野薔薇內(nèi)源多胺的HPLC測(cè)定方法及其組織變化規(guī)律

陳 銳,陳金萍，楊雯翔，鄧致運(yùn)，程文翰*

(1.荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000； 2.特色花卉生物育種湖北省工程研究中心，湖北 荊門 448000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830052)

多胺(polyamines, 簡(jiǎn)稱PAs)存在于幾乎所有生物體內(nèi)，多胺分為腐胺(putrescine, 簡(jiǎn)稱Put)、亞精胺(spermidine, 簡(jiǎn)稱Spd)、精胺(spermine, 簡(jiǎn)稱Spm)及熱精胺[1].多胺在植物體內(nèi)被認(rèn)為像“第二信使”般發(fā)揮重要作用，如調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜中依賴電壓的內(nèi)向K+通道，并調(diào)節(jié)氣孔孔徑[2].研究表明,多胺是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[3],能參與高等植物體內(nèi)的許多生理過程，諸如形態(tài)發(fā)生、根系形成、花發(fā)育、果實(shí)發(fā)育以及衰老等.多胺可在外植體成花過程中積累，是成花的物質(zhì)基礎(chǔ)[4].多胺的合成從鳥氨酸的合成開始，腐胺是合成途徑的中心產(chǎn)物.腐胺是精氨酸經(jīng)兩條不同途徑形成的：一條是由鳥氨酸通過鳥氨酸脫羧酶脫羧直接形成腐胺，另一條是由精氨酸經(jīng)過精胺酸脫羧酶的催化形成鯡精胺，鯡精胺水解成N-氨甲基腐胺后再形成腐胺.腐胺再經(jīng)連續(xù)加入氨丙基殘基生成亞精氨和精氨，而氨丙基是由S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脫羧產(chǎn)生的脫羧SAM而來(lái).脫羧S-腺苷甲硫氨酸除了作為甲基的供體外，也是多胺和乙烯合成的共同前體.多胺經(jīng)由二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)代謝產(chǎn)生過氧化氫，而過氧化氫是一種重要的信號(hào)分子，參與調(diào)控各種生物過程.此外，多胺合成上游的前體精氨酸，在一氧化氮合成酶作用下可以合成一氧化氮(NO)，而NO也是生物體內(nèi)最重要的信號(hào)分子之一，具有很重要的生物學(xué)功能[5-6].在玉米幼胚的離體培養(yǎng)中，外源添加適量多胺，可有效提高根系活力，促進(jìn)再生，再生苗株高、葉長(zhǎng)、葉寬、鮮重均有顯著增加[7].棉花的相關(guān)研究表明,外源多胺可改變內(nèi)源多胺代謝,使內(nèi)源多胺水平增加；在陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中,多胺可提高誘導(dǎo)成苗率，表現(xiàn)為促進(jìn)下胚軸產(chǎn)生愈傷組織、胚性愈傷組織分化、早期胚狀體形成、成熟胚分化，最后形成再生植株，在不同時(shí)期,發(fā)揮主要作用的多胺不同[8].伏令夏橙的胚性愈傷組織中多胺含量較非胚性愈傷組織高,多胺對(duì)其體細(xì)胞胚發(fā)生表現(xiàn)為正調(diào)控[9].前人在對(duì)棉花[8]和伏令夏橙[9]的研究中還發(fā)現(xiàn)，腐胺有利于體細(xì)胞胚胎發(fā)生，隨著體胚發(fā)生過程，腐胺逐漸轉(zhuǎn)化為亞精胺和精胺，在胚狀體時(shí)期，亞精胺和精胺的水平顯著增加并達(dá)到最大值.在枸杞[10]中，腐胺含量先升后降，最后再升至最高，亞精胺只在胚性細(xì)胞分化早期出現(xiàn)，精胺只在胚狀體發(fā)育晚期出現(xiàn).此外,多胺可增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性,提高不同脅迫下植物的抗性，促進(jìn)生長(zhǎng)[11-17].

野薔薇(RosamultifloraThunb.)是薔薇科薔薇屬雙子葉植物，用途廣泛，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，但植株的高效再生是前提，而關(guān)于野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道較少，且體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率較低[18].多胺在野薔薇組織培養(yǎng)方面的作用目前未見報(bào)道,野薔薇不同器官和不同培養(yǎng)時(shí)期的組織多胺含量尚不清楚，多胺提取的方法及測(cè)定體系也鮮見報(bào)道.關(guān)于其他植物組織多胺提取的報(bào)道較多,如茶葉[19]、水稻[20]、棉花[21]等均采用高效液相色譜法，以苯甲酰氯做衍生化反應(yīng)劑，以甲醇為溶劑.但多胺含量受基因差異表達(dá)影響，不同種植物、不同器官，多胺含量也不盡相同[22]，因此，多胺的提取方法也可能不同，需針對(duì)不同植物材料建立不同的方法體系.筆者參照程文翰等[21]的方法,以野薔薇為材料,初步探索野薔薇組織多胺的提取方法及高效液相色譜(HPLC)測(cè)定方法,并用該法測(cè)定野薔薇組培不同階段愈傷組織及莖、葉、花等器官游離多胺的含量，探索野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中內(nèi)源多胺的變化規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)所有樣品材料均為當(dāng)?shù)匾八N薇,于荊楚理工學(xué)院內(nèi)取樣.分別取花瓣、花蕊、花苞、莖、葉片,培養(yǎng)3 h，3 d，5 d后的葉片,培養(yǎng)25 d的愈傷組織為材料,上述材料摘取后立即用液氮冷凍,后置于-70 ℃超低溫冰箱中保存,備用.

1.2 植物組織培養(yǎng)

在野薔薇生長(zhǎng)期(4月初)摘取新鮮幼嫩葉片,流水沖洗盡表面塵土后,移到超凈工作臺(tái)內(nèi)，用乙醇和升汞消毒滅菌，即得到處理好的無(wú)菌野薔薇葉片.滅菌流程如下：先用70%～75%乙醇浸泡30～60 s,立即用無(wú)菌水清洗3～5次,再用0.1%～0.2%的升汞浸泡10 min,再次用無(wú)菌水清洗3～5次.

將上述無(wú)菌葉片切成邊長(zhǎng)為0.5 cm × 0.5 cm的小四方塊,接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每皿均勻接種6片，接種時(shí)，應(yīng)使葉片背面接觸培養(yǎng)基,葉片正面朝上.完成接種后,放置于無(wú)菌組培室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃、光照周期16 h光照/8h黑暗、光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx.

1.3 試劑與儀器

多胺標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司，純度≥99%；甲醇為色譜純；高氯酸、氫氧化鈉、氯化鈉、苯甲酰氯、乙醚均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為超純水，電阻率為18.25 MΩ·cm；高效液相色譜儀型號(hào)為Waterse2695型，色譜柱型號(hào)為Waters C18 20 cm；低溫離心機(jī)型號(hào)為湘儀TGL-16.

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多胺標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定

參考程文翰等[21]的方法，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定：將多胺(Put, Spd, Spm)標(biāo)準(zhǔn)品配置成1 mmol·L-1的混合貯液，取40 μL混合液進(jìn)行苯甲?；磻?yīng)及測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.2 野薔薇器官及組織多胺的提取與測(cè)定

分別稱取0.2 g各野薔薇材料，用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，立即加入1.5 mL 5%預(yù)冷的高氯酸，渦旋2 min，冰浴浸提1 h后12 000 r·min-14 ℃離心20 min，取300 μL上清液于新的2mL離心管中，加入4 μL苯甲酰氯、300 μL 2 mol·L-1NaOH，渦旋30 s，37 ℃水浴衍生化反應(yīng)25 min后，加入400 μL飽和NaCl 、500 μL乙醚，渦旋1 min， 5 000 r·min-14 ℃離心5 min，小心吸取上層300 μL乙醚相于1.5 mL離心管中，打開管蓋，4 000 r·min-125 ℃離心，待乙醚完全揮發(fā)后，加入300 μL甲醇，渦旋5～10 min，靜置溶解1 h，最后8 000 r·min-14 ℃離心1.5 min以去除提取過程中可能含有的少量雜質(zhì)，收集苯甲酰多胺的甲醇溶解液至樣品瓶，再加甲醇定容至500 μL，待HPLC檢測(cè).每個(gè)野薔薇樣品生物學(xué)重復(fù)2次，技術(shù)重復(fù)3次.數(shù)據(jù)采用Excel 2019版、SPSS 26.0軟件處理，origin 9.6.5軟件繪圖.HPLC檢測(cè)參數(shù)：流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)(60∶40)；進(jìn)樣量15 μL；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；保留時(shí)間15 min.

1.5 方法設(shè)計(jì)

1.5.1 苯甲?；磻?yīng)溫度

參照劉俊等[23]對(duì)苯甲酰氯衍生化反應(yīng)時(shí)不同溫度的探索，試驗(yàn)設(shè)置30，37，40 ℃ 3個(gè)不同溫度，以探索野薔薇苯甲?；磻?yīng)的最佳溫度.

1.5.2 冰浴浸提液取用量

探索不同冰浴浸提液取用量對(duì)多胺提取的影響，比較200，300，400 μL 3個(gè)不同體積取用量，以確定最終的反應(yīng)體系.

1.6 回收率測(cè)定

試驗(yàn)采用梯度加標(biāo)回收的方法，隨機(jī)選取花苞和葉片為樣品材料進(jìn)行回收率試驗(yàn).取不同體積的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品冰浴浸提液，按照2∶1 , 1∶1 , 1∶2的配比混合，然后按照1.4.2的流程反應(yīng)、提取分離多胺并測(cè)定其含量，每個(gè)處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 多胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC測(cè)定

將3種多胺標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液按比例加入甲醇，以此推算標(biāo)準(zhǔn)品濃度.經(jīng)HPLC檢測(cè)后，對(duì)測(cè)定結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示).標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程：腐胺Puty=0.003 9x+0.001 2(R2=0.994 5)；亞精胺Spdy=0.003 9x+0.000 8(R2=0.998 2)；精胺Spmy=0.000 9x+0.002 7(R2=0.996 8).

3種多胺混合液經(jīng)HPLC測(cè)定，分離出單個(gè)多胺的色譜峰，峰型良好無(wú)重疊，可得到單個(gè)多胺標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間(保留時(shí)間)，以此確定待測(cè)樣品中的色譜峰為何種多胺.由于氨基酸數(shù)目不同，Put(二胺)、Spd(三胺)、Spm(四胺)苯甲?；磻?yīng)后3種多胺的極性差異較大，在分離過程中，3種多胺依次出峰，未出現(xiàn)峰重疊現(xiàn)象(如圖2所示).

圖1 多胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2 多胺標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定色譜圖

2.2 野薔薇內(nèi)源多胺的提取及測(cè)定

試驗(yàn)以葉片為材料，比較了苯甲?；磻?yīng)溫度(30, 37,40 ℃)、不同冰浴浸提液用量(200,300,400 μL)對(duì)野薔薇多胺提取的影響，HPLC檢測(cè)結(jié)果表明(如表1所示)：3個(gè)不同溫度對(duì)提取結(jié)果無(wú)顯著性差異；冰浴浸提液為300 μL時(shí)，精胺峰面積最大，顯著大于取400 μL浸提液的峰面積，而亞精胺峰面積無(wú)顯著差異，300 μL為冰浴浸提液最佳反應(yīng)用量.綜合3種多胺的提取效果，最終選擇37 ℃作為反應(yīng)溫度，300 μL為最佳體系.

表1 不同處理下多胺的相對(duì)含量 mg·g-1

2.3 野薔薇組織培養(yǎng)物HPLC測(cè)定

按照1.4.2方法中所列參數(shù)，對(duì)野薔薇組織做HPLC檢測(cè).樣品中3種多胺的出峰時(shí)間分別為：腐胺(Put)3.5 min，亞精胺(Spd)5.5 min，精胺(Spm)9.1 min，色譜圖如圖3所示，3種多胺依次出峰，無(wú)重疊，峰型良好，峰高、峰寬適宜，出峰時(shí)間與多胺標(biāo)準(zhǔn)品一致.

圖3 野薔薇組織多胺測(cè)定色譜圖

2.4 回收率測(cè)定

回收率是檢驗(yàn)提取方法是否可靠的依據(jù).較高的回收率說(shuō)明提取方法具有較高的準(zhǔn)確性.實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表2所示：回收率為87.17%～103.64%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.71～4.60，表明方法可靠.

表2 加標(biāo)回收率

2.5 野薔薇不同組織內(nèi)源游離多胺含量

試驗(yàn)取自然生長(zhǎng)的野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉片，培養(yǎng)3 h，3 d，5 d后的葉片，培養(yǎng)25 d的愈傷組織為材料(如圖4所示)，測(cè)定內(nèi)源多胺含量，測(cè)定結(jié)果如圖5所示.

(a)3 h 葉片;(b)3 d葉片;(c)5 d葉片;(d)25 d愈傷組織;(e)葉片;(f)花瓣和花蕊;(g)花苞;(h)莖.圖4 野薔薇組織與器官

在野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中(3 h，3 d，5 d，25 d callus)，內(nèi)源多胺總量呈現(xiàn)出先逐漸上升，再逐漸下降的變化趨勢(shì)，在培養(yǎng)3 d后達(dá)到最大值0.295 mg·g-1(FW)，培養(yǎng)25 d的愈傷組織中多胺含量顯著下降，在野薔薇器官(花瓣、花蕊、花苞、葉、莖)中，花蕊的多胺含量最高，野薔薇體胚發(fā)生過程多胺總含量是野薔薇器官的2.5倍(如圖 5(a))；體胚發(fā)生過程中Put相對(duì)含量先升高后降低，在3 d時(shí)達(dá)到最高相對(duì)含量0.259 mg·g-1(FW)，與其他時(shí)期以及其他組織相比均有極顯著差異，其他組織Put含量無(wú)顯著性差異(圖 5(b))；Spd在各組織中含量最高，其中，5 d時(shí)含量最多，達(dá)到0.265 mg·g-1(FW)，花蕊其次，含量為0.050 4 mg·g-1(FW)，體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，Spd含量變化趨勢(shì)與多胺總量變化趨勢(shì)一致，不同組織間Spd含量差異為5 d>花蕊>3 d>3 h>25 d>葉>花瓣>莖>花苞(圖5 (a),(c))；野薔薇組織中Spm含量較少，在5 d時(shí)達(dá)到最高，并且顯著高于花、莖、葉、愈傷，其相對(duì)含量為0.006 36 mg·g-1(FW)，Spm含量變化趨勢(shì)與腐胺含量變化趨勢(shì)一致(圖5(b),(d)).以上結(jié)果表明，多胺可能對(duì)野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生有調(diào)控作用.

(a)多胺總量;(b)腐胺含量;(c)亞精胺含量;(d)精胺含量.數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 3)；條形上方的不同小寫字母表示根據(jù)LSD多重比較在p< 0.05處存在顯著差異，相同小寫字母表示根據(jù)LSD多重比較在p< 0.05處無(wú)顯著差異.圖5 野薔薇不同組織多胺含量

3 討 論

多胺性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，直接測(cè)定難度較大且結(jié)果不準(zhǔn)確[24].過去檢測(cè)多胺的方法有氨基酸分析儀、紙電泳和熒光比色等, 但這些方法的樣品回收率低、靈敏度不高[25].現(xiàn)在主要采用HPLC法檢測(cè)植物內(nèi)源多胺，該方法較為成熟、靈敏、迅速[23].該試驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉，以及組織培養(yǎng)過程不同階段(3 h，3 d，5 d，25 d callus)的內(nèi)源多胺(腐胺、亞精胺、精胺)含量，15 min內(nèi)3種多胺可完全分離，通過對(duì)標(biāo)品的線性分析，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，可用得到的回歸方程計(jì)算樣品中的多胺含量.通過多次方法和技術(shù)重復(fù)試驗(yàn)，得到樣品多胺的HPLC色譜圖及數(shù)據(jù)分析柱形圖，樣品出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致，峰型適宜，該方法能很好地測(cè)定野薔薇組織內(nèi)源多胺含量.在提取樣品多胺時(shí)，取0.2 g樣品材料、300 μL冰浴浸提液、苯甲酰氯衍生化反應(yīng)37 ℃，多胺可被充分提取，經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果較好.由于苯甲酰多胺不宜長(zhǎng)期保存，在-70 ℃時(shí)避光環(huán)境下貯存1周后, 亞精胺就會(huì)開始發(fā)生變化, 高于-70 ℃則3種多胺均會(huì)發(fā)生不同程度的分解, 在24 h 內(nèi),多胺衍生物不會(huì)發(fā)生明顯分解[26]，故須在提取后盡快檢測(cè)，以免誤差太大影響測(cè)定結(jié)果.通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，苯甲酰衍生化反應(yīng)的時(shí)間不宜過短，會(huì)造成反應(yīng)不完全，苯甲酰氯殘留，影響測(cè)定結(jié)果；也不宜過長(zhǎng)，可能會(huì)使多胺分解，造成出現(xiàn)多個(gè)色譜峰的情況.提取多胺過程中，冰浴浸提和衍生化反應(yīng)的溫度、時(shí)間長(zhǎng)短，對(duì)多胺含量測(cè)定有重要影響.程文翰等[21]的研究中，冰浴浸提3 h、37 ℃衍生化反應(yīng)30 min，棉花組織多胺溶解量達(dá)到最大值；劉俊等[23]對(duì)苯甲酰衍生化反應(yīng)溫度及時(shí)間做了研究，發(fā)現(xiàn) 37 ℃反應(yīng)20～25 min，峰面積最大且副反應(yīng)少，室溫(30 ℃左右)反應(yīng) 30～40 min也可獲得十分接近的結(jié)果，隨著溫度升高(< 37 ℃)，Put的反應(yīng)更加完全,而Spd與Spm的面積變化無(wú)顯著差異.筆者所采用的方法為冰浴浸提1 h、37 ℃苯甲?；磻?yīng)25 min，峰面積較大.在12.2 min左右，檢測(cè)樣品出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，峰面積較小，推測(cè)可能是熱精胺(五胺)，需要做質(zhì)譜法進(jìn)一步檢測(cè).目前提取多胺多采用10 mL體系，如程文翰等[21]取棉花組織培養(yǎng)物0.4 g，胡文等[20]取秈稻愈傷組織1 g，蔣學(xué)美等[25]取荔枝葉片2.0 g，對(duì)樣品材料的用量較大.筆者參照程文翰等[21]的方法，并對(duì)提取體系做了優(yōu)化，用2 mL體系即可提取出野薔薇內(nèi)源多胺，可減少樣品及試劑的用量，簡(jiǎn)化操作.

在植物組織離體培養(yǎng)過程中，多胺能發(fā)揮諸多生理效應(yīng)[27]，如代謝、發(fā)育調(diào)控以及非生物脅迫反應(yīng)[28].該研究表明：在野薔薇花瓣、花蕊、花苞、莖、葉中，花蕊的多胺總含量及3種多胺含量均高于其他器官，暗示多胺可能與植物受精及性別分化有關(guān).野薔薇是雌雄同花植物，由于采集花蕊時(shí)，未將雌蕊與雄蕊分開，無(wú)法得知雌雄蕊多胺含量的規(guī)律.相較于野薔薇器官，在野薔薇的體胚發(fā)生過程中，內(nèi)源多胺含量較高，不同培養(yǎng)階段其含量變化較大，則多胺很可能參與了野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程，在不同時(shí)期對(duì)體胚發(fā)生的作用不同.腐胺向下游產(chǎn)物亞精胺和精胺轉(zhuǎn)化，使它們含量增加，說(shuō)明在體細(xì)胞胚胎發(fā)生初期腐胺可能發(fā)揮著重要作用，腐胺向亞精胺和精胺的轉(zhuǎn)化，可能有利于野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生.在野薔薇愈傷組織增殖階段，精胺作用可能不顯著，根據(jù)前人的研究結(jié)果[8-10]，精胺可能會(huì)在體細(xì)胞胚胎發(fā)生后期胚狀體及再生苗階段發(fā)揮作用.目前對(duì)多胺在野薔薇體內(nèi)的代謝通路還未見報(bào)道，闡明多胺如何影響野薔薇體細(xì)胞胚胎發(fā)生和多胺作用機(jī)制尚需探究.