基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金銀花抗動脈粥樣硬化的作用機制*

曾長林 胡子毅 魏明全※ 李人亮 張 平 易 瑩

（1.江西省永修縣人民醫(yī)院中醫(yī)科，江西 永修 330300；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，江西 南昌 330006；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病最普遍的病變基礎(chǔ)。由于脂質(zhì)沉積在動脈血管內(nèi)壁，并伴有平滑肌細胞和纖維基質(zhì)增生，逐漸形成分散或成片的粥樣斑塊，導(dǎo)致血管管腔變窄不穩(wěn)定的粥樣斑塊還容易破裂出血形成血栓，從而導(dǎo)致急性心腦血管疾病的發(fā)生[1]。金銀花首載于《名醫(yī)別錄》，味甘，性寒，歸肺、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒之功?，F(xiàn)代藥理研究[2，3]發(fā)現(xiàn)金銀花具有抗炎、抑制血小板凝聚、抗氧化、提高免疫力等諸多功用。近年來有學(xué)者[4]提出運用清熱解毒法防治AS。因此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討金銀花的藥物活性成分及其治療AS 可能的作用機制，為該藥對改善AS 的體內(nèi)外研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所涉及數(shù)據(jù)庫包括：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù) 庫（http：//www.genecards.org/）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）。

1.2 金銀花活性成分的獲取及靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對金銀花的化學(xué)成分進行檢索，設(shè)置口服吸收利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進行活性成分的篩選[5]，在Drugbank 數(shù)據(jù)庫中查找金銀花活性成分對應(yīng)的有效靶點。

1.3 動脈粥樣硬化靶標的預(yù)測 以“Atherosclerosis”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards、Drugbank、PharmGkb 和TTD數(shù)據(jù)庫進行檢索，去除重復(fù)及假陽性的靶點后取并集，從而獲取AS 的靶標基因。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）與“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Venn diagrams 在線工具將上述所獲得的藥物靶標與疾病靶標進行映射，取交集基因后，利用String 數(shù)據(jù)庫進行靶標蛋白互作分析，物種設(shè)為“Homo sapiens”（人類），最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度0.9“highest confidence”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置[6]。通過Cytoscape 3.7.2 軟件繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，運用cytoHubba 插件進行核心靶點的篩選。

1.5 基因本體論（GO）分類富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 通過R4.0.4 軟件中的Bioconductor 包進行GO 和KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 金銀花的有效成分與靶點 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出17 個活性成分，對應(yīng)196 個靶標蛋白。

2.2 動脈粥樣硬化靶標的預(yù)測 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索出4481 個疾病靶標，設(shè)置相關(guān)系數(shù)≥1 后篩選出2371 個靶標，通過Drugbank 數(shù)據(jù)庫檢索出46 個疾病靶標，通過PharmGkb 數(shù)據(jù)庫檢索出26 個疾病靶標，通過TTD 數(shù)據(jù)庫檢索出22 個疾病靶標。對上述結(jié)果進行去并集并剔除重復(fù)值后，最終獲得2419 個AS 靶標。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)與“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Venn diagrams 在線工具將金銀花對應(yīng)靶標與AS 靶標進行映射，共獲得129 個共有靶標，即為金銀花治療AS 的關(guān)鍵靶標。利用String 數(shù)據(jù)庫將映射所得的129 個靶點制作成PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖1。利用cytoHubba 插件篩選出得分最高的10 位基因依次為JUN、RELA、MAPK1、MYC、IL6、IL4、IL1B、AKT1、MAPK14 和IL2。將整理得到金銀花活性成分及關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中，槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）等的度值較高，均能與25 個以上的靶點相連接，因此推測這5 個成分可能是金銀花發(fā)揮治療AS 作用的主要活性成分。

圖1 金銀花治療AS 的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 與KEGG 富集分析 利用R 4.0.2 軟件中的Bioconductor 軟件包對129 個關(guān)鍵靶標進行功能富集和主要作用通路分析，其中GO 功能富集分析得到GO 條目2584 個（P ＜0.01），包括生物過程（BP）2328 個，分子功能（MF）172 個和細胞組分（CC）84 個。KEGG 通路富集篩選得到信號通路162 條（P ＜0.01），選取排名在前20 位的通路繪制氣圖，見圖3。

圖3 金銀花治療AS 關(guān)鍵靶標的KEGG 通路富集分析

3 討論

AS 在中醫(yī)學(xué)中無相對應(yīng)病名。脂質(zhì)代謝紊亂作為AS形成的主要病因，由于其臨床表現(xiàn)與痰濁類的表現(xiàn)一致，故常將其歸屬于“痰濁”。也有學(xué)者認為AS 當(dāng)屬于中醫(yī)的“濁毒”，認為“濁毒”與細胞炎癥通路之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)，提出濁邪伏脈是AS 形成的關(guān)鍵病機，進一步從“濁毒”理論探討了AS 治療策略[7，8]。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建“成分-靶點-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從整體和系統(tǒng)出發(fā)，闡釋和分析研究對象的藥理學(xué)機制，為研究中藥成分復(fù)雜作用機制提供新的思路。

本研究篩選出金銀花與AS 的交集基因129 個，通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇和豆甾醇這5 個成分可能是金銀花發(fā)揮治療AS 作用的主要活性成分。研究顯示槲皮素抑制小鼠腹腔巨噬細胞中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激的活性氧物種的過量生產(chǎn)來減輕AS[9]。山奈酚可通過其抗氧化和抗炎作用治療AS，并通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路和增加內(nèi)皮細胞自噬來緩解ox-LDL誘導(dǎo)的細胞凋亡[10，11]。木犀草素可通過在體外抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），減少ox-LDL 誘導(dǎo)的炎癥，顯著減輕高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠的AS[12]。β-谷甾醇可通過增加p21cip1蛋白水平抑制VSMC 增殖，進而抑制CDK2 活性，最終阻斷細胞周期的進展，從而發(fā)揮抗AS 的活性[13]。豆甾醇是一種與膽固醇結(jié)構(gòu)相似的植物甾醇，因其抗AS、降低膽固醇的作用而被廣泛研究，修飾脂蛋白中豆甾醇的存在促進了膽固醇外流，抑制了巨噬泡沫細胞對脂質(zhì)負荷的炎性細胞因子分泌[14]。

本研究通過MCC 算法篩選出金銀花治療AS 的10 個關(guān)鍵基因，即JUN、RELA、MAPK1、MYC、IL6、IL4、IL1B、AKT1、MAPK14 和IL2。其中IL1B、IL2、IL4 和IL6 均屬于白細胞介素家族，白細胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導(dǎo)T、B 細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。MAPK1 和MAPK14 屬于絲裂原激活的蛋白激酶，與巨噬細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)和AS 基因表達有關(guān)[15]。研究JUN 證明與高膽固醇血癥誘導(dǎo)的AS 有關(guān)[16]。RELA 是NF-κB 家族最重要的功能子單位，而NF-κB 又是炎癥過程的主要調(diào)節(jié)器，在AS 中起著關(guān)鍵作用[17]。MYC 基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，包括c-Myc，N-Myc 和L-Myc。原癌基因c-Myc 的表達改變與細胞內(nèi)氧化應(yīng)激和增加的DNA 損傷有關(guān)，參與了體外和體內(nèi)早期AS 形成的氧化敏感機制的啟動[18]。研究[19]顯示AKT1 可通過抑制Fox-O3a 及其下游基因包括凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1），在血管重塑和AS 形成過程中是VSMCs 存活的主要調(diào)節(jié)因子，AKT1 的下調(diào)抑制了血管平滑肌細胞的遷移和存活，并改善了AS 過程中斑塊薄弱和心功能不全的特征。

基于KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，金銀花可直接作用于血脂和AS 以及流體剪切應(yīng)力和AS 通路。此外還可作用于PI3K-Akt 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路等與AS 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路。PI3K-Akt 信號通路是細胞中經(jīng)典的信號通路，參與細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、炎癥、缺血損傷和腫瘤進展等多種生理病理過程。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）被廣泛認為是糖尿病動脈硬化發(fā)病的重要誘導(dǎo)因素，糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生的AGEs 通過激活A(yù)GE-RAGE 信號通路，然后激活FSTL1 的表達，從而促使IL-1β、TNF-α 等炎性因子的表達，進一步導(dǎo)致AS 的發(fā)生[20]。另外TNF 信號通路也與炎癥反應(yīng)有關(guān)，參與AS 的發(fā)展過程[21]。

綜上所述，金銀花可能主要通過β-胡蘿卜素、木樨草素、山柰酚和槲皮素等多種活性成分作用于JUN、RELA、IL1B、IL6 和MAPK1 等基因，可直接調(diào)控血脂和AS、流體剪切應(yīng)力和AS 通路起到抗動脈粥樣硬化作用。本研究發(fā)現(xiàn)金銀花在治療動脈粥樣硬化方面具有很大潛力，值得進一步通過體內(nèi)外實驗進行驗證。