春尺蠖轉(zhuǎn)錄組及嗅覺(jué)相關(guān)基因分析

陳 龍，單艷敏，廖桂堂，崔闊澍，伍亞瓊，楊淞杰

(1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原有害生物防治檢疫總站，呼和浩特 010051；3.成都信息工程大學(xué)，成都 610225；4.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，成都 610041；5.四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳植物保護(hù)站，成都 610041)

【研究意義】春尺蠖(ApocheimacinerariusErschoff)隸屬于鱗翅目，尺蛾科，屬于暴發(fā)性食葉害蟲(chóng)，在我國(guó)北方區(qū)域分布較廣，并逐步向四川、云南等南部區(qū)域遷移，其主要危害胡楊、檸條、蘋(píng)果等林木，還危害小麥、玉米等農(nóng)作物，近年該蟲(chóng)呈蔓延分布趨勢(shì)，已對(duì)發(fā)生區(qū)域造成了嚴(yán)重的損失[1-2]。嗅覺(jué)感受系統(tǒng)是昆蟲(chóng)與外界交流的重要方式，對(duì)外界環(huán)境中成千上萬(wàn)氣味分子的感知和判斷發(fā)揮了重要作用，體內(nèi)多種嗅覺(jué)蛋白參與了該識(shí)別過(guò)程，主要包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(odorant receptors,ORs)、離子型受體(ionotropic receptors,IRs)、感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPS)以及氣味降解酶(odorant degration enzymes,ODEs)等，昆蟲(chóng)遷飛、聚集、取食量等多種生理行為活動(dòng)都與其存在重要關(guān)聯(lián)[3]。【前人研究進(jìn)展】近年，對(duì)昆蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究在嗅覺(jué)感受機(jī)理的理論研究和應(yīng)用方面取得了較大突破，運(yùn)用反向化學(xué)生態(tài)學(xué)研究嗅覺(jué)相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能，可篩選出高效、無(wú)公害、綠色的防治害蟲(chóng)的防治靶標(biāo)位點(diǎn)[4-7]。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，極大促進(jìn)了昆蟲(chóng)基因組、轉(zhuǎn)錄組，特別是無(wú)參考基因組信息的昆蟲(chóng)基因組學(xué)研究。尤其是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具備在特定時(shí)間段、較全面地記錄某一物種轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，并快速獲得其全轉(zhuǎn)錄組信息的特點(diǎn)，其操作簡(jiǎn)單高效便捷，是非模式昆蟲(chóng)基因挖掘、功能鑒定以及遺傳多樣性分析的一種有效手段[8-10]。目前，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序技術(shù)，在昆蟲(chóng)化學(xué)感受系統(tǒng)、滯育、抗性等領(lǐng)域均取得快速進(jìn)展，并在昆蟲(chóng)基因差異表達(dá)、功能基因發(fā)現(xiàn)挖掘等方面均有較好應(yīng)用，特別是檢測(cè)到較多與昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)的基因[11-12]。【本研究切入點(diǎn)】基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，鑒定并篩選春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因，對(duì)其進(jìn)行基因注釋和系統(tǒng)進(jìn)化分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確參與調(diào)控春尺蠖嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)氣味化合物的識(shí)別蛋白，探明嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)理，為進(jìn)一步闡明春尺蠖有關(guān)生理行為，進(jìn)行藥劑研發(fā)和綠色防控提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

試驗(yàn)昆蟲(chóng)來(lái)源于內(nèi)蒙古烏拉特前旗人工檸條草場(chǎng)(108°45′23.63″E、40°46′4.19″N)，2019年冬季將春尺蠖越冬蛹置于恒溫[(22±1)℃]、光周期L：D=18 h：6 h、相對(duì)濕度55%～59% 條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)，待春尺蠖羽化后，分別選取羽化第3天大小相同、活力充沛的雌、雄蛾成蟲(chóng)各5頭，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 RNA提取與質(zhì)檢

采用Trizol Reagent(Invitrogen,Carlsbad，CA，USA)方法分別提取上述春尺蠖雌、雄成蟲(chóng)樣品的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。RNA檢測(cè)分別采用NanoPhotometer spectrophotometer(IMPLEN，CA，USA)和Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies，CA，USA)精確檢測(cè)RNA樣品的純度和完整性，來(lái)保證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)悠返囊蟆?/p>

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

利用真核生物mRNA中多含有polyA尾的特征，取檢測(cè)合格的RNA樣品1.5 μg，加入Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，而后加入試劑破碎緩沖劑(fragmentation buffer)，已富集的mRNA被打斷成多個(gè)短小的片段，隨后以其為模板，加入六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)和緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I等原料先后合成cDNA第1和2鏈；合成的cDNA雙鏈經(jīng)AMPure XP 磁珠純化，而后修復(fù)其末端并加A尾及測(cè)序接頭，再次利用AMPure XP 磁珠選擇cDNA片段。經(jīng)PCR富集構(gòu)建的cDNA文庫(kù)合格后，采用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列組裝和基因注釋

高通量測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)中包含少量帶有測(cè)序接頭或測(cè)序質(zhì)量較低的讀數(shù)(reads)，為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)中帶接頭(adapter)、含N(N表示無(wú)法確定堿基信息)和低質(zhì)量reads(Qphred≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度的50%以上的reads)經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的高質(zhì)量讀數(shù)(clean reads)。利用轉(zhuǎn)錄組de novo組裝軟件Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行組裝，clean reads被組裝得到的集合為該物種的Unigenes，為了獲取全面的基因功能信息，使用BLAST軟件將序列信息與Nr，Nt，Pfam，KOG，Swiss-prot，KEGG和GO七大公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(設(shè)定e值<10-5)從而獲取該Unigenes序列的蛋白功能注釋信息。

1.5 春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定與序列比對(duì)

結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因功能注釋和blastp結(jié)果，鑒定出嗅覺(jué)相關(guān)蛋白基因，同時(shí)利用DNAMAN 6.0 軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.6 春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，p距離，重復(fù)運(yùn)行1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖Illumina測(cè)序與組裝

經(jīng)Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)上機(jī)測(cè)序后，共產(chǎn)生48 893 742 條原始讀數(shù)(raw reads)(雌蟲(chóng)23 367 873條，雄蟲(chóng)25 525 869條，表1)，經(jīng)處理后，共獲得46 510 487條chean reads，數(shù)據(jù)共計(jì)13.95 GB(GenBank登錄號(hào)：PRJN648143)，春尺蠖雌、雄成蟲(chóng)兩樣品的Q30(堿基正確識(shí)別率為99.9%)百分比均≥ 93.68%，GC含量均≥43.51%。

為了使轉(zhuǎn)錄本更加準(zhǔn)確、可靠，將測(cè)序所得序列經(jīng)Trinity軟件對(duì)其拼接、組裝，共得到Unigenes 37 542 條，平均長(zhǎng)度為1328 bp，N50長(zhǎng)度為2241 bp；拼接出的Unigenes大多數(shù)長(zhǎng)度分布在300～1000 bp，其中，長(zhǎng)度在 301～1000 bp的Unigenes為22 980條，占比61.21%，長(zhǎng)度大于1000 bp的 Unigenes為14 562 條，占比 38.79%(表2)。從上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝結(jié)果來(lái)看，測(cè)序質(zhì)量較高、序列組裝的完整性較好。

2.2 轉(zhuǎn)錄組基因注釋及功能分類

將組裝好的Unigenes 分別與Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-prot、KEGG和GO七大據(jù)庫(kù)比對(duì)分析(表3)，注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)13 757條，占比36.64%，數(shù)量最多；注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)5444條，占比14.5%，數(shù)量最少；至少成功注釋到一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigenes數(shù)量為17 296條。

表1 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

表3 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組基因注釋統(tǒng)計(jì)

在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果中對(duì)Unigenes的物種分布統(tǒng)計(jì)(圖1)顯示，春尺蠖轉(zhuǎn)錄組Unigenes注釋到的物種涉及233種，其中與斜紋夜蛾Spodopteralitura(2237個(gè)，占16.3%)，棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(2107個(gè)，占15.3%)注釋到的基因信息較多，均在2000個(gè)以上。在34個(gè)物種中注釋到的基因信息均在10個(gè)以上，其余物種注釋到的信息均在個(gè)位數(shù)。

圖1 Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的春尺蠖Unigenes的物種分布Fig.1 Species distribution of Apocheima cinerariusunigenes in the Nr database

2.3 Unigenes功能分類

春尺蠖轉(zhuǎn)錄組中共有11 174個(gè)Unigenes 分別被注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)胞組分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物過(guò)程(Biological process)3大類的55個(gè)功能組(圖2)。在細(xì)胞組分中，細(xì)胞部分(Cell part)和細(xì)胞(Cell)所注釋到的Unigenes數(shù)量最多，均為3557個(gè)；在分子功能中，在結(jié)合(Binding)組中注釋到的Unigenes數(shù)量最多，為6199個(gè)，其次為催化活性(Calytic activities)，為4483個(gè)；在生物過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)組中注釋到的Unigenes數(shù)量最多，共有6418個(gè)，其次為代謝過(guò)程(Metabolic processes)，為5569個(gè)。

圖2 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組Unigenes GO功能注釋Fig.2 Annotated Unigenes in the transcriptome of Apocheima cinerarius in GO database

根據(jù)基因參與的KEGG代謝通路分為5個(gè)分支：A.細(xì)胞過(guò)程(運(yùn)輸和分解代謝,細(xì)胞群,細(xì)胞運(yùn)動(dòng),細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡); B.環(huán)境信息處理(膜運(yùn)輸,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),信號(hào)分子和相互作用); C.遺傳信息處理(折疊、分類和降解,復(fù)制和修復(fù),轉(zhuǎn)錄,翻譯); D.代謝(氨基酸代謝,其它次生代謝產(chǎn)物的生物合成,碳水化合物代謝,能量代謝,糖生物合成與代謝,脂肪代謝,輔助因子和維生素的代謝,其它氨基酸的代謝,萜類和多酮的代謝,核苷酸代謝,槪貌,生物降解和代謝); E.有機(jī)系統(tǒng)(循環(huán)系統(tǒng);發(fā)育,消化系統(tǒng),內(nèi)分泌系統(tǒng),環(huán)境適應(yīng),排泄系統(tǒng),免疫系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng),細(xì)分為感官系統(tǒng)) According to the KEGG metabolic pathway involved by genes,it can be divided into five branches: A.Cellular Processes(Transport and catabolism; Cellular commiunity; Cell motility; Cell growth and death)；B.Environmental Information Processing(Membrane transport; Signal transduction;Signaling molecules and interaction)；C.Genetic Information Processing(Folding,sorting and degradation;Replication and repair;Transcription;Translation); D.Metabolism(Amino acid metabolism; Biosynthesis of other secondary metabolites; Carbohydrate metabolism; Energy metabolism;Glycan biosynthesis and metabolism; Lipid metabolism;Metabolism of cofactors and vitamins;Metabolism of other amino acids; Metabolism of terpenoids and polyketides; Nucleotide metabolism; Overvivew;Xenobiotics biodegradation and metabolism)；E.Organismal Systems(Circulatory system; Development;Digestive system; Endocrine system;Environmental adaptation;Excretory system; Immune system; Nervous system; Sensory system)圖3 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組KEGG 代謝通路Fig.3 KEGG pathways in the transcriptome of Apocheima cinerarius

為了與生物學(xué)現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)，對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的解釋，將Unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，共發(fā)現(xiàn)有5444個(gè)基因注釋到230個(gè)代謝通路，其歸屬于細(xì)胞過(guò)程(A，Cellular Processes)，環(huán)境信息處理(B，Environmental Information Processing)，遺傳信息處理(C，Genetic Information Processing)，代謝(D，Metabolism)，有機(jī)系統(tǒng)(E，Organismal Systems) 5個(gè)分支(圖3)，其中，注釋到代謝分支上的基因數(shù)最多，為1674個(gè)，其次為有機(jī)系統(tǒng)，為1494個(gè)，其余分支注釋上的基因均小于1000個(gè)，而細(xì)胞過(guò)程分支上注釋到的基因數(shù)最少，只有780個(gè)。

2.4 春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因的鑒定與序列分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)注釋信息為嗅覺(jué)相關(guān)基因70個(gè)，包括22個(gè)OBPs、23個(gè)CSPs、14個(gè)ORs(包括13個(gè)普通受體和1個(gè)共受體ORco)，8個(gè)IRs和3個(gè)SNMPs(表4)。

對(duì)鑒定得到22個(gè)氣味結(jié)合蛋白(OBPs)基因，命名為AcinOBP1～AcinOBP22。從序列比對(duì)分析(圖4)得知，除AcinOBP3、AcinOBP7、AcinOBP19和AcinOBP21～AcinOBP22外，其余17個(gè)OBP均具有完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，其中AcinOBP1、AcinOBP2、AcinOBP4～AcinOBP6、AcinOBP9～AcinOBP11、AcinOBP12～AcinOBP13、AcinOBP16～AcinOBP17、AcinOBP20具有6個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Classic OBP；AcinOBP8、AcinOBP14和AcinOBP18均缺少第2和第5個(gè)半胱氨酸，具有4個(gè)保守的半胱氨酸，屬于Minus-C。鑒定得到的22個(gè)OBPs氨基酸一致性為18.35%。鑒定得到23個(gè)化學(xué)感受蛋白基因(CSPs)基因(圖5)，命名為AcinCSP1～AcinOBP23，所有的CSPs均具完整的ORF，同時(shí)包含4個(gè)保守的半胱氨酸，序列一致性為18.15%。

表4 春尺蠖轉(zhuǎn)錄組中與嗅覺(jué)相關(guān)基因統(tǒng)計(jì)

陰影部分C表示保守的半胱氨酸殘基Shaded part C indicates cysteine residues圖4 春尺蠖OBPs基因氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of amino acid sequences of OBPs of Apocheima cinerarius

陰影部分 C 表示半胱氨酸殘基Shaded part C indicates cysteine residues圖5 春尺蠖CSPs基因氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of amino acid sequences of CSPs of Apocheima cinerarius

2.5 春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究將春尺蠖與茶尺蠖Ectropisoblique、國(guó)槐尺蠖Semiothisacinerearia、家蠶Bombyxmori、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis4種同鱗翅目昆蟲(chóng)共計(jì)139個(gè)OBPs構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)。春尺蠖全部22個(gè)OBPs集中聚在同一分支上，卻沒(méi)有與同為尺蛾科的茶尺蠖和國(guó)槐尺蠖聚為一類。相反，茶尺蠖和國(guó)槐尺蠖各個(gè)OBPs卻分別聚在一支上。

從春尺蠖CSPs基因與茶尺蠖、國(guó)槐尺蠖、家蠶、亞洲玉米螟 4種同鱗翅目昆蟲(chóng)的96個(gè)CSPs構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果中可以看出，春尺蠖與茶尺蠖形成了清晰的直系同源譜系，共有9對(duì)CSPs聚到同一分支上，包括AcinCSP2/EoblCSP15、AcinCSP3/EoblCSP6、AcinCSP8/EoblCSP10、AcinCSP10/EoblCSP7、AcinCSP12/EoblCSP8、AcinCSP14/EoblCSP21、AcinCSP15/EoblCSP9、AcinCSP18/EoblCSP1、AcinCSP23/EoblCSP11。

OBP蛋白來(lái)源物種:茶尺蠖(EoblOBP)， 國(guó)槐尺蠖(ScinOBP),家蠶(BmorOBP),亞洲玉米螟(OfurOBP)Sources species of OBP proteins:Ectropis oblique(EoblOBP),Semiothisa cinerearia(ScinOBP),Bombyx mori(BmorOBP),Ostrinia furnacalis(OfurOBP)圖6 春尺蠖OBPs 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of OBPs in Apocheima cinerarius

CSP蛋白來(lái)源物種: 茶尺蠖(EoblCSP)，國(guó)槐尺蠖(ScinCSP)，家蠶(BmorCSP)，亞洲玉米螟(OfurCSP)Source species of CSP proteins: Ectropis oblique(EoblCSP),Semiothisa cinerearia(ScinCSBP),Bombyx mori(BmorCSP),Ostrinia furnacalis(OfurCSP)圖7 春尺蠖CSPs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of CSPs in Apocheima cinerarius

3 討 論

目前，模式生物基因組測(cè)序技術(shù)日趨完善，其參考序列已被更好的應(yīng)用于個(gè)體研究中，但非模式生物由于缺乏基因組信息參考，傳統(tǒng)的克隆研究方法限制了其在分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展速度。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，測(cè)序成本逐漸降低，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)成為非模式生物挖掘功能基因的最有效途徑[8]。與傳統(tǒng)的克隆方法相比，這些新技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、省時(shí)[13-15]。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序效果分析中，一般認(rèn)為，N50長(zhǎng)度越長(zhǎng)，數(shù)據(jù)組裝的完整性越好；Q30大于80%，測(cè)序質(zhì)量可靠[16]。本研究對(duì)春尺蠖雌雄成蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)組裝，共獲取37 542條Unigenes，測(cè)序樣本的Q30均≥93.68%，N50長(zhǎng)度為2241 bp，較好滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析要求，可為后續(xù)基因注釋及生物信息學(xué)分析提供可靠保證，同時(shí)為獲取更多的新基因提供了可能。

通常認(rèn)為，非模式生物的基因注釋方法一般包括：Nt數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋唯一基因、進(jìn)行Nr、Swiss-prot等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋GO基因、進(jìn)行KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)等比對(duì)注釋KEGG代謝途徑等[17]。本研究對(duì)春尺蠖轉(zhuǎn)錄組所有組裝獲得的Unigenes進(jìn)行功能注釋，共有17 296(46.07%)條被成功注釋到Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-prot、KEGG和GO等7大公共據(jù)庫(kù)，其中注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)13 757條，數(shù)量最多，占比36.64%，這與大多數(shù)昆蟲(chóng)在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的Unigenes注釋結(jié)果類似，如楊爽等[18]在鱗翅目螟蛾科大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組的研究中Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到Unigenes的比例最高，為41.82%。

一般情況，大量基因序列沒(méi)有獲得注釋，可能是由于序列片段長(zhǎng)度過(guò)短而無(wú)法獲取同源比對(duì)結(jié)果，屬于非編碼序列或新基因以及比對(duì)的參考基因組不夠豐富[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)春尺蠖轉(zhuǎn)錄組注釋中發(fā)現(xiàn)，還有20 246條(53.93%)未獲得注釋，這與宋月芹等[22]在錘脅蹺蝽Yemmasignatus觸角轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)相似，即錘脅蹺蝽觸角轉(zhuǎn)錄組在至少在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)里注釋成功的46 224條(40.02%)，還有69 267條(59.98%)基因未注釋。孟翔等[23]在鱗翅目細(xì)蛾科荔枝蒂蛀蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組的研究中發(fā)現(xiàn)在7大數(shù)據(jù)庫(kù)中至少 1 條數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的Unigenes 有 22 348條,占總Unigenes 數(shù)的32.39%。原因之一可能是上述研究中獲取的Unigenes片段較短，有相當(dāng)大的比例在300 bp以下，但本研究獲得的Unigenes片段均在300 bp以上，同時(shí)鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶、棉鈴蟲(chóng)、斜紋夜蛾和煙芽夜蛾等均為已知基因組物種，同源序列比對(duì)的參考基因組信息較為豐富，因此，推測(cè)測(cè)序未獲注釋的主要原因?yàn)樾蛄袑儆诜蔷幋a序列或新基因。

多數(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，注釋到Unigenes數(shù)最多的往往是已知基因組親緣關(guān)系最近的物種[24]，如扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis、黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor及梨小食心蟲(chóng)Grapholithamolesta[25-28]。但本研究中得出的結(jié)果卻不同，同源比對(duì)上基因數(shù)最多的是同為鱗翅目已知基因組的斜紋夜蛾Spodopteralitura(2237個(gè)，16.3%)，而非同為尺蠖蛾科未知基因組的茶尺蠖Ectropisoblique(比對(duì)數(shù)僅有38條)，可能是因?yàn)橛H緣關(guān)系更近的茶尺蠖還未獲得基因組序列，與已知基因組序列的鱗翅目昆蟲(chóng)相比已知的基因序列信息過(guò)少導(dǎo)致，且已有茶尺蠖基因序列大多為單個(gè)組織測(cè)序所得，而本研究的基因則是以成蟲(chóng)測(cè)序獲得，所以比對(duì)基因的數(shù)目較少。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定得到大量嗅覺(jué)相關(guān)基因[11,18,22,29-32]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)春尺蠖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合基因功能注釋，春尺蠖Unigenes分別被注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程3大類的55個(gè)功能組，其中注釋生物過(guò)程和分子功能的Unigenes較多，在細(xì)胞過(guò)程組中注釋到的Unigenes數(shù)量最多，共有6418個(gè)，其次為結(jié)合組中注釋到的Unigenes數(shù)量最多，為6199個(gè)，與大多數(shù)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)基因轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果一致，但不同來(lái)源的測(cè)序材料在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到的Unigenes歸類有所不同，這與器官之間的功能差異相關(guān)[33]。blastp驗(yàn)證結(jié)果，深度挖掘共獲取70個(gè)與春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)的靶標(biāo)基因，包括22個(gè)OBPs，23個(gè)CSP，14個(gè)ORs(包括13個(gè)普通受體，和1個(gè)共受體ORco)，8個(gè)IRs和3個(gè)SNMPs。本研究獲得的70個(gè)靶標(biāo)基因中CSP的占比較高(32.85%)，這比其他觸角中研究得出的CPS基因占比偏高[34]，這可能由于化學(xué)感受蛋白在觸角等化學(xué)感受器官中廣泛表達(dá)，還在非化學(xué)感受器官中也有表達(dá)。在已獲取的鱗翅目昆蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組信息中也發(fā)現(xiàn)各種類型的嗅覺(jué)相關(guān)基因。如小菜蛾P(guān)lutellaxylostella成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)25個(gè)OBPs、15個(gè)CSPs、54個(gè)ORs和16個(gè)IRs；二化螟Chilosuppressalis成蟲(chóng)觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出26個(gè)OBPs、21個(gè)CSPs、47個(gè)ORs和20個(gè)IRs[35]。相比上述鱗翅目昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果，本研究中鑒定到的春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因大部分均在合理范圍之內(nèi)，而OR和IR數(shù)量偏少。這可能是因?yàn)槠渌ハx(chóng)的嗅覺(jué)相關(guān)基因是從觸角中轉(zhuǎn)錄組中鑒定出來(lái)的，而春尺蠖嗅覺(jué)相關(guān)基因是從成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中得到的，很多在觸角中低表達(dá)水平的受體基因無(wú)法被檢測(cè)到。

在本研究中構(gòu)建的春尺蠖與國(guó)槐尺蠖、家蠶、茶尺蠖、亞洲玉米螟的OBPs和CSPs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果中，22個(gè)AcinOBP全部聚在一個(gè)分支上，說(shuō)明春尺蠖AcinOBP屬于直系同源基因，在嗅覺(jué)識(shí)別中發(fā)揮類似的功能[36]。從CSPs進(jìn)化分析結(jié)果可以看出，春尺蠖與茶尺蠖親緣關(guān)系最近，其9個(gè)CSPs與茶尺蠖成對(duì)聚在同一分支，表明二者在感受外界環(huán)境中具有類似的感受系統(tǒng)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)春尺蠖雌雄成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行Unigenes注釋及蛋白功能分析，將其Unigenes注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的3大類的55個(gè)功能組、經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析后形成了230個(gè)代謝通路，共獲取嗅覺(jué)相關(guān)基因70個(gè)，并將注釋的相關(guān)基因與4種春尺蠖的代表性近緣昆蟲(chóng)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，基于轉(zhuǎn)錄組信息驗(yàn)證了與茶尺蠖清晰的直系同源譜系關(guān)系，為今后深入研究其嗅覺(jué)識(shí)別作用機(jī)理奠定了基因信息基礎(chǔ)，為運(yùn)用嗅覺(jué)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果，應(yīng)用于春尺蠖預(yù)期防治提供了理論依據(jù)。