斑馬魚食源性腸炎模型及其免疫細(xì)胞成像分析方法的建立

黎 明 謝家元， 趙旭陽 李曉敏， 王 銳 單俊瑋 程瑩寅 張婉婷 吳 南， * 夏曉勤， *

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所， 武漢 430072; 3. 中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049; 4. 武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 武漢 430000)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是一個未來全球優(yōu)質(zhì)蛋白供應(yīng)的重要途徑， 魚類的生長和健康直接影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展， 然而食源性腸炎是引起魚類疾病和生長抑制的重要限制性因素[1—3]。豆粕等植物蛋白源作為替代魚粉的典型代表， 會引起魚類豆粕誘導(dǎo)型腸炎(Soybean meal induced enteritis， SBMIE)， 目前已在魚蝦中被報道[4，5]。由于目前水產(chǎn)養(yǎng)殖品種較為分散， 研究系統(tǒng)性不夠， 導(dǎo)致目前還比較缺乏豆粕誘導(dǎo)型腸炎， 以及缺乏基于細(xì)胞層面研究腸黏膜免疫細(xì)胞對豆粕脅迫的應(yīng)答機(jī)制。

斑馬魚(Danio rerio)， 屬于鯉科魚類， 是水產(chǎn)模式動物， 可發(fā)生典型SBMIE[6，7]的癥狀， 已日漸引起水產(chǎn)養(yǎng)殖界的重視。國內(nèi)外相關(guān)魚類營養(yǎng)學(xué)、免疫學(xué)和腸道微生物學(xué)家[8，9]用斑馬魚來研究養(yǎng)殖魚類食源性腸炎[8]。在斑馬魚的腸道免疫階段發(fā)育過程中， 固有免疫細(xì)胞在受精卵出膜1d后就能被檢測到[10，11]， 而3周之后才出現(xiàn)比較成熟的適應(yīng)性免疫細(xì)胞。這就為斑馬魚幼魚用來分階段研究腸道固有免疫和適應(yīng)性免疫提供了可行性。最新的研究發(fā)現(xiàn)， 斑馬魚在SBMIE的早期階段， 中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)[12—14]。而在可自愈的草魚SBMIE炎癥平臺期， 自身免疫相關(guān)的Th17反應(yīng)為主[14]，同時， B淋巴細(xì)胞也積極參與抗感染; 在自愈期， 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)反應(yīng)為主， 同時天然免疫球蛋白IgM、IL10等抗炎因子也對于食源性腸炎的炎癥恢復(fù)都起到重要作用[15]。在斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系方面，目前報道熒光標(biāo)記的固有免疫細(xì)胞包括: 中性粒細(xì)胞品系Tg(yz:DsRED2)[16]、Tg(BACmpo:GFP)[8]、巨噬細(xì)胞有Tg(mpeg1:EGFP)[17]和Tg(coro1a:DsRed)[18];適應(yīng)性免疫細(xì)胞包括: 淋巴細(xì)胞系細(xì)胞Tg(rag2:DsRed)[19]和T淋巴細(xì)胞Tg(lck:eEFP)[20]等， 這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞標(biāo)記品系， 被廣泛地用來進(jìn)行疾病建模的免疫效應(yīng)分析[8，21]。因此， 采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系幼魚， 在腸道固有免疫和適應(yīng)性免疫各自的發(fā)育階段， 進(jìn)行成像分析SBMIE的免疫細(xì)胞學(xué)效應(yīng)是可行的。

目前用斑馬魚幼魚成像來進(jìn)行腸炎研究， 還存在一些問題。一方面， 短期浸泡引起的全身黏膜反應(yīng)可能會削弱腸道局部的免疫激活效應(yīng)[22]， 而浸泡引起的巨噬細(xì)胞反應(yīng)主要集中在因吞咽而起作用的前腸[13，23]， 而非食源性刺激的主要免疫反應(yīng)部位——后腸; 另一方面， 現(xiàn)有的報道多為急性炎癥反應(yīng)(表現(xiàn)為固有免疫細(xì)胞的聚集)， 而對腸黏膜免疫系統(tǒng)中適應(yīng)性免疫細(xì)胞的研究相對缺乏; 此外， SBMIE的病理表型出現(xiàn)腸黏膜中隱窩深度變淺、固有層增寬等[1，6]， 而目前斑馬魚幼魚的僅有研究集中在幼魚的分子水平[14，24]， 缺乏SBMIE對腸道組織病理水平的探索。因此， 本研究通過運(yùn)用熒光標(biāo)記斑馬魚品系， 通過成像的方式， 在固有免疫發(fā)育階段和適應(yīng)性免疫發(fā)育階段， 分別建立斑馬魚豆粕誘導(dǎo)的食源性腸炎模型， 揭示了中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞(包括未成熟的淋巴細(xì)胞和成熟的T淋巴細(xì)胞)在腸黏膜中對豆粕飼料的免疫應(yīng)答機(jī)制， 旨在提供一種快速、可視化的水產(chǎn)動物的食源性腸炎模型及相關(guān)功能飼料添加劑的在體研發(fā)平臺。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

參照NRC(1993)的魚類營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和Bravo-Tello等[7]的飼料配方， 實(shí)驗(yàn)以魚粉(秘魯進(jìn)口魚粉)和豆粕(膨化豆粕， 美國進(jìn)口大豆)作為飼料蛋白源， 魚油作為飼料脂肪源(表1)， 建立豆粕誘導(dǎo)的食源性腸炎模型。實(shí)驗(yàn)以50%的豆粕蛋白添加量替代魚粉蛋白添加量， 設(shè)計(jì)了兩組不同的飼料， 每組含39%的粗蛋白及9%的脂肪， 其中微晶纖維素為填充劑， 維生素預(yù)混料和礦物鹽預(yù)混料按1%的計(jì)量添加， FM表示非炎性飼料， 50SBM表示炎性飼料。在2 mm直徑的雙螺桿制粒機(jī)(廣州華工光機(jī)電科技有限公司)中制成顆粒飼料， 并在55—60℃烘箱中烘干， 后用小型粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎， 先過60目分樣篩，將過60目分樣篩后的飼料再過80目分樣篩， 留下80目分樣篩上面的飼料， 放置在4℃冰箱分管保存待用。

表1 斑馬魚SBMIE建模所用飼料配方Tab. 1 Feed formulations for zebrafish SBMIE modeling

1.2 實(shí)驗(yàn)魚和養(yǎng)殖條件

本實(shí)驗(yàn)所用的Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg、Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg、Tg(lck:eGFP)cz2Tg和Tg(rag2:DsRed)zf411Tg四種轉(zhuǎn)基因斑馬魚， 均購自國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center， http://zfish.cn/)。斑馬魚的飼養(yǎng)及繁育在中國科學(xué)院水生生物研究所水體生物信息課題組的斑馬魚室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行， 養(yǎng)殖水溫控制在(28±0.5)℃， 照明周期為光照14h， 黑暗10h， 斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的環(huán)境為pH 6.8—8.0， 鹽度0.25‰—0.50‰， 溶氧5—8 mg/L， 總氨氮＜0.02 mg/L， 其他條件參考國家斑馬魚中心。

1.3 轉(zhuǎn)基因純合子篩選

從國家斑馬魚資源中心購回的4種熒光標(biāo)記斑馬魚品系， 通過自交及與AB野生型斑馬魚側(cè)交， 在產(chǎn)卵后孵化至17d后(17 dpf)， 用MS-222工作液麻醉斑馬魚后在體式熒光顯微鏡(MZ10F， 德國Leica)下挑選熒光魚及統(tǒng)計(jì)熒光魚比例， 篩選出Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg、Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg、Tg(lck:eGFP)cz2Tg和Tg(rag2:DsRed)zf411Tg四種熒光魚。將Tg(lyz:DsRED2)nz50Tg和Tg(mpeg1:EGFP)ihb20Tg品系雜交， 獲得Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)雙熒光標(biāo)記品系， 用于固有免疫階段的成像研究。

1.4 SBMIE建模策略及飼養(yǎng)

用含亞甲基藍(lán)的0.3× Danieau’s solution(egg water， 受精卵培養(yǎng)液)[25]收集魚卵， 將其放入分裝至12 cm的玻璃培養(yǎng)皿中， 約100粒/皿左右， 放入光照培養(yǎng)箱[(28±1)℃， 光照14h， 黑暗10h]中孵化， 每天早晚換含亞甲基藍(lán)的培養(yǎng)液2次， 并挑出死卵， 3d后(3 dpf)換成不含亞甲基藍(lán)的培養(yǎng)液。孵化至5d后(5 dpf)， 分裝入直徑150 mm的無菌培養(yǎng)皿中， 每50尾/皿， 實(shí)驗(yàn)分二組：魚粉組(FM)和豆粕組(50SBM)。固有免疫細(xì)胞成像用魚的飼養(yǎng): 從6—9 dpf分別投喂FM或50SBM飼料共4d， 其中每天投喂3次(9:00—9:30、14:00—14:30、19:00—19:30)， 投喂0.5h后換培養(yǎng)液; 適應(yīng)性免疫細(xì)胞成像用魚的飼養(yǎng):從5—17 dpf投喂Larval AP100(美國Zeigler公司)的標(biāo)準(zhǔn)幼魚飼料， 然后從18—27 dpf分別投喂FM或50SBM共10d， 后進(jìn)行固定及熒光成像; 具體投喂策略如圖1A所示， 成像區(qū)域如圖1B所示。

圖1 斑馬魚幼魚豆粕誘導(dǎo)的腸炎建模策略 (AP100: 標(biāo)準(zhǔn)飼料， FM: 對照飼料， 50SBM: 炎性飼料)Fig. 1 Strategies for modeling enteritis induced by soybean meal in zebrafish (AP100: the basal diet， FM: the control diet， 50SBM: the inflammatory diet)

1.5 斑馬魚的活體固定及免疫細(xì)胞成像

用無菌水配置25×100 mL的MS-222儲液(Tricaine Powder 400 mg， dd H2O 97.9 mL， 1 mol/L Tris-HCl， pH = 9.0， 2.1 mL)， 過0.45 μm的濾膜(Milipore)除菌后放入4℃保存， 其工作液用dd H2O稀釋到1×;用PBS溶液， 配置1%(w/v)的低熔點(diǎn)瓊脂糖， 室溫放置。取每個組飼養(yǎng)結(jié)束后的20尾左右的魚苗用MS-222工作液麻醉， 后將麻醉好的魚苗放入共聚焦培養(yǎng)小皿中， 用1%低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行正側(cè)面固定， 平行貼附于共聚焦小皿底部。用激光共聚焦顯微鏡(SP8， Leica， 德國)在10×鏡下同時對紅色熒光、綠色熒光和明場3個通道， 進(jìn)行幼魚腸道組織區(qū)域掃描成像。

1.6 蘇木素-伊紅染色(HE)

取相應(yīng)不同組處理的27 dpf后的斑馬魚魚苗，放入4%的多聚甲醛固定液中固定; 每個組取3條，進(jìn)行脫水: 75%酒精處理4h， 85%酒精處理2h，90%酒精處理2h， 95%酒精處理1h， 無水乙醇Ⅰ處理30min， 無水乙醇Ⅱ處理30min; 脫水后放入乙醇∶甲苯(1∶1)5—10min， 二甲苯Ⅰ 5—10min， 二甲苯Ⅱ5—10min進(jìn)行透明; 后續(xù)進(jìn)行透蠟包埋， 用切片機(jī)進(jìn)行斑馬魚后腸區(qū)域連續(xù)切片， 厚度為4 μm; 將切片依次放入二甲苯Ⅰ處理20min， 二甲苯Ⅱ處理20min， 無水乙醇Ⅰ處理5min， 無水乙醇Ⅱ處理5min， 75%酒精處理5min， 進(jìn)行脫蠟; 然后按照蘇木素-伊紅染色試劑盒(碧云天)的說明書， 對切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

1.7 RNA提取及熒光定量分析

飼喂FM或50SBM組飼料的斑馬魚， 在9 dpf (固有免疫分析)或27 dpf (適應(yīng)性免疫分析)， 取大約15尾/管， 用1 mL RNAlater?RNA Stabilization Solution試劑進(jìn)行固定， 使用TRIzol法提取混合樣品的RNA， 通過HiScript?II Q Select RT Super Mix for qPCR with gDNA wiper(R223-01)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此作為模板; 利用Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (11202ES03/08/06)試劑在Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR儀上完成熒光定量PCR(qPCR)， 熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系: Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL， Primer F(10 μmol/L) 0.4 μL， Primer R (10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA 2.0 μL， H2O 7.2 μL; 熒光定量PCR反應(yīng)條件采用兩步法: 95℃ 5min， 95℃ 10s、60℃ 30s (40×)讀板， 65—95℃ 繪制溶解曲線。檢測基因的qPCR引物序列見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物序列Tab. 2 Primers used in quantitative real-time

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

幼魚成像的顯微鏡照片用Leica Application Suite X(LAS X:3.4.2.18368)軟件進(jìn)行不同通道下的圖片處理和熒光細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)， 細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)參考Hedrera等[6]和Langenau等[20]的方法。隨后用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析; HE染色后的切片用多光譜成像顯微切割系統(tǒng)(奧林巴斯熒光顯微鏡& PE)對其進(jìn)行觀察， 并用明場進(jìn)行10×、40×鏡下拍照采圖， 后期用ImageJ (1.47v)進(jìn)行處理。本實(shí)驗(yàn)中所有基因的表達(dá)水平以rpl13a為內(nèi)參基因， 每個樣本的平均Ct值與內(nèi)參基因的平均Ct值進(jìn)行歸一化處理， 采用2-ΔΔCt法分析不同基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)， 用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和非配對t檢驗(yàn)， 所有的數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。

2 結(jié)果

2.1 采用固有免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記指示斑馬魚腸炎模型的建立

在腸道組織發(fā)育的固有免疫階段過程中， 采用Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系建立食源性腸炎模型(圖2)。在9 dpf， 對中性粒細(xì)胞而言， 50%豆粕替代魚粉使細(xì)胞均出現(xiàn)橢圓形、突觸型的兩種細(xì)胞形態(tài)(圖2B′和圖2F′)， 細(xì)胞位置呈隨機(jī)分布于中后腸(圖2B和圖2F); 巨噬細(xì)胞的形態(tài)在50%豆粕替代魚粉后出現(xiàn)較多類似細(xì)胞突觸形態(tài)(圖2C′和圖2G′)且隨機(jī)分布于中后腸區(qū)域(圖2C和圖2G)。在5 dpf和9 dpf 兩個時期， 對FM組和50SBM組熒光標(biāo)記的細(xì)胞在中后腸區(qū)域出現(xiàn)的信號(圖2－3I/J的紅色框)進(jìn)行了數(shù)量統(tǒng)計(jì)， 與FM組相比， 發(fā)現(xiàn)50SBM組中腸道中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞出現(xiàn)更多的聚集， 并且數(shù)量出現(xiàn)差異極顯著(分別為P=0.005、P＜0.001)。

圖2 豆粕替代魚粉對先天免疫細(xì)胞的影響Fig. 2 Effects of fishmeal substitution by soybean meal on innate immune cells

2.2 豆粕替代魚粉對固有免疫階段中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

在固有免疫階段中， 對腸道急性炎癥相關(guān)的基因進(jìn)行qPCR檢測(圖3)。與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉后會使腸道il-1β、il-8和tnf-alpha基因表達(dá)上調(diào)， 其中il-1β和tnf-alpha基因具有差異顯著(P＜0.05); 同時， 核轉(zhuǎn)錄因子nf-kb基因的表達(dá)水平也顯著上調(diào)(P＜0.05; 圖3A)。此外， 對參與固有免疫階段中主要細(xì)胞的標(biāo)記基因進(jìn)行了qPCR檢測。結(jié)果表明， 與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉后會使自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)記基因gzma(granzyme a，gzma)、中性粒細(xì)胞的標(biāo)記基因mpx(myeloid-specific peroxidase， mpx)、巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因mpeg1(macrophage expressed gene 1， mpeg1)顯著上調(diào)(P＜0.05)。

圖3 豆粕替代魚粉對固有免疫階段中相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mRNA expression levels of related genes in innate immune stage (Relative fold to FM group)

2.3 采用適應(yīng)性免疫細(xì)胞熒光標(biāo)記指示斑馬魚腸炎模型的建立

在腸道組織發(fā)育的適應(yīng)性免疫階段過程中， 采用Tg (rag2:DsRed)的熒光標(biāo)記品系建立食源性腸炎模型(圖4)， 通道下紅色指示的是rag2+淋巴細(xì)胞系。在17 dpf， 投喂基礎(chǔ)飼料AP100后， 中后腸區(qū)域出現(xiàn)了rag2+淋巴細(xì)胞， 細(xì)胞形態(tài)大多呈橢圓形(圖4B′)。在27 dpf， 一方面， FM組和50SBM組中都有相應(yīng)rag2+的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)， FM組中的細(xì)胞形態(tài)大部分呈現(xiàn)圓形(圖4E′)， 而在飼喂豆粕后，rag2+的淋巴細(xì)胞中有較多細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的突觸形(圖4H′);另一方面， 對斑馬魚中后腸區(qū)域出現(xiàn)rag2+的淋巴細(xì)胞系數(shù)量進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(圖4M)， 與FM組相比， 豆粕飼料組的腸道區(qū)域中出現(xiàn)了更多rag2+紅色熒光標(biāo)記細(xì)胞的聚集， 且差異極顯著(P＜0.001)。

圖4 豆粕替代魚粉對腸道未成熟淋巴細(xì)胞的影響Fig. 4 Effects of fishmeal substitution with soybcan meal on immature lymphocytes in intestine

為了進(jìn)一步研究T淋巴細(xì)胞在食源性腸炎過程中的細(xì)胞行為， 采用Tg (lck:lck-eGFP)熒光標(biāo)記的斑馬魚品系在適應(yīng)性免疫階段進(jìn)行食源性腸炎模型的構(gòu)建(圖5)， 通道下綠色標(biāo)記的是T淋巴細(xì)胞(圖5B和5E)。在27 dpf時期， FM組和50SBM組的腸道中都出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的lck+淋巴細(xì)胞， 且細(xì)胞形態(tài)都呈不規(guī)則的突觸形， 兩組之間的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯的差異(圖5B′和5E′); 之后通過對腸道區(qū)域出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)記的lck+淋巴細(xì)胞進(jìn)行定量的統(tǒng)計(jì)分析(圖5G)， 研究發(fā)現(xiàn)， 豆粕替代魚粉能顯著地引起T淋巴細(xì)胞在腸道區(qū)域的聚集(P＜0.0001)。

圖5 豆粕替代魚粉對腸道成熟T淋巴細(xì)胞的影響Fig. 5 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mature T lymphocytes in intestine

2.4 食源性腸炎幼魚模型的建立對適應(yīng)性免疫階段中腸道形態(tài)的影響

為了在病理水平觀察SBMIE模型的建立對腸道組織形態(tài)的影響， 在27 dpf， 取FM組和50SBM組做腸道組織的石蠟切片并進(jìn)行了HE染色(圖6)。FM組腸道形態(tài)較為完整， 有比較明顯的腸道絨毛高度(HVI)和隱窩深度， 固有層(LP)有一定的厚度，隨著50%豆粕替代魚粉后， 50SBM組后腸黏膜褶皺程度降低， 隱窩深度變淺， 固有層逐漸消失， 腸上皮細(xì)胞核的位置出現(xiàn)紊亂， 腸上皮層的杯狀細(xì)胞(GC，HE染色后表現(xiàn)為上皮層的空泡)數(shù)量減少。對FM、50SBM組后腸組織中的腸絨毛高度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 結(jié)果表明， 與FM組相比， 50SBM組的腸絨毛高度極顯著變短(P= 0.002)。

圖6 豆粕替代魚粉對斑馬魚幼魚腸道形態(tài)的影響Fig. 6 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on intestinal morphology of juvenile zebrafish

2.5 斑馬魚腸炎模型的建立對適應(yīng)性免疫階段中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

探究食源性腸炎模型對腸道腸黏膜屏障的影響， 我們對腸黏膜物理屏障相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了qPCR檢測， 其中包括腸道上皮緊密連接、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況(圖7A和7B)。一方面， 與FM相比， 50SBM組中緊密連接相關(guān)的zo-1、claudin b和claudin c均差異顯著性上調(diào)表達(dá)(P＜0.05)， 而claudin 15a差異極顯著下調(diào)表達(dá)(P＜0.01)，此外， 緊密連接相關(guān)的ocludin-a、claudin 1和claudin12也表達(dá)上調(diào)， 但都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(圖7A)。另一方面， 我們還對引起腸道凋亡相關(guān)基因進(jìn)行了檢測， 與FM相比， 50SBM組中caspase 3和caspase8均表達(dá)上調(diào)， 其中caspase3上調(diào)表達(dá)具有顯著性差異(P＜0.05)，caspase8無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異; 此外， 我們進(jìn)一步對腸道增殖標(biāo)記基因檢測， 腸道上皮細(xì)胞的標(biāo)記基因fabp2(fatty acid-binding protein 2， fabp2)表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05，圖7E)。

在腸炎過程中， 腸道免疫屏障發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能。隨后對腸黏膜免疫屏障相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了qPCR檢測， 其中包括促炎/抑炎細(xì)胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子和免疫細(xì)胞的標(biāo)記maker基因的表達(dá)情況。與FM組相比， 50%豆粕替代魚粉會使腸道促炎細(xì)胞因子il-1β、il-8和tnf-alpha， 抗炎細(xì)胞因子tgf-beta、il-10和mmp9， 炎癥相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子nfkb和免疫調(diào)節(jié)的核轉(zhuǎn)錄因子foxp3a及腸炎相關(guān)的tlr4均上調(diào)表達(dá)， 除il-8、tnf-alpha和tlr4無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著外， 其余均具有顯著性差異上調(diào)(P＜0.05; 圖7C和7D)。此外， 我們進(jìn)一步對食源性腸炎過程中細(xì)胞的標(biāo)記基因進(jìn)行了檢測， 結(jié)果表明gzma(granzyme a， gzma)、mpx、mpeg1和T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記基因lck(T cell-specific tyrosine kinase， lck)均顯著上調(diào)表達(dá)(P＜ 0.05， 圖7E)。

圖7 豆粕替代魚粉對適應(yīng)性免疫階段中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of fishmeal substitution with soybean meal on mRNA expression levels of related genes in adaptive immune stage

3 討論

本研究針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的食源性腸炎， 采用在遺傳學(xué)上已熒光標(biāo)記免疫細(xì)胞的斑馬魚品系，建立了斑馬魚SBMIE幼魚模型， 分別對固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞進(jìn)行了成像和分子機(jī)理的分析。結(jié)果表明， 斑馬魚幼魚即可發(fā)生類似成魚的腸黏膜免疫調(diào)控來應(yīng)對食源性腸炎的細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象， 可對應(yīng)到斑馬魚腸道免疫的發(fā)育的階段性， 即在胚胎孵化3周之前， 腸道開始擁有固有免疫(Innate immunity)，是機(jī)體腸道抵抗外源微生物入侵的第一道防線;3周之后開始出現(xiàn)比較成熟的適應(yīng)性免疫(Adaptive immunity)， 與固有性免疫一起構(gòu)成較完整的腸黏膜免疫系統(tǒng)[10，11，26]， 這一特點(diǎn)為斑馬魚用來分階段研究腸道固有免疫和適應(yīng)性免疫提供了便利。同時，斑馬魚又存在不同免疫細(xì)胞標(biāo)記品系[16，17，19，20]， 為探索SBMIE過程中免疫細(xì)胞的動態(tài)變化存在可能。

作為水產(chǎn)疾病的模型， 目前建立的斑馬魚幼魚SBMIE模型， 很好地模擬了經(jīng)濟(jì)魚SBMIE中腸黏膜屏障受到了破壞。對魚類SBMIE的損傷機(jī)理研究表明， 抗?fàn)I養(yǎng)因子， 主要為大豆蛋白7s和11S， 能夠引起魚類腸道強(qiáng)烈的過敏性炎癥[28—30]， 作為Th17細(xì)胞過敏反應(yīng)的典型細(xì)胞因子IL17在草魚SBMIE中是上調(diào)表達(dá)的， 是引起腸黏膜炎癥的內(nèi)因[15]。以上的誘因引起腸上皮中LP層腫脹及淋巴細(xì)胞浸潤、隱窩變淺和分泌細(xì)胞減少， 因而最終表現(xiàn)為腸絨毛的結(jié)構(gòu)發(fā)生萎縮。在對食源性腸炎研究最多的大西洋鮭(Salmo salar)中， SBMIE會造成腸固有層增寬、腸上皮層出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤、后腸黏膜上皮層可以吸收的空泡排列紊亂[27]。與之類似的是， 我們的HE染色結(jié)果中與魚粉組相比， 50%的豆粕替代魚粉也會造成腸道絨毛褶皺高度顯著降低，固有層增寬到與黏膜肌層平行， 腸上皮細(xì)胞核的位置出現(xiàn)紊亂， 杯狀細(xì)胞數(shù)量減少， 隱窩深度的相對較淺并逐漸消失等腸黏膜屏障損傷的病理表現(xiàn)。這也和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[31]、龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatus)[32]和建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)[33]等魚類中豆粕替代魚粉所造成的腸組織損傷結(jié)果呼應(yīng)。

腸黏膜上皮細(xì)胞組成緊密連接形成黏膜的物理屏障， 緊密連接相關(guān)基因中， ZO-1通過連接肌動蛋白actin為緊密連接提供支撐， 并可以提供細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞; Ocludin和Claudins處于腸上皮細(xì)胞壁上， 直接調(diào)節(jié)細(xì)間距離， 對于通透性很重要[34]。在眾多Claudin中， Claudin 1和Claudin c都是普遍表達(dá)在腸上皮細(xì)胞膜上的; Claudin b特異表達(dá)在隱窩的細(xì)胞膜上; 而Claudin 12和Claudin 15表達(dá)在腸上皮靠外的細(xì)胞膜頂端[35]。目前豆粕組的緊密連接基因表達(dá)分析結(jié)果表明， 大多數(shù)基因， 包括zo-1、claudin 1、claudin b和claudin c表達(dá)上調(diào)， 表明50%的豆粕替代魚粉會干擾發(fā)育期幼魚的中后腸上皮的緊密連接基因的表達(dá)， 這與HE染色結(jié)果中27 dpf幼魚腸道切片中腸上皮組織損傷相呼應(yīng)， 可能與豆粕誘導(dǎo)養(yǎng)殖魚類腸道物理屏障損傷有一定的關(guān)系。而claudin15a在豆粕組的下調(diào)表達(dá)暗示腸內(nèi)的鈉離子回收功能降低[36]。在腸炎過程中， 腸上皮細(xì)胞不僅可以通過產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-7、IL-8等)來招募免疫細(xì)胞[37]， 而且還會通過加快細(xì)胞凋亡[38]。在目前的結(jié)果中， 50SBM組凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)， 前期研究發(fā)現(xiàn)豆粕中的大豆球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子可引起Caco-2細(xì)胞死亡[39]， 都表明豆粕替代50%的魚粉會加速腸黏膜細(xì)胞凋亡， 同時腸上皮成熟基因fabp2也表達(dá)上調(diào)， 以上結(jié)果暗示了豆粕組腸道上皮層是在更加快速地進(jìn)行更迭。

在植物性蛋白源引發(fā)的腸炎過程中， 腸黏膜免疫系統(tǒng)起到關(guān)鍵性的作用， 而目前在經(jīng)濟(jì)魚中， 對SBMIE涉及的免疫細(xì)胞的應(yīng)答研究還比較零散， 且大量集中在免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子方面。在斑馬魚腸道炎癥期間， 固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞扮演重要角色， 其中包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等[8]， 這些都是SBMIE過程中參與炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞[14]。因而， 本研究系統(tǒng)對固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞在SBMIE中的應(yīng)答進(jìn)行了分析， 并對細(xì)胞因子進(jìn)行了探討。具體來說， 一方面， 在腸黏膜固有免疫細(xì)胞中， 參與SBMIE免疫應(yīng)答的主要為中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[40]。因而本研究運(yùn)用中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的雙標(biāo)品系Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)來建立固有免疫階段SBMIE模型可更加實(shí)時和綜合定量固有免疫細(xì)胞的反應(yīng)性， 研究發(fā)現(xiàn)兩類細(xì)胞都顯著增加， 但僅巨噬細(xì)胞的形態(tài)會改變， 暗示斑馬魚可在腸黏膜中招募固有免疫細(xì)胞[12，41]并改變細(xì)胞形態(tài)來應(yīng)對急性炎癥， 其中巨噬細(xì)胞免疫突觸的形成可能暗示免疫狀態(tài)改變， 即M0型向M1(TNF-alpha+標(biāo)記， 促炎， 產(chǎn)生TNF-alpha)或M2(抑炎， TNF-alpha-)型功能轉(zhuǎn)變[42]。高豆粕飼料投喂引起的中性粒細(xì)胞在腸道區(qū)域的招募， 這與斑馬魚中化學(xué)試劑誘導(dǎo)腸炎[43—45]和高豆粕飼料對斑馬魚腸巨噬細(xì)胞的影響相似[14]。同時， qPCR發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞標(biāo)記基因—mpx和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因—mpeg1均表達(dá)上調(diào)， 進(jìn)一步暗示了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與了豆粕引起的急性炎癥。此外， 從炎性細(xì)胞因子角度來看， 飼喂高豆粕飼料使il-1β、il-8、tnf-alpha及核轉(zhuǎn)錄因子nfkb上調(diào)表達(dá)， 說明50%的豆粕替代魚粉引起了急性炎癥反應(yīng)不僅增加固有免疫細(xì)胞， 而且還會產(chǎn)生急性炎癥細(xì)胞因子。以上結(jié)果表明， 在固有免疫發(fā)育階段， 采用Tg(lyz:DsRED2);Tg(mpeg1:EGFP)的雙熒光標(biāo)品系進(jìn)行斑馬魚食源性腸炎模型的構(gòu)建可顯示食源性腸炎的急性炎癥反應(yīng)過程。

另一方面， 從適應(yīng)性免疫來說， 適應(yīng)性免疫細(xì)胞在腸炎發(fā)生和自愈過程中參與了重要的調(diào)控作用[14，15]。核基因重組激活基因2(Recombination activating gene 2，rag2)， 是編碼參與V(D)J重組免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因的重組酶的組成部分， 是淋巴細(xì)胞發(fā)育不可或缺的重要因子， 僅在未成熟的T/B淋巴細(xì)胞中共同表達(dá)[19]; T細(xì)胞特異性酪氨酸激酶(T cell-specific tyrosine kinase， lck)， 在成熟的T淋巴細(xì)胞和未成熟的T淋巴中均有表達(dá)[20]。通過Tg(rag2:DsRed)和Tg(lck:lck-eGFP)兩種單熒光標(biāo)記的斑馬魚幼魚， 在適應(yīng)性免疫階段構(gòu)建SBMIE模型， 本研究發(fā)現(xiàn)高豆粕投喂能引起腸道區(qū)域rag2+淋巴細(xì)胞和lck+淋巴細(xì)胞顯著增加且lck+淋巴細(xì)胞數(shù)量高于rag2+淋巴細(xì)胞， 這一結(jié)果表明未成熟的T/B淋巴細(xì)胞和成熟的T淋巴細(xì)胞可能均參與了腸炎， 暗示SBMIE過程中與成熟的T淋巴細(xì)胞在腸道中的聚集有關(guān)。此外在飼喂豆粕飼料后，rag2+淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了較多突觸型的細(xì)胞形態(tài)， 而豆粕替代魚粉與否對lck+淋巴細(xì)胞形態(tài)沒有太大的差異，表明腸炎過程中未成熟的淋巴細(xì)胞可能通過改變形態(tài)來發(fā)揮功能; 而成熟的T淋巴細(xì)胞對投喂的飼料具有類似的反應(yīng)， 可能通過增加數(shù)量來應(yīng)對腸炎。這與Coronado等[14]在斑馬魚腸炎中研究的結(jié)果相類似。

從炎癥因子的角度， SBMIE引起腸黏膜免疫的改變表現(xiàn)在LP層免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的促炎核轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kb)、促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8和TNF-alpha等)[46]， 同時機(jī)體通過促進(jìn)免疫細(xì)胞分化(如CD4+T細(xì)胞向Th1、Th2、Th17和Treg類群)[47]和分泌抗炎細(xì)胞因子(TGF-β和IL-10等)[39]來緩解腸炎。如在大西洋鮭SBMIE中，il-17a、il-1β、ifnα、ifnγ、tcrγ、cd4α、cd8β和tgf-β等表達(dá)均上調(diào)[48]。與FM組相比， 本研究發(fā)現(xiàn)， 50%的豆粕替代魚粉會使促炎細(xì)胞因子基因il-1β、il-8和tnf-alpha， 抗炎細(xì)胞因子基因tgf-β、il-10和mmp9， 炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因nf-kb和foxp3a， 此外還有腸炎相關(guān)受體基因tlr4的mRNA水平均表達(dá)上調(diào)， 說明50%的豆粕替代魚粉會造成腸道炎癥因子的表達(dá)， 引發(fā)腸炎; 而機(jī)體通過提高抗炎細(xì)胞因子基因(tgf-β和il-10等)及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因foxp3a的表達(dá)， 來應(yīng)對豆粕引發(fā)的腸炎， 促進(jìn)炎癥的緩解， 維持腸道免疫屏障穩(wěn)定。以上表明， 在適應(yīng)性免疫發(fā)育階段， 采用Tg(rag2:DsRed)和Tg(lck:lck-eGFP)兩種單熒光標(biāo)品系進(jìn)行斑馬魚食源性腸炎模型的構(gòu)建， 可指示適應(yīng)性免疫細(xì)胞參與腸炎的免疫效應(yīng)。

綜上所述， 采用飼料投喂的策略設(shè)計(jì)和斑馬魚免疫細(xì)胞熒光搭配成像的方式， 有效地模擬了水產(chǎn)養(yǎng)殖常見的食源性腸炎， 能夠可視化呈現(xiàn)出各類免疫細(xì)胞在急性炎癥和慢性炎癥各階段的細(xì)胞行為及動態(tài)變化， 并可在分子病理水平對炎癥進(jìn)行快速評價。本研究為水產(chǎn)動物的食源性腸炎提供了一個周期短、成本低、直觀的分析模型， 將來可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能飼料添加劑的研發(fā)。

致謝:

感謝國家斑馬魚資源中心的潘魯媛高級工程師指導(dǎo)斑馬魚養(yǎng)殖， 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所蔣明副研究員幫助制作斑馬魚SBMIE建模飼料， 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院劉靜霞教授指導(dǎo)幼魚成像分析實(shí)驗(yàn)， 中國科學(xué)院水生生物研究所分析測實(shí)中心王光欣和周芳工程師協(xié)助共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)。