反相液相色譜法測(cè)定雷替曲塞中對(duì)映異構(gòu)體

吳晶，王足兵，柴雨柱

反相液相色譜法測(cè)定雷替曲塞中對(duì)映異構(gòu)體

吳晶，王足兵，柴雨柱

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

目的：建立雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)方法。方法：采用Daicel CHIRALPAK AGP（3.0 mm×150 mm，5 μm）為色譜柱；以0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液（稱取十二水合磷酸氫二鈉17.9 g，加水1 000 mL使溶解，搖勻，用10%磷酸調(diào)pH值至6.5，攪拌均勻，即得）-異丙醇（98∶2）為流動(dòng)相，等度洗脫；流速為0.5 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm。結(jié)果：專屬性良好，對(duì)映異構(gòu)體在限度質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～200%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，≥0.999 7；回收率在105.5%～106.9%范圍內(nèi)，RSD小于2.0%（=9）；精密度和重復(fù)性RSD均小于2.0%；耐用性良好。結(jié)論：方法精密度好、準(zhǔn)確度高，可用于本品的對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)。

雷替曲塞； 對(duì)映異構(gòu)體； 高效液相色譜儀法（HPLC）

雷替曲塞主要用于治療晚期結(jié)直腸癌，為抗代謝類葉酸類似物，通過細(xì)胞膜外還原型葉酸鹽載體系轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，并代謝形成多聚谷氨酸類化合物，在細(xì)胞內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間存在，可以起到特異性抑制胸苷酸合酶活性，減少脫氧核糖核酸的修復(fù)與合成所需要的脫氧三磷酸胸苷，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[1-3]。

雷替曲塞分子結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)手性中心，除雷替曲塞主成分外，只具有一個(gè)手性異構(gòu)體，即對(duì)映異構(gòu)體。雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體沒有藥效作用，甚至有毒副作用，因此對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的分析控制極為重要[4-5]。現(xiàn)有技術(shù)主要通過正相液相色譜法和毛細(xì)管電泳法兩種方法檢測(cè)雷替曲塞及其制劑中的對(duì)映異構(gòu)體，正相液相色譜法使用正己烷和異丙醇為洗脫溶劑，氣味難聞，保留時(shí)間容易漂移；毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性差，不適合用于藥品質(zhì)量控制。本文建立了以反相液相色譜法測(cè)定雷替曲塞原料藥中光學(xué)異構(gòu)體的方法，以期為該原料藥質(zhì)量控制提供依據(jù)[6-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），色譜工作站：Agilent OpenLAB CDS；電子分析天平（瑞士METTLER公司）。

1.2 試藥

供試品（雷替曲塞，南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)：122161101），對(duì)照品（雷替曲塞對(duì)照品，南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)：170101；對(duì)映異構(gòu)體，南京正大天晴制藥有限公司，批號(hào)：20161115），異丙醇、磷酸均為色譜級(jí)，磷酸二氫鉀為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Daicel CHIRALPAK AGP（3.0 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液 （稱取十二水合磷酸氫二鈉17.9 g，加水1 000 mL使溶解，搖勻，用10%磷酸調(diào)pH值至6.5，攪拌均勻，即得）-異丙醇（98∶2），等度洗脫；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

空白溶劑：0.05 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液-異丙醇（98∶2）。

對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品貯備液：取對(duì)映異構(gòu)體適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含對(duì)映異構(gòu)體125mg的溶液。

對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品貯備液適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含對(duì)映異構(gòu)體1.25mg的溶液。

供試品溶液：取雷替曲塞適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含雷替曲塞250mg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取雷替曲塞適量及對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1 mL含雷替曲塞250mg，含對(duì)映異構(gòu)體1.25mg的溶液。系統(tǒng)適用性溶液：取雷替曲塞適量及對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，用溶劑溶解并稀釋制成每1 mL含雷替曲塞250mg，含對(duì)映異構(gòu)體1.25mg的溶液。

2.3 專屬性

精密量取空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。空白溶劑對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)無(wú)干擾，主峰與對(duì)映異構(gòu)體的分離度大于1.5，見圖1-4，該方法的專屬性良好。

圖1 空白溶劑色譜圖

圖2 對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

圖4 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.4 線性關(guān)系

取對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品貯備液，用溶劑配制成相當(dāng)于限度質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～200%的線性系列溶液。精密量取上述系列濃度溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，進(jìn)行線性回歸分析?；貧w方程為= 1.395 3×106+2.366 8×103，=0.999 7，表明對(duì)映異構(gòu)體在限度質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～200%范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限與定量限

取對(duì)映異構(gòu)體貯備液適量，逐級(jí)稀釋，當(dāng)對(duì)映異構(gòu)體色譜峰的信噪比不小于10時(shí)，該溶液作為定量限溶液；當(dāng)對(duì)映異構(gòu)體色譜峰的信噪比不小于3時(shí)，該溶液作為檢測(cè)限溶液。分別精密量取溶液

10 μL進(jìn)樣分析，對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)限質(zhì)量濃度為12.8 ng·mL-1,相當(dāng)于供試品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.005%；定量限質(zhì)量濃度為38.4 ng·mL-1,相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.02%，該方法靈敏度良好。

2.6 回收率

取本品細(xì)粉適量，平行9份，平均分成3組，加入對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品貯備液各適量，使供試品溶液中含對(duì)映異構(gòu)體分別為限度質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%及120%。按外標(biāo)法計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體的含量，計(jì)算回收率，回收率在105.5.0%～106.9%，RSD均小于2.0%（=9），該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.7 重復(fù)性

平行配制6份加標(biāo)供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算6份供試品溶液中對(duì)映異構(gòu)體的含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%，RSD為1.5%（=6），該方法的重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度

不同人員，不同時(shí)間使用不同設(shè)備，按照重復(fù)性檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合6份重復(fù)性結(jié)果，計(jì)算12份加標(biāo)供試品溶液中對(duì)映異構(gòu)體的含量，含量RSD為1.9%（=12）；該方法的中間精密度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性

取系統(tǒng)適用性溶液分別于配制結(jié)束后室溫放置0、2、4、6、8和12 h進(jìn)樣。考察12 h內(nèi)光學(xué)異構(gòu)體保留時(shí)間、峰面積和含量的變化情況。結(jié)果顯示光學(xué)異構(gòu)體與雷替曲塞保留時(shí)間及峰面積無(wú)明顯變化，光學(xué)異構(gòu)體含量基本不變，溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性

適當(dāng)調(diào)整色譜條件參數(shù)（流動(dòng)相比例、流動(dòng)相pH值、流速），系統(tǒng)適用性溶液主峰與對(duì)映異構(gòu)體分離度均大于1.5，供試品中對(duì)映異構(gòu)體結(jié)果基本一致，可見方法耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取多批雷替曲塞原料藥，按照上述驗(yàn)證后的對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)方法對(duì)其對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，我司各批次雷替曲塞原料對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果均符合限度要求。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

雷替曲塞及其對(duì)映異構(gòu)體均在226 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收，選擇226 nm作為本品對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜柱的選擇

大賽璐（Daicel）CHIRALPAK AGP為蛋白質(zhì)鍵合型手性柱，硅膠表面共價(jià)鍵合有α1-酸性糖蛋白，具有極強(qiáng)的手性識(shí)別能力，適用于反相系統(tǒng)。因此選擇此色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本研究中雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)能達(dá)到理想的分離效果，對(duì)方法的專屬性、靈敏度、精密度和耐用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于雷替曲塞對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)，為合格的雷替曲塞的生產(chǎn)提供了有效的質(zhì)控方法。

[1]黃榮華. 馬愛霞. 雷替曲塞治療結(jié)直腸癌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物評(píng)價(jià),2014，31(1):14-16.

[2]彭登付，王勇，胡冰. 雷替曲塞治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用[J]. 國(guó)際腫瘤學(xué)雜志,2013，40(12):933-935.

[3] KELLY C, BHUVA N, HARRISON M, et al. Use of raltitrexed as an alternative to 5-fluorouracil and capecitabine in cancer patients with cardiac history [J]., 2013, 49(10):2303-2310.

[4]張秋佳，陳雷，鄒德超，等. HPLC法測(cè)定西他沙星異構(gòu)體[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2012,37(3):237-239.

[5]戴蓉,徐家根,刁巖忠. 改進(jìn)HPLC法測(cè)定雷替曲塞原料藥中光學(xué)異構(gòu)體[J]. 中國(guó)藥房,2017,28(30):4295-4297.

[6]夏平,鄒春陽(yáng),孟祥軍. 雙氯芬酸鉀軟膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)[J]. 遼寧化工,2018,47(3):204-206.

[7]趙迎春,韓繼永. HPLC法測(cè)定卡巴他賽的有關(guān)物質(zhì)[J]. 遼寧化工,2017,46(12):1225-1228.

[8]周波,鄒春陽(yáng),龐小琳,等. HPLC法測(cè)定雙氯芬酸鉀中有關(guān)物質(zhì)[J]. 遼寧化工,2012,41(3):322-324.

[9]王鳳秋,鄒春陽(yáng),孟祥軍. HPLC法測(cè)定阿莫西林鈉克拉維酸鉀有關(guān)物質(zhì)[J]. 遼寧化工,2012,41(5):537-538.

Determination of Enantiomers in Retitracin by RP-HPLC

,,

（Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing Jiangsu 210046, China）

A method for the determination of the enantiomers of raltitrexed was established. Daicel CHIRALPAK AGP (3.0mm×150mm, 5μm) was used as chromatographic column,0.05mol·L-1disodium hydrogen phosphate solution (weighing 17.9g disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, adding 1000mL water to dissolve, shake well, adjusting the pH value to 6.5 with 10% phosphoric acid, and stirring well)-isopropanol (98∶2) was used as mobile phase to elute equally, the flow rate was 0.5mL·min-1and the detection wavelength was 226nm. The results showed that the specificity of the method was good, and the linear relationship between enantiomers was good in the mass fraction range of 20%～200%,≥ 0.9997, the recovery was in the range of 105.5%～106.9%,was less than 2.0% (= 9), and precision and repeatabilitywas less than 2.0%.So,the method has good precision and high accuracy, and can be used for the determination of enantiomers of this product.

Retitracin; Enantiomer; High performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1004-0935（2022）02-0291-03

2021-10-21

吳晶（1986-），男，浙江金華人，工程師，碩士學(xué)位，2012年畢業(yè)于中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)化學(xué)專業(yè)，研究方向：創(chuàng)新藥及仿制藥研發(fā)。

柴雨柱（1976-），男，工程師，碩士學(xué)位，研究方向：藥物研發(fā)。