吸收特性而建立的光譜分析方法，可用于化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有發(fā)色團(tuán)或助色團(tuán)的化學(xué)成分的定性、定量分析。特別是有色物質(zhì)和具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)的分析。對本身吸收弱或無吸收的化學(xué)成分，也可通過與某些化學(xué)試劑反應(yīng)顯色后進(jìn)行測定。此法適用于測定中藥中某類成分的總含量，如《中國藥典》(2010年版)記載的是山楂葉中總黃酮，川貝母中總生物堿、知母中總皂苷的含量測定等。常用的儀器為紫外-可見分光光度儀或比色劑。含量測定方法主要有對照品比較法，吸收系數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法等，具有靈敏，簡便，準(zhǔn)確等特點(diǎn)。谷偉玲等[19]將紫外光譜在中藥鑒別的應(yīng)用方法分為四種：紫外光譜單一法、導(dǎo)數(shù)光譜法、紫外光譜組法、紫外光譜聯(lián)合其它方法。

3.3.2 紅外分光光度法

主要用于中藥單體化學(xué)成分的定性鑒別。紅外光譜鑒別需要標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對照。近年，通過識別中藥粗提物的特征吸收峰，直接用于中藥粗提物的品種鑒別的報(bào)道越來越多，如珍珠、蟾蜍、麝香、熊膽等動物類中藥的鑒別。李雨昕等采用OMNIC8.2.0軟件建立生三七及其炮制品的紅外(IR)指紋圖譜并進(jìn)行相似度評價(jià)，采用雙指標(biāo)序列分析法對15批生三七及其炮制品的IR指紋圖譜吸收峰進(jìn)行分析，并表明IR指紋圖譜的相似度較好，能有效區(qū)分生三七及其炮制品。

3.3.3 原子吸收分光光度法

利用原子吸收分光光度計(jì)，測定中藥中呈原子狀態(tài)的無機(jī)元素的吸收光譜進(jìn)行鑒別的方法。本法的專屬性強(qiáng)，檢測靈敏度高，測定速度快，是測定中藥和中藥制劑中微量元素、重金屬的最常用方法。

3.4 中藥理化鑒別新技術(shù)

3.4.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)

將氣相色譜儀與質(zhì)譜檢測器串聯(lián)使用，發(fā)揮氣相色譜對混合物中化學(xué)成分的分離優(yōu)勢和質(zhì)譜的直接定性分析功能，可直接對中藥中含有的揮發(fā)油類成分，或非揮發(fā)性成分經(jīng)衍生化轉(zhuǎn)為具有揮發(fā)性的物質(zhì)進(jìn)行分離和定性、定量分析。氣相色譜使用的色譜柱常用毛細(xì)管色譜柱，質(zhì)譜檢測器常用電子轟擊質(zhì)譜儀(EIMS)。

3.4.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)

將高效液相色譜儀與質(zhì)譜檢測器串聯(lián)使用，發(fā)揮高效液相色譜化學(xué)成分的分離優(yōu)勢和質(zhì)譜的直接定性分析功能，直接對中藥含有的各類化學(xué)成分進(jìn)行分離和定性、定量分析。高效液相色譜使用的色譜柱常用十八烷基鍵合相硅膠色譜柱，質(zhì)譜檢測器常用電噴霧離子化質(zhì)譜儀(ESIMS)。此技術(shù)在中藥的化學(xué)成分研究中已經(jīng)得到廣泛重視和應(yīng)用。王郡瑤等[20]建立數(shù)據(jù)庫來輔助中藥成分鑒定，可以充分挖掘液質(zhì)數(shù)據(jù)信息，并提高定性鑒別的效率。Luo等[21]開發(fā)了超高效液相色譜聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)和快速分離液相色譜-三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜(RRLC-QTRAP MSn)方法，用于分別對小須明湯活性成分進(jìn)行定性和定量分析。數(shù)據(jù)顯示，使用UPLC-Q-TOF/MS在AF-XXMD中鑒定出48種化合物，包括14種生物堿、14種黃酮、12種三萜、3種色酮、3種單萜、1種氰苷、1種揮發(fā)油。與此同時(shí)，分別測定了各組分的含量，并表明氰基糖苷、單萜和類黃酮是小須明湯活性成分中含量最高的三種成分。

3.4.3 中藥化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)

中藥的藥效是所含多種化學(xué)成分通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮綜合性作用的結(jié)果，特別是很多中藥的化學(xué)成分十分復(fù)雜，且有效成分尚未明確，因此僅僅通過對中藥中的某一種或某幾種化學(xué)成分進(jìn)行分析，其質(zhì)量缺乏其科學(xué)性。中藥化學(xué)成分指紋圖譜鑒定法就是為解決這一客觀難題而創(chuàng)立的一種新的中藥質(zhì)量評價(jià)方法。中藥化學(xué)成分指紋圖譜是指采用色譜或光譜分析方法建立的用于表征中藥化學(xué)成分的特征圖譜。在中藥鑒定中，最常用的是高效液相色譜法、薄層色譜法或氣相色譜法等色譜分析技術(shù)建立的指紋圖譜。將中藥經(jīng)過適當(dāng)處理后，應(yīng)用現(xiàn)代色譜技術(shù)并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)及計(jì)算方法，制定對中藥所含化學(xué)成分的整體特征進(jìn)行科學(xué)表征的專屬性很強(qiáng)的圖譜，用以評價(jià)中藥的質(zhì)量。指紋圖譜全面反映了中藥所含化學(xué)成分的整體特征，從而能更好地評價(jià)中藥的內(nèi)在品質(zhì)。如銀杏葉制劑的質(zhì)量控制就是采用指紋圖譜技術(shù)的成功范例。

三維熒光技術(shù)是20世紀(jì)80年代以熒光光譜分析為基礎(chǔ)發(fā)展衍生出來的一種新分析技術(shù)。三維熒光圖譜包含激發(fā)波長、發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度3種信息，描述了熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系，可以直觀地表示熒光強(qiáng)度、熒光峰位置及熒光強(qiáng)度變化趨勢，能提供比常規(guī)熒光圖譜更為豐富的信息，更加完整地描述熒光物質(zhì)的熒光特性。三維熒光圖譜在速度快、成本低、專屬性強(qiáng)、前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，能夠更加全面地反映一個復(fù)雜物質(zhì)的光譜信息，并且其具有較高的測量靈敏度，對分子的結(jié)構(gòu)也具有較好的選擇性，這些優(yōu)點(diǎn)都使其應(yīng)用范圍變得越來越廣[22]。喬淞汾[23]利用三維熒光技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段建立12種中成藥的三維熒光指紋圖譜，利用編寫的Matlab程序獲取相關(guān)特征參數(shù)，對其進(jìn)行分析比較，為中成藥的鑒別提供了數(shù)據(jù)參考。袁仕君等[24]在建立了生石膏和玄精石粉末的X-射線衍射(XRD)指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相似度評價(jià)并確定了兩者的鑒別閾值，對指紋峰的相對強(qiáng)度值進(jìn)行了聚類分析和主成分分析，結(jié)果表明采用以上方法能夠?qū)ι嗯c玄精石進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。

4 分子鑒別

4.1 DNA分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子遺傳標(biāo)記鑒定是利用分子生物學(xué)的DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，通過測定生物間DNA分子遺傳多樣性來鑒定中藥的基源，確定其學(xué)名的方法。DNA分子標(biāo)記直接檢測DNA分子上的差異，具有數(shù)量多、遍及整個基因組、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制，可對不同發(fā)育時(shí)期的生物個體、組織器官以及細(xì)胞進(jìn)行檢測的優(yōu)點(diǎn)。

李慧等[25]根據(jù)紅天麻、烏天麻重測序篩選SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)鑒別引物，并對PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)程序中的關(guān)鍵因素進(jìn)行了考察，確定了最優(yōu)的PCR鑒別條件，建立紅天麻、烏天麻及其雜交天麻特異性PCR鑒別方法。結(jié)果表明此方法具有效率高、成本低、穩(wěn)定且特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為中藥材品種鑒別提供了一種新的途徑。楊灝等[26]收集平貝母及其他貝母材料，提取樣品總基因組DNA，分析比對平貝母及其它貝母ITS片段，根據(jù)差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)平貝母特異性引物，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)體系并對該方法進(jìn)行耐受性和適用性考察。表明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的平貝母特異性引物專屬性強(qiáng)，所建立的特異性PCR方法可以用于平貝母的準(zhǔn)確鑒別。

田娜等[27]基于STR分型原理建立了一種簡單快捷的可用于膽粉類藥材及其摻雜樣品的通用DNA指紋圖譜鑒別方法，并收集原動物或膽粉樣本，使用篩選獲得的鑒別引物12S-L1091/12S-H1478和16S-L3428/16S-H3667擴(kuò)增并進(jìn)行STR分型獲得DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示各物種的STR指紋圖譜不同，可用于物種鑒別，并且DNA指紋圖譜上能同時(shí)反映正品和偽品的信息，可鑒別中藥的真?zhèn)纹泛蛽诫s品。

4.2 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼的概念由加拿大動物學(xué)家Paul Heber首次提出，是指使用一段較短的、標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的DNA片段對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的鑒定。DNA條形碼技術(shù)是以DNA序列為檢測對象，建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可以機(jī)械重復(fù)且能夠?qū)崿F(xiàn)一次性快速并準(zhǔn)確鑒別物種樣本[28]。

李珍珍等[29]應(yīng)用5條常用DNA條形碼序列ITS、ITS2、psb A-trn H、mat K與rbc L對甘草屬進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測序，結(jié)合在Gen Bank數(shù)據(jù)庫下載的序列數(shù)據(jù)，通過分析各序列種內(nèi)與種間變異與遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并基于相似性搜索算法和最近距離法計(jì)算各序列鑒定成功率，以分析比較各序列對甘草屬的鑒定效率。孫思雅等[30]提取棘海馬和其他海馬樣品的基因組總DNA，對COⅠ和ATP6基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向測序，通過Blast對序列的準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)，利用MEGA 7計(jì)算序列的GC量，種內(nèi)種間距離以及采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。通過性狀鑒別和DNA條形碼序列聯(lián)用的方法確定了棘海馬的典型性狀和分子鑒別特征，為棘海馬的準(zhǔn)確鑒定和續(xù)應(yīng)用提供了技術(shù)保證，并為擴(kuò)大海馬藥用資源和保證海馬藥材臨床用藥安全提供了新的依據(jù)。辛天怡等[31]共收集212份市售中藥飲片，包含根及根莖、果實(shí)種子、全草、花、葉、皮、莖木等不同入藥部位，驗(yàn)證中藥材DNA條形碼分子鑒定法對中藥飲片基原物種鑒定的適用性和準(zhǔn)確性。研究證實(shí)中藥材DNA條形碼分子鑒定法能有效檢出市售中藥飲片的摻偽、混偽現(xiàn)象，可用于市售中藥飲片的基原物種鑒定，值得在中藥飲片加工生產(chǎn)企業(yè)及藥品監(jiān)督檢驗(yàn)管理機(jī)構(gòu)推廣。姜波[32]按照第207條ITS2序列構(gòu)建菟絲子的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，結(jié)合克隆程序，對從市場、醫(yī)院、藥店購買的菟絲子藥材進(jìn)行鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%市面銷售的菟絲子藥材存在混偽情況，并說明采用DNA條形碼鑒定種子果實(shí)類藥材和市場監(jiān)督均有較好作用。Wei Shugen等[33]建立了基于DNA條形碼的LC-MS/MS物種鑒定和定量分析綜合評價(jià)體系。基于ITS2條形碼區(qū)域的DNA條形碼顯示出足夠的辨別力，可以精確識別來自七種鉤藤屬植物的24個樣本。

4.3 RNA分子技術(shù)

Zhang Wen等[34]將高通量測序和生物信息學(xué)方法用于鑒定冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)中的保守和新型微小RNA樣RNA(microRNA-like RNA)。鑒定了40個保守的微小RNA樣RNA，同時(shí)預(yù)測了23個編碼31個新微小RNA樣RNA的pre-miRNA候選物。為進(jìn)一步研究微小RNA樣RNA作為冬蟲夏草的活性成分在保健食品或中藥中的潛在作用提供了有用的資源。

5 討論

綜上所述，性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別和分子鑒別在中藥鑒別領(lǐng)域都有所進(jìn)步與發(fā)展，均取得了一定的成果?？v觀現(xiàn)有的鑒別技術(shù)，鑒定手段和方法隨著化學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展不斷更新提升呈現(xiàn)出主觀經(jīng)驗(yàn)鑒別到客觀數(shù)據(jù)判斷的發(fā)展歷程，分子鑒別已逐漸成為鑒別技術(shù)發(fā)展趨勢之一?，F(xiàn)代新鑒別技術(shù)客觀準(zhǔn)確，我們有望更多的鑒別新技術(shù)運(yùn)用于中藥材鑒別中，保證中藥材的臨床應(yīng)用安全性。