蝦青素通過激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和自噬

梁少奎,陽國梁,胡 慧,徐 越,肖 沛,羅梓玉,周 暢*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南 長沙 410081;2.廣西南寧市天桃實(shí)驗(yàn)學(xué)校,中國廣西 南寧 530216;3.湖南財(cái)政經(jīng)濟(jì)學(xué)院,中國湖南 長沙 410205)

睪丸生殖細(xì)胞瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)在人群中是一種相對(duì)罕發(fā)癌癥,但在15～35歲男性中卻是比較常見的惡性腫瘤之一[1]。目前,其治療方法主要采取手術(shù)與化療、放療相結(jié)合的方式。雖然睪丸生殖細(xì)胞瘤的治愈率很高,但患者術(shù)后患繼發(fā)性腫瘤的概率比較高,且放、化療可能會(huì)導(dǎo)致不育等并發(fā)癥[2～4],同時(shí)還易產(chǎn)生順鉑抗性等副作用[5],因此急需尋找更安全的治療手段。天然藥物提取物具有不良反應(yīng)小、作用獨(dú)特、研究成本低的特點(diǎn)。當(dāng)前,很多天然藥物提取物的抗腫瘤機(jī)制研究取得了突破性進(jìn)展,并已作為抗腫瘤藥或抗腫瘤輔助藥得到廣泛的應(yīng)用,例如:Li等[6]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過上調(diào)Bax/Bcl-2比例,以及上調(diào)p53和Fas,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Lü等[7]在乳腺癌新輔助治療方案的回顧性研究中發(fā)現(xiàn),結(jié)合紫杉醇的輔助治療具有較好的療效。

蝦青素(astaxanthin,AST)是一種從蝦蟹外殼以及藻類等海洋生物中提取的紅色天然類胡蘿卜素[8],化學(xué)名稱為 3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素,分子式為C40H52O4,具有極強(qiáng)的抗氧化性[9]、抗炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[10～12]。前期文獻(xiàn)報(bào)道,蝦青素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、口腔癌細(xì)胞等都具有生長抑制效應(yīng)[13～15],但關(guān)于蝦青素對(duì)睪丸生殖細(xì)胞瘤的影響及其可能的分子調(diào)控機(jī)制目前尚未見報(bào)道。本研究以睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞系NCCIT和NT2為研究對(duì)象,觀察蝦青素作用后,細(xì)胞的生長情況,探究蝦青素對(duì)NCCIT和NT2細(xì)胞凋亡和自噬的影響,并探討其對(duì)絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)通路的調(diào)控作用,為睪丸生殖細(xì)胞瘤防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞系NCCIT和NT2均購自上海中科院細(xì)胞庫。

蝦青素(分析對(duì)照品,UV≥98%,100 mg,批號(hào)A9692E769,購自上海Acmec公司)溶解于1,2-丙二醇(上海生工生物工程股份有限公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;PVDF膜購自美國 Millipore 公司。GAPDH、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的單克隆抗體購自英國Abcam 公司;Beclin1、LC3、p38、p-p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-ERK的抗體購自美國Cell Signal Technology公司;c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、多聚 ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;二抗goat anti-rabbit和goat anti-mouse購自北京西美杰科技有限公司。其余常規(guī)試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司。

本研究使用的儀器主要有:FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司,美國);熒光顯微鏡Axioskop 2 plus Zeiss(Zeiss公司,德國);Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司,美國);Tanon 5200-Multi凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);SXZX16熒光體式顯微鏡(OLYMPUS公司,日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理

將NCCIT、NT2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2,37℃)中培養(yǎng),待細(xì)胞生長至90%左右,用0.2%胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期NCCIT、NT2細(xì)胞,用胰酶消化離心后重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1,鋪板24 h后,將其分為空白對(duì)照組和3個(gè)不同處理濃度的實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做任何處理(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示含丙二醇的溶劑組與不含任何試劑的空白組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異不明顯,故僅設(shè)一組空白組為對(duì)照組),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入終濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmo/L的蝦青素。

1.2.2 MTT法檢測蝦青素對(duì)NCCIT、NT2細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞分組及處理同1.2.1。具體檢測步驟按照文獻(xiàn)[16]的方法,其中,將細(xì)胞接種于96孔板,同時(shí)設(shè)4個(gè)復(fù)孔,處理時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h。用酶標(biāo)儀測定每孔490 nm處的光密度值(OD值)。用如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測蝦青素對(duì)NCCIT、NT2細(xì)胞活力的影響

具體操作按照文獻(xiàn)[17]的方法。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組和蝦青素實(shí)驗(yàn)組,蝦青素處理濃度為0.2 mmol/L,處理時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h。用如下公式統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率:活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成檢測蝦青素對(duì)NCCIT細(xì)胞生長的影響

NCCIT細(xì)胞分組及處理同1.2.1。具體檢測步驟按照文獻(xiàn)[18]的方法,其中,細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于6孔板。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)(含≥50個(gè)細(xì)胞數(shù))后用如下公式計(jì)算克隆形成率:克隆相對(duì)形成率(%)=(實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/空白對(duì)照組克隆數(shù))×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色法檢測細(xì)胞形態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組和蝦青素實(shí)驗(yàn)組,蝦青素處理濃度為0.2 mmol/L,加藥處理24 h后,按照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.6 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞分組及處理同1.2.1。藥物處理24 h后,按照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行后續(xù)操作,最后進(jìn)行凋亡率的計(jì)算分析。

1.2.7 Western-blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

細(xì)胞分組及處理同1.2.1。加藥處理24 h后,按照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行后續(xù)操作,檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PARP、自噬相關(guān)蛋白質(zhì)Beclin1和LC3的表達(dá)水平,以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)(JNK、p38和ERK)及其磷酸化水平。用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蝦青素抑制NCCIT、NT2細(xì)胞增殖

為了檢測蝦青素對(duì)睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響,采用不同濃度的蝦青素(0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L)對(duì) NCCIT 和 NT2 細(xì)胞進(jìn)行處理,通過MTT、臺(tái)盼藍(lán)拒染和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖情況。MTT法檢測結(jié)果如圖1A所示,與空白對(duì)照組相比,蝦青素以劑量和時(shí)間依賴性抑制NCCIT和NT2細(xì)胞增殖。蝦青素處理 72 h時(shí),0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L 蝦青素實(shí)驗(yàn)組中NCCIT細(xì)胞的存活率分別為(81.10±6.74)%、(63.77±5.27)%和(53.75±5.34)%;NT2細(xì)胞的存活率分別為(66.59±10.81)%、(42.87±9.91)%和(18.65±2.75)%,與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示,與空白對(duì)照組相比,蝦青素(0.2 mmol/L)處理可明顯降低NCCIT、NT2細(xì)胞活性。其中,蝦青素處理72 h時(shí),NCCIT和NT2細(xì)胞的活力分別為(60.61±3.61)%和(52.57±4.41)%,與空白對(duì)照組比較均有顯著差異(P<0.01)。MTT和臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示,NCCIT細(xì)胞較NT2細(xì)胞對(duì)蝦青素的耐受性更強(qiáng)。因此,我們用NCCIT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖1C所示:隨著蝦青素處理濃度增加,細(xì)胞克隆形成能力降低,且與空白對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組的克隆形成率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

圖1 蝦青素抑制NCCIT、NT2細(xì)胞增殖(A)不同濃度的蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h、48 h、72 h后,MTT法檢測細(xì)胞增殖率;(B)0.2 mmol/L蝦青素處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h、48 h、72 h時(shí),臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活性;(C)不同濃度的蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT細(xì)胞7～10 d,再用結(jié)晶紫染色檢測克隆形成數(shù)目。數(shù)據(jù)以3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;與空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;兩組間比較采用t檢驗(yàn)。圖2～4的統(tǒng)計(jì)分析同此圖。Fig.1 Astaxanthin inhibits proliferation in NCCIT and NT2 cells(A)Cell proliferation rates detected by MTT assay after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h,48 h and 72 h;(B)Cell activities measured by trypan blue dye exclusion after treatment with 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h,48 h and 72 h;(C)Clonogenic growth of NCCIT cells treated with astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 7 to 10 days and stained by crystal violet.Data represent the mean±SD from three separate experiments.*P<0.05 and**P<0.01,compared with control group.Comparison between two groups was performed by t-test.The statistical analysis of the Figs.2～4 is the same as this one.

2.2 蝦青素誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞凋亡

0.2 mmol/L蝦青素處理24 h后,NCCIT和NT2細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果如圖2A所示,空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)、大小均正常,蝦青素處理組中,NCCIT和NT2均出現(xiàn)細(xì)胞體積變小、細(xì)胞核熒光強(qiáng)度增高、核固縮等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。為量化凋亡比例,使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率,結(jié)果如圖2B所示,隨著蝦青素處理濃度加大,細(xì)胞總凋亡率呈遞增趨勢。在NCCIT細(xì)胞中,空白對(duì)照組的總凋亡率為(3.82±0.51)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L蝦青素處理組的總凋亡率分別為(4.98±0.45)%、(8.36±0.65)%、(16.58±2.32)%;在 NT2細(xì)胞中,空白對(duì)照組的總凋亡率為(8.14±1.32)%,0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L蝦青素處理組的總凋亡率分別為(15.52±2.62)%、(19.31±0.37)%、(23.43±5.10)%,兩個(gè)細(xì)胞組的結(jié)果平行性好,與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。進(jìn)一步采用Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,結(jié)果如圖2C所示,蝦青素處理組與空白對(duì)照組相比,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和 cleaved PARP的表達(dá)水平升高。以上細(xì)胞水平和分子水平實(shí)驗(yàn)均表明,蝦青素能誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞凋亡。

圖2 蝦青素誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞凋亡(A)0.2 mmol/L蝦青素處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h后,將細(xì)胞固定并用Hoechst33258染色,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);(B)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI染色,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率;(C)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h后,采用Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。Fig.2 Astaxanthin induces apoptosis in NCCIT and NT2 cells(A)Morphology of apoptotic cell nuclei under a fluorescent microscope after cells were exposed to 0.2 mmol/L astaxanthin for 24 h and then stained with Hoechst33258;(B)Apoptosis rates analyzed by flow cytometry after cells were treated with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h and stained with Annexin V-FITC/PI;(C)Expression of apoptosis related proteins in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

2.3 蝦青素誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡方式之一,對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[21]。Beclin1與自噬體的成熟相關(guān),LC3Ⅱ的表達(dá)與自噬小泡發(fā)生相關(guān),反映自噬的發(fā)生發(fā)展程度。蝦青素處理細(xì)胞24 h后,采用Western-blot檢測細(xì)胞中自噬相關(guān)LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表達(dá),結(jié)果如圖3A所示,LC3的激活體LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表達(dá)水平隨蝦青素處理濃度增加而升高,提示蝦青素可能誘導(dǎo)NCCIT和NT2細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖3 蝦青素誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞自噬(A)不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h后,采用Western-blot檢測自噬相關(guān)蛋白質(zhì)Beclin1和LC3的表達(dá)水平;(B)用CQ(1 μmol/L)預(yù)處理NCCIT和NT2細(xì)胞0.5 h,之后聯(lián)合蝦青素(0.2 mmol/L)共同處理24 h,采用Western-blot檢測Beclin1和LC3蛋白的表達(dá)水平。Fig.3 Astaxanthin induces autophagy in NCCIT and NT2 cells(A)Expression of Beclin1 and LC3 in cells analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h;(B)Expression of Beclin1 and LC3 analyzed by Western-blot after cells were pretreated with CQ(1 μmol/L)for 0.5 h,and co-incubated with astaxanthin(0.2 mmol/L)for another 24 h.

為明確蝦青素誘導(dǎo)LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的升高是通過增加自噬體的生成還是抑制自噬體的降解,應(yīng)用抑制自噬體降解的自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)進(jìn)行處理。結(jié)果如圖3B所示,CQ處理促進(jìn)了蝦青素(0.2 mmol/L)誘導(dǎo)的Beclin1表達(dá)增加,并顯著增加蝦青素誘導(dǎo)的LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)表明,蝦青素可誘導(dǎo)NCCIT和NT2細(xì)胞發(fā)生自噬,且這種作用是通過增強(qiáng)自噬活性使自噬體形成增多實(shí)現(xiàn)的,而不是通過抑制自噬體的降解實(shí)現(xiàn)的。

2.4 蝦青素激活NCCIT、NT2細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路

許多研究證實(shí)MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長發(fā)育、分化和死亡等生物學(xué)過程中具有重要作用[22～23]。本研究通過檢測MAPK信號(hào)通路中3個(gè)主要成員的表達(dá),考察蝦青素誘導(dǎo)NCCIT、NT2細(xì)胞凋亡和自噬的可能機(jī)制。結(jié)果如圖4所示,與空白對(duì)照組相比,蝦青素處理組中JNK、p38和ERK的磷酸化水平升高,而JNK、p38和ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平無明顯差異,表明蝦青素可以激活NCCIT、NT2細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路。

圖4 蝦青素激活NCCIT、NT2細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路不同濃度蝦青素(0.1～0.3 mmol/L)處理NCCIT和NT2細(xì)胞24 h后,采用Western-blot檢測JNK/p-JNK、p38/p-p38、ERK/p-ERK蛋白的表達(dá)水平。Fig.4 Astaxanthin activates MAPK signaling pathway in NCCIT and NT2 cellsExpressions of JNK/p-JNK,p38/p-p38,ERK/p-ERK in cells were analyzed by Western-blot after treatment with different concentrations of astaxanthin(0.1～0.3 mmol/L)for 24 h.

3 討論

傳統(tǒng)中藥中的活性成分日益受到關(guān)注。但是,傳統(tǒng)中藥成分中大多數(shù)活性小分子化合物的藥理機(jī)制仍不明確,這極大地限制了中藥資源的開發(fā)利用。因此,利用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的研究手段,深入探究天然藥物中提取的高活性小分子化合物的抗腫瘤機(jī)制是中藥現(xiàn)代化開發(fā)利用的必需手段。

蝦青素已被證明具有強(qiáng)抗氧化性,以及抗腫瘤、抗炎和免疫抑制等多種功能,具有廣闊的應(yīng)用前景。Yasui等[14]的研究結(jié)果表明,蝦青素可以通過NF-κB信號(hào)通路抑制葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減輕偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸增生性病變,并減少結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生。Kavitha等[24]利用7,12-二甲基苯并(a)蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)誘發(fā)倉鼠頰袋腫瘤,并在倉鼠右側(cè)頰袋涂0.5% DMBA誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的同時(shí),按照15 mg/kg的劑量在其飼料中添加蝦青素進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)蝦青素可以預(yù)防腫瘤的產(chǎn)生,其保護(hù)作用可能與其激活Nrf2/Keap-1信號(hào)通路有關(guān)。蝦青素在預(yù)防腫瘤發(fā)生和癌癥治療方面有很好的潛能[10],但是,蝦青素抗腫瘤的詳細(xì)分子機(jī)制目前仍未完全闡明。

本研究首先通過繪制細(xì)胞生長曲線檢測了蝦青素對(duì)睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,蝦青素對(duì)兩種細(xì)胞增殖有著顯著的抑制作用,且這種抑制作用在其濃度低至0.1 mmol/L時(shí)依然存在(圖1A)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn),蝦青素能抑制NCCIT細(xì)胞的存活能力(圖1C),0.3 mmol/L蝦青素處理組的克隆數(shù)與對(duì)照組比較下降50%。進(jìn)一步的細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示,0.2 mmol/L的蝦青素處理NCCIT、NT2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮,甚至變圓脫落,細(xì)胞密度顯著下降(圖2A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同濃度蝦青素處理NCCIT、NT2細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增高(圖2B)。細(xì)胞凋亡主要通過caspase通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)。正常情況下,caspase蛋白及PARP以無活性的前體形式存在,當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)其會(huì)被上一級(jí)caspase蛋白切割而活化。因此,caspase和PARP的切割情況可以用來判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),用蝦青素處理細(xì)胞,尤其是高濃度(0.2 mmol/L和0.3 mmol/L)處理時(shí),caspase-3及PARP均能檢測到明顯的切割條帶。同時(shí),蝦青素處理組細(xì)胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2顯著下調(diào),而促凋亡蛋白Bax顯著上調(diào)。Bax通過與線粒體膜結(jié)合,形成滲透性膜轉(zhuǎn)移孔復(fù)合物,建立線粒體膜通道,介導(dǎo)促凋亡分子細(xì)胞色素C和Smac/Diablo等的釋放,從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),并通過caspase-3激活破壞基因組DNA的核酸內(nèi)切酶,造成基因組DNA裂解,同時(shí)失活DNA修復(fù)相關(guān)酶,造成DNA修復(fù)能力降低,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分解細(xì)胞骨架,引起一系列凋亡執(zhí)行過程的發(fā)生。本文研究結(jié)果顯示,蝦青素可以顯著提高Bax/Bcl-2的比值,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與Hormozi等[25]研究蝦青素誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞株LS-180細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。

小分子抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性一般體現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死及自噬性死亡。自噬既是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制,也是一種與凋亡并列的程序性死亡機(jī)制。Beclin1是哺乳動(dòng)物中Atg6的同源蛋白質(zhì),是酵母ATG6/Vps30在哺乳動(dòng)物中的同源物,是介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬泡的關(guān)鍵因子。人類的Beclin1基因位于染色體17q21,其編碼產(chǎn)物是啟動(dòng)自噬過程的標(biāo)志和調(diào)節(jié)自噬現(xiàn)象的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。Beclin1包含4個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域,其中包括Bcl-2結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Bcl-2 homology domains,BH3)。Beclin1作為一種自噬調(diào)節(jié)因子,同Bcl-2解離的過程可能有兩種機(jī)制。一是通過BOP蛋白(BH3-only protein)競爭性結(jié)合Bcl-2,使二者解離;二是JNK-1磷酸化Bcl-2的多個(gè)絲氨酸蘇氨酸位點(diǎn),磷酸化后的Bcl-2蛋白與Beclin1蛋白的結(jié)合能力大大減弱,從而分離,分離后的Beclin1與PI3KⅢ/Vps34的相互作用加強(qiáng),刺激自噬的發(fā)生[26]。因此,我們進(jìn)一步檢測蝦青素是否影響自噬體形成的標(biāo)志蛋白質(zhì)LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示,Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)水平隨蝦青素處理濃度的升高而增高,并且在聯(lián)合自噬抑制劑CQ處理后,兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平較蝦青素單獨(dú)處理時(shí)顯著增加,這表明蝦青素誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。蝦青素調(diào)控Beclin1和Bcl-2蛋白復(fù)合物,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。

細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生受多條信號(hào)通路和多種調(diào)節(jié)因子的作用,MAPK信號(hào)通路是主要信號(hào)通路之一。MAPK級(jí)聯(lián)激活是多種信號(hào)通路的中心,MAPK通路的主要作用是接收膜受體并轉(zhuǎn)換與傳遞相關(guān)信號(hào)至細(xì)胞核。MAPK信號(hào)通路有3個(gè)主要家族成員:JNK、p38和ERK。活化的JNK和p38可通過調(diào)控與凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子間接或直接調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和caspase蛋白,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27～28]。本文的研究結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,隨著蝦青素處理濃度的增加,JNK與p38蛋白的表達(dá)水平無顯著變化,而p-JNK和p-p38蛋白的表達(dá)水平上調(diào),這提示蝦青素是通過激活JNK和p38調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白質(zhì),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,隨著蝦青素處理濃度的增加,ERK蛋白的表達(dá)水平也無顯著變化,而p-ERK、剪切的PARP以及Beclin1和LC3Ⅱ的表達(dá)水平增加,提示蝦青素促進(jìn)NCCIT、NT2細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化,可能激活ERK/MAPK通路,活化caspase-3,進(jìn)而剪切PARP,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時(shí)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)LC3Ⅱ和Beclin1的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

綜上所述,本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),蝦青素通過激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和自噬。下一步,我們將建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究蝦青素與低毒性自噬抑制劑聯(lián)合使用的效果,為蝦青素抗腫瘤功效的后期開發(fā)利用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。