飼料中復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)、飼料利用及非特異性免疫的影響

高學(xué)政 張配瑜 史雪瑩 賁玲芝 郭晴晴 劉海燕

(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 石家莊 050024)

大菱鲆(Scophthalmus maximusLinnaeus)又名多寶魚(yú)， 屬鰈形目、菱鲆科、菱鲆屬， 是我國(guó)北方重要的工廠化海水養(yǎng)殖魚(yú)類。近年來(lái)隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展， 各種養(yǎng)殖環(huán)境脅迫導(dǎo)致魚(yú)體免疫力降低[1]， 大菱鲆養(yǎng)殖過(guò)程中如腸炎及腹水病等疾病頻發(fā)， 進(jìn)而帶來(lái)藥物使用問(wèn)題， 2006年及2015年的2次大菱鲆藥物殘留事件也使得大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)遭受重創(chuàng)。因此， 亟需開(kāi)發(fā)水產(chǎn)綠色飼料免疫增強(qiáng)劑以提高大菱鲆的免疫力。

中草藥富含多糖、脂肪、維生素和微量元素等多種動(dòng)物機(jī)體所需要的營(yíng)養(yǎng)成分， 及生物堿、皂苷、揮發(fā)油和色素等生物活性物質(zhì)[2]， 兼具營(yíng)養(yǎng)與藥效的雙重作用， 具有無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留且經(jīng)濟(jì)易得等優(yōu)點(diǎn)， 能夠增強(qiáng)魚(yú)類的抗氧化與免疫力， 并通過(guò)提高攝食及改善腸道消化功能而促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)[3，4]。復(fù)方中草藥經(jīng)合理配伍， 不同的活性成分能夠表現(xiàn)出特定的協(xié)同效應(yīng)， 比單一中草藥更有效[5]。目前關(guān)于飼料中添加復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆影響的研究報(bào)道較少， 且中草藥配方和添加方式各異效果也有差別[6—9]?！八木訙笔侨藚?、白術(shù)、茯苓和甘草四味基本中草藥為主的古方劑，其具有健脾益氣、治療胃腸功能紊亂和改善腸道黏膜免疫功能的藥理作用[10]。采用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法分析“四君子湯”的主要活性化學(xué)成分為人參皂甙(來(lái)自人參)、黃酮類和三萜化合物(來(lái)自甘草)[11]。本研究在傳統(tǒng)方劑“四君子湯”的基礎(chǔ)上， 篩選了9種中草藥進(jìn)行配伍， 旨在探討這種復(fù)方中草藥的不同劑量對(duì)大菱鲆幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、飼料利用及相關(guān)免疫指標(biāo)的影響， 為復(fù)方中草藥在大菱鲆養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)飼料

本研究以9種中草藥原材料配伍成復(fù)方中草藥添加劑， 以水煎劑的形式在基礎(chǔ)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%和4%的復(fù)方中草藥制成4種試驗(yàn)飼料(對(duì)照組、1%組、2%組和4%組)。實(shí)驗(yàn)所用中草藥購(gòu)于河北省石家莊市康仁堂大藥房。復(fù)方中草藥由黨參(Codonopsis pilosulaNannf.)、白術(shù)(Atractylodes macrocephalaKoidz.)、茯苓(Poria cocosWolf.)、熟地黃(Rehmannia glutinosaLibosch.)、甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、山楂(Crataegus pinnatifidaBunge.)、五倍子(Rhus chinensisMill.)、梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)和生姜(Zingiber officinaleRoscoe.)9種中草藥組成， 配比為6∶5∶3∶3∶2∶2∶1∶1∶1。各中草藥原材料經(jīng)粉碎過(guò)40目篩， 按照方劑配伍置于不銹鋼鍋中逐級(jí)混勻， 加蒸餾水常溫浸泡30min， 煮沸50min， 將藥汁過(guò)濾倒出， 得到復(fù)方中草藥的水煎劑， 使5 mL藥液相當(dāng)于1 g中草藥?；A(chǔ)飼料以白魚(yú)粉和雞肉粉為主要蛋白源、α-淀粉為主要糖源配制而成， 飼料中蛋白質(zhì)水平與脂肪水平的設(shè)定參考Li等[12]和彭墨[13]的結(jié)果， 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。將中草藥水煎劑以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%和4%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中形成4種試驗(yàn)飼料， 混合均勻后制成直徑為3.0 mm的軟顆粒飼料， 存放于-20℃的冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and proximate composition of the control diet

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)與養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆購(gòu)自天津盛億水產(chǎn)有限公司。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行14d馴化， 使大菱鲆幼魚(yú)能適應(yīng)實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖環(huán)境。馴化期間每天2次(8:00和18:00)飽食投喂基礎(chǔ)飼料。在馴化結(jié)束后， 禁食24h稱重并隨機(jī)分組。1140尾大小均勻， 體質(zhì)健康的大菱鲆幼魚(yú)[(22.01±0.01) g]隨機(jī)放入12個(gè)長(zhǎng)方體玻璃纖維缸(長(zhǎng)2 m、寬1.2 m和高1 m)， 每組3個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)95尾。

養(yǎng)殖用水為沙濾后的自然海水， 每日換水2次，每次換水1/2。光照采用自然光照加人工光照， 光周期為14L∶10D。每天8:00和18:00進(jìn)行飽食投喂。投喂30min后收集殘餌并烘干稱重， 以校正攝食量。試驗(yàn)期間保證溶氧充足， 水質(zhì)條件如下: 溶氧大于6.0 mg/L， 鹽度25‰—28‰， 水溫15—18℃，氨氮濃度小于0.05 mg/L。正式養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期為40d。

1.3 樣品采集及測(cè)定

樣品采集在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后， 對(duì)大菱鲆禁食24h， 稱量并記錄各缸中大菱鲆的總尾數(shù)和總體重。每缸隨機(jī)選取5尾魚(yú)， 稱重并測(cè)量體長(zhǎng)， 裝入密封袋中于-20℃冰箱中保存， 用于進(jìn)行魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)組成的分析。每缸隨機(jī)取5尾魚(yú)進(jìn)行解剖， 取出完整內(nèi)臟團(tuán)稱重并記錄， 然后從內(nèi)臟團(tuán)中剝離肝臟、脾臟并稱重以計(jì)算臟體比、肝體比和脾指數(shù)等指標(biāo)。另外每缸再隨機(jī)取5尾魚(yú)， 用經(jīng)肝素鈉潤(rùn)洗過(guò)的注射器尾靜脈取血， 3000×g離心15min， 獲得血漿用于非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定。

樣品分析飼料與魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)組成: 飼料與魚(yú)體水分采用105℃直接干燥法(GB/T6435)測(cè)定。粗蛋白采用Foss全自動(dòng)凱氏定氮儀Kjeltec8420測(cè)定。粗脂肪采用索氏提取法(GB/T6433)測(cè)定。粗灰分采用馬弗爐灼燒法(GB/T6438)測(cè)定。能量采用Parr6200全自動(dòng)氧彈熱量?jī)x測(cè)定。

非特異性免疫指標(biāo): 采用比濁法測(cè)定血漿溶菌酶(LZM)的活力; 利用免疫比濁法測(cè)定血漿免疫球蛋白(IgM)和補(bǔ)體C3的含量。以上指標(biāo)均采用自南京建成生物技術(shù)研究所提供試劑盒。

指標(biāo)計(jì)算增重率(WGR， %)=100 ×(終末體重-初始體重)/終末體重

特定生長(zhǎng)率(SGR， %/d)=100×(ln終末體重-ln初始體重)/d

攝食率(FR， %/d)=100×攝食量/ [t×(終末體重+初始體重)/2]

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量/(終末體重-初始體重)

存活率(SR， %)=100×終末魚(yú)尾數(shù)/初始魚(yú)尾數(shù)

肥滿度(CF， g/cm3)=100×體重/體長(zhǎng)3

臟體比(VSI)=100×內(nèi)臟團(tuán)重/體重

肝體比(HSI)=100×肝臟重/體重

脾指數(shù)(SI)=100×脾臟重/體重

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示， 采用Statistica10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)， 若差異顯著時(shí)進(jìn)行Duncan’s多重比較， 顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)與飼料利用的影響

復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆幼魚(yú)的攝食率無(wú)顯著影響(P≥0.05)， 但顯著影響了大菱鲆的終末體重、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)(P＜0.05)。1%組大菱鲆幼魚(yú)終末均重、增重率、特定生長(zhǎng)率顯著高于其他各組(P＜0.05)， 而4%組的生長(zhǎng)顯著低于其他各組(P＜0.05)。1%組的飼料系數(shù)顯著低于其他各組(P＜0.05)， 其他各組間無(wú)顯著差異(P≥0.05; 表2)。

表2 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)與飼料利用的影響Tab. 2 The effect of Chinese herbal medicine on growth and feed utilization of turbot

2.2 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆形體指標(biāo)的影響

結(jié)果表明復(fù)方中草藥對(duì)臟體比及肝體比沒(méi)有顯著影響， 但顯著影響了大菱鲆的肥滿度與脾指數(shù)，隨著添加水平的升高， 呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)(表3)。1%組大菱鲆幼魚(yú)肥滿度顯著高于對(duì)照組和4%組(P＜0.05)， 1%組的脾指數(shù)顯著高于其他各組(P＜0.05)， 其余各組之間均無(wú)顯著差異(P≥0.05)。

表3 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆形體指標(biāo)的影響Tab. 3 The effect of Chinese herbal medicine on physical indicators of turbot

2.3 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)組成的影響

由表4可知， 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆幼魚(yú)的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和能量均無(wú)顯著影響(P≥0.05)。

表4 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)組成的影響Tab. 4 The effect of Chinese herbal medicine on body composition of turbot

2.4 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)的影響

由表5可見(jiàn)， 復(fù)方中草藥顯著影響了大菱鲆幼魚(yú)血漿中補(bǔ)體C3和LZM的含量(P＜0.05)， 但對(duì)IgM含量沒(méi)有顯著影響(P≥0.05)。1%組大菱鲆幼魚(yú)血漿中補(bǔ)體C3和LZM含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05); 2%組大菱鲆幼魚(yú)血漿中LZM含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)， 而補(bǔ)體C3含量與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P≥0.05)。

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆攝食生長(zhǎng)與飼料利用的影響

本研究所采用9種中草藥活性成分物質(zhì)包括多糖類、黃酮類、萜類化合物(單萜類、三萜類、倍半萜烯類、環(huán)烯醚萜)及各中草藥特有的活性化學(xué)成分(黨參-聚乙炔、多烯; 甘草-甘草甜素; 五倍子-沒(méi)食子酸， 生姜-姜辣素、姜酮酚， 梔子-藏紅花素)[15—23]。在本實(shí)驗(yàn)條件下， 添加1%的復(fù)方中草藥可顯著提高大菱鲆的生長(zhǎng)性能和飼料利用， 且此復(fù)方中草藥對(duì)攝食率無(wú)顯著影響， 因此， 本實(shí)驗(yàn)復(fù)方中草藥可能是通過(guò)其所富含的多種營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)增強(qiáng)機(jī)體新陳代謝， 促進(jìn)蛋白質(zhì)合成來(lái)提高魚(yú)體飼料利用能力， 從而達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)性能的作用。前人研究表明中草藥活性成分可提高魚(yú)體消化酶活性[24]、調(diào)節(jié)腸道微生物[25]; 中草藥多酚類、黃酮類、多糖類和萜類化合物可提高魚(yú)體抗氧化能力和抗病力，從而間接促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)[26]; 另外， 中草藥有效成分可促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成及刺激生長(zhǎng)激素-胰島素樣生長(zhǎng)因子軸1(GH-IGF-1軸)[27，28]。在克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的研究中， 飼料中添加0.05%—0.30%的黨參多糖可顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)和飼料利用[29]。同樣， 在大頭亮鲃(Luciobarbus capito)的飼料中添加0.1%—0.4%熟地黃多糖顯著提高特定生長(zhǎng)率和降低飼料系數(shù)[28]。使用0.8%—1.0%的干姜來(lái)飼喂南亞野鯪(Labeo rohita)幼魚(yú)60d， 可顯著提高特定生長(zhǎng)率[30]。在水產(chǎn)動(dòng)物中使用復(fù)方中草藥也可發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。由白術(shù)、茯苓和甘草等組成的復(fù)方中草藥也提高了大菱鲆的增重率， 且降低了飼料系數(shù)[9]。另外， 陳輝輝等[31]在飼料中添加甘草、山楂和茯苓等11味中草藥飼喂凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)， 降低了飼料系數(shù)， 提高了特定生長(zhǎng)率和增重率。在花鱸(Lateolabrax japonicus)的研究中， 飼喂含有 2%復(fù)方中草藥的特定生長(zhǎng)率和增重率卻顯著低于0.8%組[24]， 這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致， 本實(shí)驗(yàn)中高劑量復(fù)方中草藥會(huì)導(dǎo)致特定生長(zhǎng)率下降可能是由于中草藥導(dǎo)致大菱鲆過(guò)度免疫反應(yīng)， 從而消耗了更多的能量。

表 5 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab. 5 The effect of Chinese herbal medicine on nonspecific immune indicators of turbot

復(fù)方中草藥的配方與添加形式會(huì)對(duì)中草藥的藥效發(fā)揮和適宜添加量產(chǎn)生影響[32]。單味藥或單一活性成分存在作用不全面的缺點(diǎn)， 復(fù)合方劑也不應(yīng)是2種以上中草藥的簡(jiǎn)單疊加， 傳統(tǒng)方劑中某些固定配伍性的中草藥可能并不適用于水生動(dòng)物， 制約著中草藥作為魚(yú)類飼料添加劑的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)所用方劑是通過(guò)已知漁用中草藥的顯著療效與中藥學(xué)“君臣輔使”理論的結(jié)合， 適當(dāng)加減藥劑藥量進(jìn)行的合理配伍， 以達(dá)到促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高免疫的目的。本實(shí)驗(yàn)添加1%的復(fù)方中草藥顯著提高了大菱鲆的肥滿度， 2%組和4%組魚(yú)的肥滿度也有所提高， 這與中草藥促進(jìn)鯉、斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)的肥滿度升高的結(jié)果一致[33，34]， 肥滿度與魚(yú)類的營(yíng)養(yǎng)狀況直接相關(guān)[35]， 也進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中1%的復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆的機(jī)體生理和營(yíng)養(yǎng)狀況產(chǎn)生了良好效果。

3.2 復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響

非特異性免疫系統(tǒng)是魚(yú)類抵御病原侵襲的第一道防線。中草藥及其提取物含有多糖、黃酮類、皂苷、揮發(fā)油、多酚類、生物堿、萜類、凝集素和多種氨基酸等活性成分， 能夠刺激補(bǔ)體和溶菌酶等的活性和抗體反應(yīng)， 促進(jìn)吞噬細(xì)胞的功能，提高殺菌活性， 來(lái)對(duì)抗由細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等引起疾病[36]。以前研究發(fā)現(xiàn)， 黨參對(duì)大黃魚(yú)(Larimichthys croceaRichardson.)[37]、鯽[38]和仿刺參(Apostichopus japonicus)[39]， 含白術(shù)和山楂的復(fù)方對(duì)黃鱔(Monopterus albus)[40]， 茯苓對(duì)施氏鱘(Acipenser schrenckiBrandt.)[41]， 熟地黃和甘草對(duì)鯉[42，43]，五倍子對(duì)鳙(Aristichthys nobilis)[44]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[45]， 梔子對(duì)克氏原螯蝦(Procambarus clarkiaGirard.)[46]， 生姜對(duì)尖吻鱸(Lates calcariferBloch.)[47]和斑馬魚(yú)(Danio rerio)[48]等均顯示出提高免疫功能和增強(qiáng)抗炎抗菌能力的作用。復(fù)方中草藥經(jīng)合理配伍， 不同的活性成分能夠表現(xiàn)出特定的協(xié)同效應(yīng)， 可能比單一草藥更有效[5]。本研究中的復(fù)方采用了具有健脾益氣、清熱解毒、收濕斂瘡和抗炎殺菌等功效的中草藥， 結(jié)果表明其可顯著提高大菱鲆的補(bǔ)體C3和溶菌酶活性， 這也與李華等[7]和路晶晶等[9]的結(jié)果相似， 能夠提高大菱鲆免疫功能。

脾臟作為魚(yú)體內(nèi)重要的免疫器官， 其增殖和發(fā)育與魚(yú)類的免疫功能密切相關(guān)[49]。在草魚(yú)、羅非魚(yú)和黃顙魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)， 中草藥可顯著促進(jìn)脾指數(shù)升高， 增強(qiáng)免疫力[50—52]。在本實(shí)驗(yàn)中1%組大菱鲆的脾指數(shù)顯著提高， 另兩組也較對(duì)照組略有提高，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中的復(fù)方中草藥有利于大菱鲆的脾臟發(fā)育， 具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

以前研究結(jié)果表明免疫增強(qiáng)劑對(duì)魚(yú)類免疫力的作用受給藥時(shí)間與添加劑量的綜合影響， 添加劑量與免疫增強(qiáng)作用之間并非總呈正相關(guān)[53，54]。羅非魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加0.025%—0.2%劑量的苦參(Sophora flavescensAit.)提取物時(shí)， 羅非魚(yú)的非特異性免疫指標(biāo)在0.1%時(shí)的增強(qiáng)作用最大[55]。本試驗(yàn)也表現(xiàn)出相似的結(jié)果， 添加2%和4%的高濃度組的免疫指標(biāo)均低于1%組， 說(shuō)明過(guò)高濃度的復(fù)方中草藥對(duì)魚(yú)類的免疫功能反而有一定的抑制作用。此外， 在對(duì)凡納濱對(duì)蝦連續(xù)投喂復(fù)方中草藥21d后發(fā)現(xiàn)， 其消化酶指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)分別在7d和14d達(dá)到最高值， 表明復(fù)方中草藥的作用與投喂時(shí)間長(zhǎng)短也有著直接聯(lián)系[56]。然而， 本研究?jī)H在40d時(shí)分析了免疫指標(biāo)， 是否還存在更好的投喂時(shí)間和方式還需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究中的復(fù)方中草藥合煎劑在飼喂大菱鲆40d后顯著提高了大菱鲆的特定生長(zhǎng)率， 降低了飼料系數(shù)， 顯著提高了肥滿度和脾指數(shù)， 并通過(guò)提高大菱鲆血漿補(bǔ)體C3含量和溶菌酶活力增強(qiáng)了大菱鲆的非特異性免疫力。綜合分析， 本復(fù)方中草藥在大菱鲆配合飼料中的推薦添加量為1%。