理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞瘦素、神經(jīng)肽Y、八肽膽囊收縮素蛋白與基因的影響

劉啟艷， 張力文， 詹偉， 李春， 龐平， 高娜， 彭玉

小兒厭食癥是發(fā)生在兒童時(shí)期常見(jiàn)的慢性消化系統(tǒng)疾病，臨床以長(zhǎng)期厭惡進(jìn)食，食量減少為主要特征[1]。近年來(lái)研究表明，小兒厭食癥的發(fā)病機(jī)制與胃腸動(dòng)力紊亂、微量元素缺乏、多種腦腸肽分泌紊亂等有關(guān)[2-3]。有學(xué)者認(rèn)為，“腦腸肽-食欲中樞紊亂”是小兒厭食發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[4]。下丘腦作為食欲調(diào)節(jié)中樞[5]，其自身表達(dá)的腦腸肽對(duì)食欲調(diào)節(jié)作用尤為重要，如瘦素(leptin，LP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)，八肽膽囊收縮素(cholecystokinin-octopetide,CCK-8)等。理脾復(fù)方制劑是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療小兒厭食的驗(yàn)方-運(yùn)脾散(院內(nèi)制劑名為運(yùn)脾顆粒)基礎(chǔ)上研發(fā)的實(shí)驗(yàn)用顆粒制劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，其治療厭食有效率高達(dá)93.3%[6]，調(diào)節(jié)下丘腦及外周血的CCK-8蛋白濃度[7]?；诖耍狙芯恳韵虑鹉X神經(jīng)元細(xì)胞為靶點(diǎn)，開展理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞增殖及其分泌的LP、NPY、CCK-8蛋白及基因的調(diào)控影響，探討理脾復(fù)方制劑治療厭食的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5只孕20 d左右的SPF級(jí)SD大鼠；50只30日齡SPF級(jí)SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量(60±5)g。由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心SPF級(jí)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(黔)2015-0005]，每籠5只，雌雄分開，溫度(20±2)℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替照明。5只孕20 d左右的SPF級(jí)SD大鼠用于原代下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。本研究通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 理脾復(fù)方制劑(方藥組成：蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、薏苡仁各10 g，山藥、陳皮、枳殼、神曲、甘草各6 g)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉曉龍博士鑒定，委托貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉文教授參照陳大業(yè)方法[8]制備理脾復(fù)方制劑顆粒，其含量為2.70 g/kg，供試品樣品按干燥品計(jì)算，含柚皮苷(C27H32O11)應(yīng)不得少于0.98 mg/g，含橙皮苷(C28H34O13)不得少于0.52 mg/g；硫酸鋅口服液(浙江迪耳藥業(yè)有限公司)；DMEM/F1(美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH30023.01)；Neurobasal-A(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：10888-022)；B-27無(wú)血清補(bǔ)充劑(美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：17504044)；GAPDH(兔)(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB36264)；Goat Anti-Rabbit(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB160011)、磷酸鹽緩沖液(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180003)；TritonX-100(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180024)；Alexa Fluor 594-cnjugated Goat Anti-Rabbit(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB160018)；0.25%胰蛋白酶(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180002)、青-鏈霉素-兩性霉素B溶液(三抗)(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180056)；木瓜蛋白酶(bioswamp公司，貨號(hào)：PAB180072)、Rat CCK-8 ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號(hào)：RA20802)；Rat Leptin ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號(hào)：RA20489)；Rat NPY ELISA試劑盒(bioswamp公司，貨號(hào)：RA20022)；MAP2(兔)(美國(guó)abcam，貨號(hào)：ab183830)；NPY一抗(兔)(美國(guó)abcam，貨號(hào)：ab180809)；LP一抗(兔)(美國(guó)abcam，貨號(hào)：ab117751)；CCK-8一抗(兔)(美國(guó)Invitrogen，貨號(hào)：PA5-75438)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA，貨號(hào)：639505)；SYBR Green PCR試劑盒(美國(guó)KAPABiosystems，貨號(hào)：KM4101)。

1.3 主要儀器 SW-CJ-1D電泳儀(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)；311CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；DMIL LED倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；C2激光共聚焦(日本Nikon公司)；352型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)；AC-8洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems公司)；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能)；mini protean 3 cell電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；CFX-Connect 96熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；JY045-3C凝膠成像系統(tǒng)(北京君意華鑫科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.4.1 動(dòng)物分組 50只幼齡大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組，低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組，硫酸鋅組，每組10只。對(duì)照組灌胃給予等體積飲用水；硫酸鋅組灌胃給予20 mg/kg硫酸鋅口服溶液；低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組分別灌胃給予2.4、4.8和9.8 g/kg理脾復(fù)方制劑，各組每日灌胃1次，連續(xù)7 d，末次灌胃后1～2 h后予2%戊巴比妥鈉3 mL/kg，腹腔麻醉后股動(dòng)脈采血，各組血液靜置2 h后，以2 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)后無(wú)菌分離血清，0.22 μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)室溫恢復(fù)并采用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成10%濃度。

1.4.2 下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng) 取孕20 d的SPF級(jí)大鼠5只，麻醉后處死，取出胎鼠全腦，于體視顯微鏡下用彎頭鑷剝離軟腦膜及血絲，仔細(xì)剔除殘留的腦膜和血管，取出下丘腦至另一含DMEM/F12的EP管內(nèi)將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入木瓜蛋白酶2 g/L，37 ℃消化20 min，5 min搖晃1次，加入等體積的DMEM/F12培養(yǎng)基輕輕吹散組織，靜置2 min，取上層單個(gè)懸浮細(xì)胞，移至一新EP管中；沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊加等體積的新鮮培養(yǎng)液，重復(fù)上述步驟，將收集的細(xì)胞懸液過(guò)200目孔徑不銹鋼網(wǎng)除去未消化組織，離心3次，每次以1 000 r/min離心10 min；將收集的細(xì)胞用含2% B-27的DMEM/F12重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，分別用96孔板與6孔板培養(yǎng)，接種密度為7×105個(gè)/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后加入無(wú)血清的DMEM/F12清洗，維持培養(yǎng)基(45 mL Neurobasal-A+5 mL B27+1%三抗)，每3 d半量換液。

1.4.3 下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞鑒定 將神經(jīng)元細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，接種到對(duì)應(yīng)的孔板的爬片中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜；取出培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗2次，每次2 mL；加入4%多聚甲醛室溫固定30 min；磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min，洗滌3次，每次3 min；用5%牛血清白蛋白封閉1 h；吸去皿中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片，有細(xì)胞的一面朝上，放在吸水紙上；加1∶300的MAP2一抗稀釋液后置濕盒內(nèi)，室溫孵育1 h；磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min；加1∶200的Alexa Fluor 594-cnjugated Goat Anti-Rabbit稀釋液37 ℃孵育1 h后，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，每次3 min；取干凈的載玻片一塊，作上標(biāo)記，滴15～20 μL抗熒光淬滅封片液，含4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，貼在載玻片上，熒光倒置顯微鏡觀察。

1.4.4 細(xì)胞分組及給藥 采用CCK-8法篩選對(duì)照組、理脾復(fù)方制組(低、中、高劑量組)，硫酸鋅組在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h對(duì)下丘腦神經(jīng)元活性的影響，發(fā)現(xiàn)在24 h后，各含藥血清組對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞活性開始增強(qiáng)并具有區(qū)別性。故此，將培養(yǎng)成熟的下丘腦細(xì)胞消化后重新接種于96孔板中，分為對(duì)照、理脾復(fù)方制劑(低、中、高劑量)、硫酸鋅組共6組，用相應(yīng)10%含藥血清培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞24 h后用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4.5 ELISA法檢測(cè)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LP、NPY、CCK-8含量 10%含藥血清培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞24 h后收集每組細(xì)胞上清液，按LP、NPY、CCK-8的ELISA試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。

1.4.6 Western Blot法檢測(cè)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對(duì)表達(dá)量 10%含藥血清培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞24 h后收集每組細(xì)胞，加入適量裂解液，勻漿器直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃ 12 000g離心15 min，取上清，95 ℃以上加熱10 min，12 000g離心10 min，取上清，按二鋅可寧酸蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行定量，每孔上樣20 μg，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h或過(guò)夜，先后加入的一抗LP(1∶1 000)、CCK-8(1∶100)、NPY(1∶1 000)，室溫緩慢搖晃1 h或4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的1∶10 000二抗(羊抗兔)，室溫緩慢搖晃1 h后4 ℃孵育過(guò)夜，將膜放置于暗室中，取電化學(xué)發(fā)光液A和B等量混勻，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中進(jìn)行檢測(cè)，比較目的條帶相對(duì)灰度值計(jì)算出目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8基因相對(duì)表達(dá)量 Trizol法提取各組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度級(jí)濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，16 ℃，-20 ℃保存。合成cDNA模板后采用SYBR Green Ⅰ相對(duì)定量分析，選GAPDH作為內(nèi)參基因。完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和cDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個(gè)循環(huán)，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算樣品中基因相對(duì)表達(dá)量。各組大鼠LP、NPY、CCK-8基因基因表達(dá)量(△Ct值)，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參照基因Ct。引物L(fēng)P由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司制作，NPY、CCK-8由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司制作。具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞anti-MAP2免疫熒光法鑒定 圖1結(jié)果顯示，下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)染色后，黃色光激發(fā)微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞呈紅色熒光，紫外光激發(fā)DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，兩者融合后即為神經(jīng)元細(xì)胞。

圖1 anti-MAP2免疫熒光染色鑒定下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞(×200)

2.2 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞上清液LP、NPY、CCK-8蛋白含量的影響 表2結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞上清液中LP、NPY、CCK-8蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞上清液LP、NPY、CCK-8蛋白含量的影響

2.3 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 表3結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，中、高劑量理脾復(fù)方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞中LP、NPY、CCK-8蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但中、高劑量理脾復(fù)方制劑組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)LP、NPY蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8基因相對(duì)表達(dá)量的影響 表4結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高劑量理脾復(fù)方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞中LP基因相對(duì)表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低、中、高劑量理脾復(fù)方制劑組和硫酸鋅組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞中NPY、CCK-8基因相對(duì)表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。理脾復(fù)方制劑高劑量組對(duì)LP、NPY、CCK-8基因相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 理脾復(fù)方制劑含藥血清對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞LP、NPY、CCK-8基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

小兒厭食癥，臨床以較長(zhǎng)時(shí)期厭惡進(jìn)食，食量減少為特征，各年齡兒童均可發(fā)病，以1～6歲多見(jiàn)[9]，但國(guó)外有報(bào)道為6月齡至3歲兒童[10]。其發(fā)病主要由飲食不節(jié)、喂養(yǎng)不當(dāng)所致，這與父母予過(guò)多肥甘厚味或過(guò)分溺愛(ài)、任其恣食生冷等密切相關(guān)[11]。我國(guó)學(xué)齡前兒童厭食癥發(fā)病率為12%～34%，每年有遞增趨勢(shì)[12]，常見(jiàn)于城市兒童[4]。若本病治療不及時(shí)，可影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育，輕者發(fā)生疳證(營(yíng)養(yǎng)不良)，重者并發(fā)佝僂病以及貧血等[13]。因此，小兒厭食癥仍是中西醫(yī)兒科醫(yī)生共同關(guān)注及防治的疾病之一。

理脾復(fù)方制劑為“四君子湯”和“平胃散”兩方化裁而成，君藥蒼術(shù)微苦，氣味芳香而悅胃，善燥濕健脾；白術(shù)氣清香悅胃，其性甘溫補(bǔ)脾家之元?dú)?，善補(bǔ)氣以復(fù)脾運(yùn)，兩藥配伍使用，加強(qiáng)脾運(yùn)之功。山藥、白術(shù)共為臣藥，既可補(bǔ)益脾氣養(yǎng)胃，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化能力，又能生津以濡養(yǎng)臟腑經(jīng)絡(luò)。陳皮性溫燥而健脾，善燥濕和中；枳殼苦辛，善治飲食積滯；茯苓性平，補(bǔ)而不峻，利而不猛，為滲濕要藥；薏苡仁滲濕健脾；神曲性甘溫味辛以行散消食、健脾開胃；炙甘草為使藥，以調(diào)和諸藥。全方旨在“理順脾胃氣機(jī)轉(zhuǎn)樞，恢復(fù)胃納脾運(yùn)”作用。課題組前期對(duì)該方機(jī)制研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，理脾復(fù)方制劑除對(duì)胃腸推進(jìn)率有促進(jìn)作用外[14]，還對(duì)食欲中樞下丘腦組織中CCK-8蛋白含量具有調(diào)節(jié)作用[7]。由此可見(jiàn)，理脾復(fù)方制劑發(fā)揮治療作用的機(jī)制不僅與消化系統(tǒng)臟腑組織有關(guān)，也對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。

食欲調(diào)節(jié)機(jī)制包括下丘腦和腦干機(jī)制、甜味或氨基酸的味覺(jué)感受器(鮮味)、腸道肽能和激素對(duì)進(jìn)食和飽腹反應(yīng)的控制[15]。下丘腦位于大腦的內(nèi)側(cè)基底區(qū)域，感知并整合來(lái)自血管和第三腦室的各種信號(hào)(如葡萄糖和激素的水平)，從而調(diào)節(jié)食物攝入[16]。下丘腦神經(jīng)元包括具有抑制食欲功能的阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(pro-opiomelanocortin，POMC)神經(jīng)元和促進(jìn)食欲的NPY/阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原刺鼠相關(guān)蛋白肽(agouti-related peptide，AGRP)神經(jīng)元，其中POMC神經(jīng)元釋放的α-促黑激素是重要的食欲抑制因子，受LP等激素水平調(diào)節(jié)[17]。由此可推測(cè)，理脾復(fù)方制劑發(fā)揮治療厭食的作用機(jī)制可能與下丘腦神經(jīng)元中NPY、LP等有關(guān)。

NPY由36個(gè)氨基酸組成的活性單鏈多肽，由于結(jié)構(gòu)中富含酪氨酸，故稱為神經(jīng)肽酪氨酸，“Y”指的就是分子兩端的酪氨酸殘基。NPY受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體，目前發(fā)現(xiàn)的NPY受體有Y1R、Y2R、Y3R、Y4R、Y5R，其中Y1R、Y2R、Y5R與攝食密切相關(guān)[18-19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，弓狀核表達(dá)最為豐富，是大腦中發(fā)現(xiàn)的最有效的食欲肽之一[20]。LP(源于希臘語(yǔ)“l(fā)eptos”，意思是“瘦”)來(lái)源于位于7號(hào)染色體上的lep基因，是一種主要由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的16 kda多肽，乳腺、卵巢、骨骼肌、胃、腦下垂體和淋巴組織可能產(chǎn)生少量的LP。LP在調(diào)節(jié)食物攝入方面起關(guān)鍵作用，無(wú)論是外周還是中樞注射LP，都能顯著抑制ob/ob大鼠食物攝入[21]。在中樞系統(tǒng)中，LP靶神經(jīng)元分布于下丘腦的各個(gè)區(qū)域，包括弓狀核、腹側(cè)乳頭前核、內(nèi)側(cè)視前核、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)、室旁下丘腦核、外側(cè)下丘腦區(qū)[22]。血液中的LP可通過(guò)血腦屏障，直接與大腦溝通[23]?？扇苄訪P受體在POMC和NPY/AGRP神經(jīng)元上均有表達(dá)，以弓狀核表達(dá)最高[5]，LP通過(guò)可溶性LP受體刺激POMC神經(jīng)肽合成并產(chǎn)生α-促黑激素，發(fā)揮抑制食欲與減少體質(zhì)量作用。CCK由115個(gè)CCK氨基酸前體衍生而來(lái)，包括CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-22、硫酸化的CCK-8和CCK-7、非硫酸化的CCK-8和CCK-7、CCK-5、CCK-4[24]。CCK在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，如下丘腦、腦干等部位，其中以下丘腦表達(dá)最為豐富[25]，尤其是CCK-8。本研究結(jié)果顯示，理脾復(fù)方制劑含藥血清可降低正常大鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞中LP、NPY、CCK-8蛋白、基因相對(duì)表達(dá)量以及其上清液中LP、NPY、CCK-8含量。

綜上所述，理脾復(fù)方制劑治療厭食作用機(jī)制之一可能通過(guò)綜合調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)元中LP、NPY、CCK-8蛋白及基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)改善厭食相關(guān)癥狀，但影響LP、NPY、CCK-8蛋白及基因表達(dá)作用與劑量呈負(fù)相關(guān)性，其中以高劑量作用明顯。