生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式對(duì)柴胡根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

劉 麗,范 婭,馮海洋,杜 衎,高德民

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355)

【研究意義】柴胡(BupleurumchinenseDC.)是傘形科柴胡屬多年生藥用植物，以干燥根入藥。柴胡是我國(guó)常用的傳統(tǒng)藥材，已有數(shù)千年的用藥歷史，具有疏風(fēng)解表、疏肝解郁、升舉陽氣等功效[1]。柴胡屬大宗藥材，市場(chǎng)需求量很大，但野生柴胡資源有限，因此栽培柴胡是市場(chǎng)的主要來源[2]。柴胡對(duì)環(huán)境因子，尤其是土壤溫度、濕度、海拔等非常敏感，因此適宜的產(chǎn)地有限，導(dǎo)致其栽培地柴胡重茬連作現(xiàn)象十分普遍。柴胡種植二年后即可采收，而長(zhǎng)期連作造成柴胡根腐病加劇，生長(zhǎng)勢(shì)減弱，死苗、爛根現(xiàn)象突出，種質(zhì)退化嚴(yán)重，藥材質(zhì)量和產(chǎn)量下降，產(chǎn)生連作障礙。因此，研究藥材連作障礙的發(fā)生機(jī)理機(jī)制對(duì)于提出合理有效的消減措施，保障中藥材生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和藥材質(zhì)量的安全性具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】連作障礙發(fā)生的機(jī)理非常復(fù)雜，既包括根際土壤理化環(huán)境失衡、土壤微生物區(qū)系改變等土壤因素，也包括植物本身的化感自毒作用、蟲害疊加累積效應(yīng)等[3-4]。近年來，從植物-土壤-微生物組成的根際微生態(tài)系統(tǒng)探討連作障礙的成因和消減措施已成為一個(gè)重要的研究方向，并在西洋參、黃芪[5-6]等藥材生長(zhǎng)中取得了重要進(jìn)展，其連作障礙的根際微生物機(jī)制也得到了初步的闡明，并且通過輪作、間作等栽培模式來效緩解連作障礙造成的影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以柴胡不同生長(zhǎng)時(shí)間和不同栽培模式的根際微生物為切入點(diǎn)，探討其變化機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高通量測(cè)序技術(shù)，比較柴胡不同生長(zhǎng)時(shí)間、不同栽培方式根際微生物的區(qū)系變化，從根際微生物角度探討柴胡連作障礙的發(fā)生機(jī)制，為緩解生產(chǎn)難題，加快柴胡優(yōu)質(zhì)道地藥材基地建設(shè)，促進(jìn)柴胡種植業(yè)健康發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

山東省章丘區(qū)年平均日照2647.6 h，日照率60%。年平均氣溫12.8 ℃，年平均降水量600.8 mm，土壤類型為棕壤。山東省長(zhǎng)清區(qū)年平均日照時(shí)數(shù)為2447.6 h,平均氣溫14.4 ℃,平均降水量661.7 mm，土壤類型為棕壤。甘肅省宕昌縣年平均日照2100 h,年均氣溫9.3 ℃,平均降水量584 mm，土壤類型為黃棕壤。

本研究采集的柴胡包括：柴胡不同生長(zhǎng)期(一年生(B_1)，二年生(B_2)和三年生(B_3))、不同栽培模式(二年生柴胡與玉米間作(B_4)和三年生柴胡與玉米輪作(B_5))、不同產(chǎn)地兩年生柴胡(B_6和B_7)。間作柴胡的密度為80 000 株/667 m2，玉米的密度為4000 株/667 m2。玉米的種植時(shí)間為5月，柴胡的種植時(shí)間為7月。采樣時(shí)間為2020年8月。采集樣品的詳細(xì)信息見表1。

1.2 根際土壤采集

采用五點(diǎn)采樣法采集根際土壤樣品。每個(gè)樣品隨機(jī)選擇3個(gè)面積為2 m×2 m的樣方，將樣方中柴胡整株取出，采用抖根法收集根際土壤，同一樣方內(nèi)的土壤作為一個(gè)混合樣[7]。所有土壤樣品入無菌袋中密封，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm篩，于-20 ℃保存?zhèn)溆?用于微生物分析。

1.3 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增

用土壤DNA 試劑盒(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)提取樣品DNA。 PCR擴(kuò)增土壤細(xì)菌16S rDNA V4～V5區(qū)和土壤真菌ITS1(94 ℃預(yù)變性2 min，接著30個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；72 ℃延伸10 min，最后保溫10 min)。引物為515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTA A-3′,926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′,ITS 1F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和 ITS1R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)并回收。

1.4 建庫和測(cè)序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit建庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測(cè)合格后，在上海微基生物科技有限公司通過 Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行模式測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Mothur(version 1.33.3)軟件對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，將模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)、過長(zhǎng)和過短的序列以及PCR過程中產(chǎn)生的一些嵌合體去除，得到優(yōu)化序列。采用UPARSE 軟件(Usearch Version V8.1.1756,http://drive5.com/uparse/)進(jìn)行OTU (Operational taxonomic unit) 聚類。基于分類學(xué)信息，在門和屬水平上對(duì)柴胡根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Mothur(version 1.33.3)軟件進(jìn)行微生物群落多樣性分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，通過R軟件(version 3.6.0)計(jì)算并可視化稀釋曲線、Venn圖、Heatmap、PCoA和群落結(jié)構(gòu)直方圖。

表1 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下柴胡的根際土壤信息

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果

7個(gè)根際土壤樣品的稀釋曲線(圖1)顯示，初始階段OTU呈現(xiàn)急劇上升，但隨著樣本測(cè)序序列數(shù)目不斷增加，OTU總數(shù)將不再隨著序列數(shù)目的加入而顯著增加，說明測(cè)序文庫已經(jīng)達(dá)到飽和，測(cè)序結(jié)果可用來后續(xù)分析。高通量結(jié)果見表2。

對(duì)于每個(gè)樣品OTU，分別以97%的序列一致性進(jìn)行分類分析。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上確定每個(gè)樣本常見或特有的OTUs(圖2)。柴胡連續(xù)種植后土壤細(xì)菌的特有OTUs數(shù)目呈下降趨勢(shì)，而與玉米間作和輪作后特有OTUs數(shù)目升高。土壤真菌在連續(xù)種植過程中特有OTUs數(shù)量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)。與玉米間作后土壤真菌的特有OTUs數(shù)量增加，而輪作后減少。宕昌市和長(zhǎng)清區(qū)兩年生柴胡土壤中特有OTUs數(shù)量顯著高于章丘區(qū)。

2.2 α-多樣性分析

根際微生物的豐富度(ACE指數(shù)和 Chao指數(shù))和群落多樣性(Simpson指數(shù),表 3)顯示，柴胡連續(xù)種植后根際土壤細(xì)菌豐富度和多樣性下降，尤其是生長(zhǎng)二年的柴胡。而連續(xù)種植后柴胡的真菌豐富度和多樣性呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。但柴胡與玉米間作或輪作后細(xì)菌的豐富度和多樣性明顯提高，并且真菌的多樣性也增加。區(qū)域位置對(duì)柴胡根際土壤微生物豐富度和多樣性影響較大，其中山東長(zhǎng)清地區(qū)真菌豐富度和多樣性為兩年生中最高。

B_1、B_2和B_3分別代表中國(guó)山東章丘區(qū)一年生、兩年生、三年生柴胡。B_4和B_5分別代表二年生柴胡與玉米間作和三年生柴胡與玉米輪作。B_6和B_7分別代表甘肅省宕昌市和山東省長(zhǎng)清區(qū)的兩年生柴胡。以下圖中樣品均相同。A.細(xì)菌，B.真菌B_1,B_2 and B_3 represent 1-year-old Bupleurum chinense DC.,2-year-old Bupleurum chinense DC.and 3-year-old Bupleurum chinense DC.in Zhangqiu areas,Shandong province,China,respectively.B_4 and B_5 represent 2-year-old intercropped Bupleurum chinense DC.,3-year-old rorated Bupleurum chinense DC.,respectively.B_6 and B_7 represent 2-year-old Bupleurum chinense DC.from Dangchang areas,Gansu province and Changqing Shandong province,respectively.The following soil samples in the figures are all the same.A.Bacteria,B.Fungi圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下柴胡根際微生物稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of microbiome for rhizosphere soil samples from different growth time and cultivation pattern of Bupleurum chinense DC.

表2 柴胡根際土壤中細(xì)菌和真菌的高通量結(jié)果

A.細(xì)菌，B.真菌A.Bacteria,B.Fungi圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下柴胡根際微生物的操作分類單元(OTU)相似度和重疊度的Venn分析Fig.2 Venn analysis of similarity and overlap of operational taxa (OTU) of rhizosphere microorganisms of Bupleurum Chinese DC.under different growth times and cultivation patterns

表3 根際微生物的 ACE、Chao和 Shannon 指數(shù)

2.3 β-多樣性分析

柴胡根際細(xì)菌的PCoA圖(圖3)可以較好的反映出細(xì)菌多樣性的差異，因?yàn)閮蓚€(gè)主坐標(biāo)軸的總解釋度達(dá)到75.98%。同樣，真菌變化趨勢(shì)與細(xì)菌基本一致。柴胡經(jīng)過間作和輪作后，樣品間的距離增大，表明土壤根際微生物多樣性差異增大。不同產(chǎn)地生長(zhǎng)兩年的柴胡樣本分布相對(duì)離散的，說明樣品間細(xì)菌和真菌多樣性有顯著差異。

基于樣品間的聚類分析，7個(gè)柴胡樣品的根際土壤細(xì)菌樣品分為4組(圖4-A)。B_2、B_5為第一組，B_1、B_3、B_4為第二組，B_6、B_7各單獨(dú)成組。組內(nèi)細(xì)菌相似性較高，但組間細(xì)菌群落差異較大，而不同生長(zhǎng)時(shí)間柴胡根際細(xì)菌群落的差異最為明顯。同樣，7個(gè)柴胡根際土壤真菌樣品被分六組，其中B_5和B_4聚為一類，說明這兩個(gè)樣品中的真菌群落組成具有較高的相似性，B_1、B_3、B_2、B_6和B_7分別單獨(dú)成組，這說明柴胡樣品根際真菌群落明顯不同。

2.4 根際微生物組成

為了闡明柴胡根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，在兩個(gè)分類水平(門和屬)進(jìn)行了分析。7個(gè)土壤樣品中共檢測(cè)到 14 個(gè)細(xì)菌門和 8 個(gè)真菌門。由圖5-A可知，柴胡根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門(Proteobacteria,34%)，其次是酸桿菌門(Acidobacteria,21%)、放線菌門(Actinobacteria,14%)和擬桿菌門(Bacteroidetes,7%)。變形菌門的相對(duì)豐度在柴胡連續(xù)種植后增加，但與玉米間作和輪作后相對(duì)豐度較低。兩年生柴胡的變形菌門相對(duì)豐度普遍高于其它生長(zhǎng)時(shí)間。山東長(zhǎng)清區(qū)變形菌門相對(duì)豐度在所有地區(qū)中最高。酸桿菌門隨柴胡生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)豐度逐年下降，但與玉米間作或輪作后相對(duì)豐度明顯升高。值得注意的是，甘肅宕昌市柴胡根際土壤中酸桿菌

A.細(xì)菌，B.真菌A.Bacteria,B.Fungi圖3 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析(PCoA)Fig.3 The principal coordinate analysis (PCoA) of rhizosphere soil microbiome community structure under different growth times and cultivation patterns

A.細(xì)菌，B.真菌A.Bacteria,B.Fungi圖4 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下微生物群落操作分類群的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of microbiome operating taxa under different growth times and cultivation patterns

門相對(duì)豐度在所有地區(qū)中最低。

由圖5-B可知，柴胡根際真菌的優(yōu)勢(shì)門依次是子囊菌門(Ascomycota,78%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota,9%)和接合菌門(Zygomycota,4%)。子囊菌門相對(duì)豐度隨柴胡生長(zhǎng)時(shí)間的增加有所下降，二年生柴胡尤為明顯。但與玉米間作和輪作后相對(duì)豐度增加。不同產(chǎn)地種植的兩年生柴胡中山東章丘區(qū)與長(zhǎng)清區(qū)的子囊菌門相對(duì)豐度偏低，而甘肅宕昌縣的子囊菌門相對(duì)豐度高于其他組。擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度隨著柴胡生長(zhǎng)時(shí)間顯著增加，但與玉米間作或輪作后相對(duì)豐度較低。山東章丘區(qū)柴胡根際土壤擔(dān)子菌相對(duì)豐度普遍高于其它地區(qū)。

在屬水平(圖6)上，7個(gè)根際土壤中檢測(cè)到57個(gè)細(xì)菌屬和50個(gè)真菌屬。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為假桿菌屬(Pseudarthrobacter,2%)、布氏桿菌屬 (Bryobacter,1%)、 類固醇桿菌屬(Steroidobacter,1%)、硝化螺菌屬 (Nitrospira,1%)。Pseudoarthrobacter的相對(duì)豐度隨柴胡生長(zhǎng)時(shí)間逐年增加，但與玉米間作和輪作后減少。布氏桿菌屬、 類固醇桿菌屬和硝化螺菌屬的相對(duì)豐度在連續(xù)種植3年后下降，但在間作和輪作后相對(duì)豐度發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

根際土壤真菌的優(yōu)勢(shì)屬為光黑殼屬(Preussia,7%)、毛殼屬(Chaetomium,7%)、赤霉菌屬(Gibberella,7%)、鐮刀菌屬(Fusarium,6%)、被孢霉屬(Mortierella,4%)、尾柄孢殼屬(Cercophora,3%)、隱球菌屬(Cryptococcus,2%)。光黑殼屬、毛殼屬和被孢霉屬的相對(duì)豐度隨柴胡生長(zhǎng)時(shí)間下降，而與玉米在間作和輪作后相對(duì)豐度增加。

A.細(xì)菌，B.真菌A.Bacteria,B.Fungi圖5 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下微生物水平的物種相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of species at the microbial level under different growth times and cultivation modes

A.細(xì)菌，B.真菌A.Bacteria,B.Fungi圖6 不同生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式下微生物屬水平的物種相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of species at the level of microbial genus under different growth times and cultivation modes

柴胡根際微生物群落的組成受樣品生長(zhǎng)時(shí)間、地點(diǎn)以及栽培模式的影響很大。例如，Lactococcus是山東省長(zhǎng)清區(qū)的特有屬，而Salinimicrobium、Gillisia、Cesiribacter、Marinobacter和Alcanivorax則是甘肅省宕昌市的特有屬。Rickettsia、Dactylella、Subulicystidium和Savoryella僅存在于兩年生柴胡中。Allomyces是柴胡輪作的特有屬。

3 討 論

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物多樣性對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用。土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)[8]。本研究采用Illumina高通量技術(shù)對(duì)柴胡不同生長(zhǎng)時(shí)間、不同栽培模式下的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了分析。表明生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式對(duì)柴胡根際微生物的多樣性和豐富度有顯著影響。柴胡連續(xù)生長(zhǎng)3年以及連坐后根際土壤中細(xì)菌和真菌的多樣性和豐富度明顯降低，但與玉米輪作或間作后則逆轉(zhuǎn)了這一變化趨勢(shì)。這與許多藥材根際微生物的變化規(guī)律是基本一致的[9-11]。本研究進(jìn)一步豐富了栽培模式對(duì)柴胡根際微生物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，這對(duì)于調(diào)節(jié)柴胡種植結(jié)構(gòu)、優(yōu)選柴胡種植模式、加強(qiáng)種植管理具有重要的理論和實(shí)踐意義[12]。

根際微生物受環(huán)境影響很大，如土壤類型、溫度、含水量、生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式等，都會(huì)影響微生物群落的類型和結(jié)構(gòu)[13]。與其他產(chǎn)地的微生物群落相比，山東長(zhǎng)清區(qū)柴胡根際真菌豐富度最高，但山東章丘區(qū)真菌多樣性最高。這與二者環(huán)境因子明顯不同有關(guān)[14]。盡管柴胡根際微生物在物種多樣性、相對(duì)豐度、結(jié)構(gòu)和分類組成等方面存在一定差異，但同一生境下微生物群落結(jié)構(gòu)是相似的。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),藥用植物根際土壤細(xì)菌主要來源于變形菌門和酸桿菌門，真菌主要來源于子囊菌門和擔(dān)子菌門，且物種豐度也較高，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬[15-17]。與柴胡根際土壤微生物群落比較后發(fā)現(xiàn)，不同藥用植物根際土壤微生物在物種組成上具有較高的相似性，其主要的差別在于物種的豐度差異，這可能也與土壤本身的微生物種群有關(guān)系[18]。

微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的變化通常會(huì)導(dǎo)致代謝能力、生物降解、疾病抑制和其他功能的變化[19]。柴胡連續(xù)種植大大減少了有益微生物的豐度，例如，布氏桿菌屬(Bryobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、光黑殼屬(Preussia) 、毛殼屬(Chaetomium)和被孢霉屬(Mortierella)，這些根際微生物在氮循環(huán)、微生物代謝和生物防治方面起著重要作用[20-21]。Bryobacter是柴胡根際微生物中的高豐度菌屬，具有促進(jìn)土壤碳循環(huán)作用[22]。此外，豐度較高的光黑殼屬和毛殼屬對(duì)植物病原物的生物防治具有重要意義[23-24]。相反，一些植物病原體，例如鏈格孢屬和炭疽菌屬在連續(xù)種植后大量增加[25-26]。鏈格孢屬和炭疽菌屬在連續(xù)種植3年后豐度分別為2.11%和0.66%。鏈格孢屬為重要植物病原菌，是根腐病[27]和黑斑病的致病菌[28]，可造成多種作物的嚴(yán)重病害。炭疽菌屬可引起蘋果、茶樹、鐵皮石斛等多種植物產(chǎn)生炭疽病，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[29-33]。

4 結(jié) 論

生長(zhǎng)時(shí)間和栽培模式是影響柴胡的根際微生物群落差異的重要原因，而地理位置也是影響群落結(jié)構(gòu)與組成的原因之一?？梢酝ㄟ^調(diào)整柴胡與玉米間作或輪作等栽培模式來保持根際微生物的菌落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進(jìn)柴胡種植業(yè)的健康發(fā)展。