基質(zhì)固相分散和HPLC-IT-TOF/MS聯(lián)用研究漆樹木材中多酚成分

陳虹霞， 周 昊,2， 陶 冉, 齊志文， 李文君， 王成章,2*

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042; 2.中國林業(yè)科學研究院 林業(yè)新技術研究所，北京 100091)

漆樹是一種落葉喬木，屬于漆樹科漆樹屬，在東亞地區(qū)常常把它作為中草藥用于治療胃腸炎、心臟病、關節(jié)炎、高血壓、糖尿病、中風和慢性疲勞綜合征[1-2]。據(jù)報道，漆樹提取物具有明顯的抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤作用[3-5]。目前主要采用熱回流浸提法、超聲波輔助萃取法和負壓提取等工藝對漆樹中的活性成分進行分析、分離和活性評價，這些方法通常需要大量的樣品和溶劑、較高的提取溫度和較長的提取時間[6-7]。因此，建立一種簡單、快速的提取方法對于漆樹提取物的質(zhì)量評價和后續(xù)分析具有重要的意義?；|(zhì)固相分散(MSPD)，由Barker于1989年提出，廣泛用于生物和食品樣品中化合物的提取和分析[8]。 MSPD已成功應用于粉塵中多溴聯(lián)苯醚[9]、農(nóng)作物中的黃曲霉毒素[10]、釀造酵母剩余物中的酚類化合物[11]和冷凍家禽中的抗生素殘留[12]等樣品色譜分析前的提取。高效液相色譜-離子阱-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-IT/TOF-MS)提供離子阱的MSn表征能力和TOF的高分辨率，以及質(zhì)量精度能力，是一種理想的結構鑒定工具，具有靈敏度高、分辨率高、質(zhì)量精度高和質(zhì)量范圍較寬的優(yōu)點[13-14]。采用MSPD的方法提取漆樹木中的酚類化合物，可以實現(xiàn)樣品的單步驟提取和凈化，具有操作簡單、溶劑消耗少和耗時短的優(yōu)勢；HPLC-IT/TOF-MS的分析方法，具有精準提供化合物結構信息的能力，有利于漆樹木中化合物的識別。因此，本研究采用基質(zhì)固相分散提取漆樹木中的多酚化合物，通過單因素試驗對工藝過程進行優(yōu)化，然后利用HPLC-IT/TOF-MS技術采集提取物中化合物的質(zhì)譜信息，通過裂解規(guī)律和文獻參考對漆樹中多酚化合物的化學成分進行分析。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

漆樹木樹干，來自于陜西商洛，自然晾干，粉碎成粉末，測定水分為8.28%， 過0.85 mm的篩，備用。硅膠C18、C8購于大連依利特分析儀器有限公司；硅藻土、殼聚糖、酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈、福林-喬卡爾特馬(FC)試劑和Na2CO3購于國藥集團化學試劑有限公司；分子篩ZSM-22和ZSM-5購于阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸購于Sigma公司。

高效液相色譜-離子阱-飛行時間型質(zhì)譜(HPLC-IT-TOF/MS)儀，LC-20A高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司；MultiskanGO型酶標儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 沒食子酸標準曲線的繪制

精確稱取沒食子酸標準品10 mg，加入蒸餾水溶解并定容到100 mL，得到0.1 g/L的標準品標準溶液。分別移取0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1 mL的0.1 g/L的標準溶液至10 mL的容量瓶中，分別加入1 mL的 0.2 mol/L FC試劑和2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，常溫反應2 h，在760 nm處測吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線，并擬合線性回歸方程，得到回歸方程為：Y=0.062X+0.005 2，相關系數(shù)R=0.999 1。沒食子酸在10～100 μg區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關系。

1.3 基質(zhì)固相分散(MSPD)提取

1.3.1提取 稱取漆樹木粉末0.2 g，加入吸附劑置于研缽中，用研杵使其混勻并研磨完全后，將混合物轉(zhuǎn)入到底部墊有脫脂棉的10 mL注射器中，頂部加入脫脂棉，壓實。用溶劑進行洗脫，收集洗脫液，并用10 mL的容量瓶定容，過0.45 μm的濾膜，用于多酚含量的測定。

1.3.2多酚含量測定 將1.3.1節(jié)收集的洗脫液稀釋至原體積的25倍，取0.2 mL于10 mL的容量瓶中，分別加入FC試劑和15% Na2CO3溶液，在760 nm下測定吸光度。漆樹多酚得率以每克樣品中沒食子酸(GAE)的質(zhì)量來表示。

1.3.3單因素試驗 根據(jù)單因素試驗設計，選取了5個因素，分別為：吸附基質(zhì)種類、吸附劑與樣品的比例、洗脫溶劑種類、研磨時間和洗脫溶劑用量進行基質(zhì)分散提取試驗。考察不同因素對漆樹木多酚提取得率的影響。

1.4 表征分析

1.4.1色譜條件 色譜柱(250 mm×4.6 mm,4 μm)；流動相為乙腈(A)/0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～20 min，90%～75%B；20～30 min，75%～60%B；30～40 min，60%～5%B；柱溫30 ℃；流速0.3 g/L；進樣量4 μL；檢測波長280 nm。

1.4.2質(zhì)譜條件 ESI離子源；檢測模式為正、負離子化；霧化氣為高純氮氣，流速1.5 L/min；離子積累時間10 ms；曲形脫溶劑管(CDL)和加熱模塊(BH)溫度為200 ℃; CID能量為50%；檢測器電壓為1.60 kV；MS檢測范圍m/z100～600。

2 結果與討論

2.1 MSPD條件對漆樹木多酚提取的影響

2.1.1吸附基質(zhì)種類 吸附基質(zhì)的選擇，在基質(zhì)固相分散提取中起著重要的作用，根據(jù)所提取化合物的極性和性質(zhì)，選擇合適的吸附基質(zhì)可以有效地提取目標物質(zhì)，分離干擾物質(zhì)。固定吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為3 ∶2，洗脫溶劑為甲醇，洗脫溶劑用量10 mL，研磨時間2 min，考察9種吸附基質(zhì)對漆樹木多酚提取的影響。其中，分子篩ZSM-22對漆樹木多酚的提取得率最高，為432.88 mg/g，其次是硅藻土、硅膠C8和硅膠C18(407.76、 388.67和372.59 mg/g)，分子篩ZSM-5和殼聚糖的漆樹木多酚提取得率分別為261.05和237.94 mg/g，而氧化鋁的效果最差，酸性、中性和堿性氧化鋁的多酚提取得率分別為207.80、 163.59和168.61 mg/g。

ZSM-22是一種高硅鋁比分子篩，具有特殊的孔道結構和較高的比表面活性，這些原因有助于提高提取效率。硅藻土的化學成分主要是SiO2，它比較容易與多酚類化合物的極性基團形成氫鍵，另外一方面硅藻土的孔隙較大，吸收性強，也有助于提高提取效率。而氧化鋁效果較差，可能是漆樹木中的黃酮類化合物與鋁形成絡合物，牢固地吸附在小柱上，使得溶劑很難洗脫。因此，選擇ZSM-22作為吸附基質(zhì)。

2.1.2吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比 適當?shù)奈交|(zhì)與樣品的質(zhì)量比可以有效地減少吸附基質(zhì)對樣品結構的破壞，增加洗脫溶劑與目標化合物的接觸面積，提高MSPD的提取效率。固定吸附基質(zhì)為ZSM-22，洗脫溶劑為甲醇，洗脫溶劑用量10 mL，研磨時間2 min，考察不同吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比(1 ∶2、 1 ∶1、 3 ∶2、 2 ∶1、 5 ∶2和3 ∶1)對漆樹木多酚提取的影響。圖1(a)的結果表明：隨著吸附基質(zhì)比例的提高，MSPD對漆樹木多酚的提取得率增大，這是由于吸附基質(zhì)與多酚化合物的接觸面積變大，從而增大了吸附基質(zhì)的吸附能力。當質(zhì)量比達到2 ∶1時，提取效率最高，進一步增加吸附基質(zhì)的比例，提取效率略微下降，這可能是樣品中多酚的吸附量已經(jīng)達到飽和，而過多的吸附基質(zhì)，使得溶劑很難完全將酚類物質(zhì)洗脫，導致提取得率下降。因此，選擇吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為2 ∶1。

2.1.3洗脫溶劑種類 洗脫是從固相萃取柱中解吸目標化合物的過程。因此，洗脫溶劑的極性和目標化合物在洗脫溶劑中的溶解度直接影響洗脫效率。固定吸附基質(zhì)為ZSM-22，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為3 ∶2，洗脫溶劑用量10 mL，研磨時間2 min，考察6種洗脫溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水、乙腈和正丁醇)對漆樹木多酚提取的影響。甲醇表現(xiàn)出最佳的洗脫效率，多酚提取得率432.88 mg/g；其次是水(290.19 mg/g)和乙醇(246.99 mg/g)。乙酸乙酯、乙腈和正丁醇的多酚提取得率分別為58.60、 127.73和73.87 mg/g。這是由于漆樹木多酚化合物包含很多酚羥基，與甲醇之間具有很好的相似相溶性?？紤]到水是除甲醇外，相對較好的洗脫溶劑。進一步對不同的甲醇體積分數(shù)進行研究，結果見圖1(b)。

由圖可知，隨著甲醇體積分數(shù)的提高，MSPD對漆樹木多酚的提取得率先增大后減小，甲醇體積分數(shù)在70%時，多酚提取得率最高。與甲醇相比，體積分數(shù)70%的甲醇水溶液具有更高的極性，更容易打破酚類物質(zhì)與ZSM-22之間的相互作用，利于多酚類化合物的解吸。因此，選擇體積分數(shù)70%的甲醇作為洗脫溶劑。

2.1.4研磨時間 通過研磨可以改變樣品的大小，使樣品與吸附基質(zhì)充分接觸，促進目標化合物與吸附基質(zhì)的相互作用。固定吸附基質(zhì)為ZSM-22，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為3 ∶2，洗脫溶劑為體積分數(shù)70%的甲醇，洗脫溶劑用量10 mL，考察研磨時間(0、 1、 2、 3和4 min)對漆樹木多酚提取的影響。由圖1(c)可知，隨著研磨時間的增加，漆樹木多酚提取得率先增大，這是由于研磨使漆樹木的組織變小，與ZSM-22之間的接觸面積變大。當研磨時間為2 min時，提取效果最好，進一步延長研磨時間，漆樹木多酚提取得率略微下降，這可能是由于長時間地研磨，使多酚類化合物牢固吸附在ZSM-22上，從而阻止了洗脫溶劑的洗脫。因此，選擇2 min作為最佳研磨時間。

2.1.5洗脫溶劑用量 洗脫溶劑用量是影響MSPD提取效率的重要因素。固定吸附基質(zhì)為ZSM-22，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為3 ∶2，洗脫溶劑為體積分數(shù)70%的甲醇，研磨時間2 min，考察洗脫溶劑用量(2、 4、 6、 8和10 mL)對漆樹木多酚提取的影響，結果見圖1(d)。

a.吸附基質(zhì)/樣品質(zhì)量比mass ratio of sample to adsorbent; b.甲醇體積分數(shù)methanol volume fraction;

隨著洗脫溶劑用量的增大，漆樹木多酚提取得率先增大后趨于平緩?？紤]到洗脫溶劑用量即要滿足樣品能夠完全洗脫，也要盡量少的使用洗脫溶劑，因此，選擇8 mL為最佳的洗脫溶劑用量。根據(jù)單因素試驗結果，得到漆樹木多酚基質(zhì)固相分散提取的最佳工藝條件為：ZSM-22為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為2 ∶1，洗脫溶劑為體積分數(shù)70%的甲醇，洗脫溶劑用量8 mL，研磨時間2 min。在此條件下，進行平行3次平行實驗，漆樹木多酚提取得率為(466±2.05) mg/g。

2.2 HPLC-IT-TOF/MS表征結果

2.2.1總離子流圖分析 應用HPLC-IT-TOF/MS技術對由基質(zhì)固相分散提取的漆樹木提取物進行分析，漆樹木提取物在正負離子下的總離子流圖見圖2。根據(jù)飛行時間質(zhì)譜的正、負離子模式測得的準分子離子峰和碎片離子峰，通過質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關文獻數(shù)據(jù)推測漆樹木提取物中的多酚成分的結構，共鑒定出10個化合物，包括3個酚酸類化合物和7個黃酮類化合物。各化學成分的保留時間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

圖2 漆樹木提取物的HPLC-IT-TOF/MS總離子流圖

表1 漆樹木提取物的HPLC-IT-TOF/MS分析

2.2.2酚酸類化合物鑒定 峰1，保留時間為1.133 min，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下得到準分子離子峰為m/z169.017 3[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z125.027 7[M-H-COO]-的碎片峰，與沒食子酸質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，推斷峰1為沒食子酸。峰2，保留時間為3.187 min，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下得到準分子離子峰為m/z183.032 1[M-H]-, 預測分子式為C8H8O5，其二級質(zhì)譜得到m/z125.019 2[M-H-COOCH2]-的碎片峰，與沒食子酸甲酯的質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，推斷峰2為沒食子酸甲酯。峰3，保留時間為6.200 min，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下得到準分子離子峰為m/z197.048 2[M-H]-, 預測分子式為C9H10O5，其二級質(zhì)譜得到m/z169.017 1[M-H-C2H4]-和124.975 9[M-H-C2H4-COO]-的碎片峰(見圖3)，該化合物的二級質(zhì)譜得到的數(shù)據(jù)與沒食子酸相似，推斷峰3為沒食子酸乙酯。

圖3 沒食子酸乙酯和沒食子酸甲酯的裂解規(guī)律圖

2.2.3黃酮類化合物的鑒定 峰4，保留時間為7.400 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z289.070 3[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z287.056 4[M-H]-，預測分子式為C15H12O6。在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z269.049 7[M-H-H2O]-、 254.930 2[M-H-H4CO]-和226.980 3[M-H-H4CO-CO]-碎片離子。m/z150.993 5碎片離子是由m/z287.056 4經(jīng)過1,3A的RDA裂解產(chǎn)生的(見圖4)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[15]，推斷峰4為黃顏木素。

圖4 黃顏木素的裂解規(guī)律圖

峰5，保留時間為9.587 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z305.066 8[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z303.052 1[M-H]-，預測分子式為C15H12O7，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z275.053 2[M-H-CO]-、 271.060 4[M-H-H4CO]-和242.919 3[M-H-H4CO-CO]-碎片離子。m/z179.025 4 碎片離子是由m/z303.052 1經(jīng)過1,2A的RDA裂解產(chǎn)生的，而m/z150.993 3碎片離子是由m/z179.025 4 通過丟失中性分子CO得到的(見圖5)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[16]，推斷峰5為花旗松素。

圖5 花旗松素的裂解規(guī)律圖

峰6，保留時間為10.760 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z273.075 5[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z271.063 1[M-H]-，預測分子式為C15H12O5，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z243.066 9[M-H-CO]-、 238.931 2[M-H-H4CO]-和226.980 1[M-H-H4CO-C]-碎片離子。m/z162.994 9碎片離子為m/z271.063 1經(jīng)過1,2A的RDA裂解產(chǎn)生的(見圖6)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[17]，推斷峰6為3,4′,7-三羥基黃烷酮。

圖6 3,4′,7-三羥基黃烷酮的裂解規(guī)律圖

峰7，保留時間為11.933 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z317.065 1[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z315.051 2[M-H]-，預測分子式為C16H12O7，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z301.047 9的碎片離子，為化合物丟失一個CH2的碎片離子，推測化合物含有甲氧基團。在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z255.042 0為m/z301.047 9的碎片離子丟失中性分子H2O和CO的碎片離子。m/z178.929 9和150.993 3為m/z301.047 9的碎片離子發(fā)生1,2A和1,3A的RDA裂解產(chǎn)生的(見圖7)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[18]，推斷峰7為異鼠李素。

圖7 異鼠李素的裂解規(guī)律圖

峰8，保留時間為13.453 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z449.107 0[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z447.094 1[M-H]-，預測分子式為C21H20O11，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z300.027 3，為槲皮素苷元失掉一個氫離子的離子峰，由此可以推測該化合物為槲皮素糖苷類化合物，根據(jù)丟失的相對分子質(zhì)量146推測為鼠李糖(C6H10O4)。m/z255.047 1為槲皮素苷元丟失中性分子CO和OH產(chǎn)生的碎片離子，m/z271.220 6為槲皮素苷元丟失中性分子CHO產(chǎn)生的碎片離子，m/z242.935 9為碎片離子進一步裂解丟失中性分子CO產(chǎn)生的(見圖8)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[19]，推斷峰8為槲皮苷。

圖8 槲皮苷的裂解規(guī)律圖

峰9，保留時間為14.720 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z287.055 2[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z285.040 5[M-H]-，預測分子式為C15H10O6，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z257.092 3[M-H-CO]-和228.980 5[M-H-CO-CO]-碎片離子，m/z162.994 2為準分子離子峰m/z285.040 5發(fā)生1,2A的RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子峰(見圖9)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[20]，推斷峰9為漆黃素。

圖9 漆黃素的裂解規(guī)律圖

峰10，保留時間為17.920 min，在飛行時間質(zhì)譜正離子模式下給出準分子離子峰為m/z271.059 7[M+H]+，在飛行時間質(zhì)譜負離子模式下給出準分子離子峰為m/z269.045 4[M-H]-，預測分子式為C15H10O5，在負離子模式下二級質(zhì)譜可見m/z240.924 1[M-H-CO]-和222.980 9[M-H-CO-H2O]-碎片離子。m/z136.994 3為準分子離子峰發(fā)生1,2A的RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子峰(見圖10)。根據(jù)表1數(shù)據(jù)以及結合文獻[21]，推斷峰10為硫黃菊素。

圖10 硫黃菊素的裂解規(guī)律圖

2.3 方法比較

為了進一步評價該方法的優(yōu)勢，將樣品用量、分析物、提取方法、溶劑、提取時間與其他文獻方法進行了比較，結果列于表2中。

表2 提取方法比較

采用熱回流提取[6,15]，負壓提取[7]與LC-MS聯(lián)用已用于漆樹木中化合物的提取與分析，然而這些方法通常比較耗時，提取溫度也較高，并且需要大量的提取溶劑才能分析目標化合物。而本研究方法與其他幾種方法相比，具有樣品用量少、溶劑用量少、提取時間短和常溫提取的優(yōu)點，所以采用MSPD是一個高效快捷的漆樹樣品預處理方法，與HPLC-IT-TOF/MS聯(lián)用，為漆樹木中酚類化合物的分析提供了更好的檢測效果。

3 結 論

3.1建立基質(zhì)固相分散(MSPD)提取漆樹木中多酚類化合物的方法，根據(jù)單因素試驗結果，漆樹木多酚MSPD提取的最佳工藝條件為：ZSM-22為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為2 ∶1，洗脫溶劑為體積分數(shù)70%甲醇，洗脫溶劑用量8 mL，研磨時間2 min。在此條件下，漆樹木多酚提取得率為(466±2.05) mg/g。

3.2采用HPLC-IT-TOF/MS聯(lián)用技術對漆樹木多酚化合物的化學組成進行了分離及鑒定，根據(jù)各個色譜峰在質(zhì)譜中的相對分子質(zhì)量、碎片信息和裂解規(guī)律，鑒定了10個化學成分，分別為沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、黃顏木素、花旗松素、 3,4′,7-三羥基黃烷酮、異鼠李素、槲皮苷、漆黃素和硫黃菊素。