舜皇山母豬與長×大二元雜母豬腸道微生物多樣性的比較分析

陳 丹,尹業(yè)師,李百元,陳華海,胡云霏

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,中國湖南 永州 425199)

舜皇山母豬(Shunhuangshan sow),學(xué)名“東安豬”,主產(chǎn)于湖南省永州市東安縣舜皇山,是永州本地的土豬品種,屬于肉脂兼用型,同時(shí)也是沙子嶺豬種之一[1],2012年被國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局批準(zhǔn)列入國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品,2015年入選由中國質(zhì)檢出版社、中國標(biāo)準(zhǔn)出版社聯(lián)合出版的《中國地理標(biāo)志產(chǎn)品大典·湖南卷》[2]。獨(dú)特的地理、氣候、水文、土壤環(huán)境以及生產(chǎn)工藝,造就了舜皇山母豬獨(dú)特的品質(zhì),使其具備肉色鮮艷、肉質(zhì)鮮美、口感好等特點(diǎn)[3]。長×大二元雜母豬(Landrace-Yorkshire binary sow)是指長白公豬與約克母豬雜交生產(chǎn)的母豬,是目前常見的規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖品種,是瘦肉型的商品豬[4～5]。地方土豬雖然在生長速率、生產(chǎn)成本等方面與引進(jìn)的雜交豬品系有較大差距,但地方土豬本身的品種特性,以及地方特色飼養(yǎng)環(huán)境,使其具備了與周圍環(huán)境的高度適應(yīng)性,因而展示了高繁殖性能、耐粗飼、抗逆性、優(yōu)良肉質(zhì)等方面的特性[6～7]。這些特性的形成可能與其特殊的腸道微生物群組成緊密相關(guān)[8]。

文獻(xiàn)報(bào)道,哺乳動物的胃腸道中有大約103種細(xì)菌,豬胃腸道內(nèi)每克腔內(nèi)物或糞便沉淀含有1010～1011個(gè)微生物,它們通過與宿主的相互作用,在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、防止病原體定植、維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常黏膜的免疫與代謝平衡等宿主生理功能方面發(fā)揮重要作用[9～12]。在健康的腸道中,某些種類的微生物群落總是保持著大量且恒定的數(shù)量,這有助于營養(yǎng)物質(zhì)的再利用和維生素的產(chǎn)生[13]。豬群腸道微生物的組成受多種因素的影響,如品種、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料、傳染病、抗生素的使用等[14～15]。報(bào)道顯示,不同品種的豬腸道菌群組成不同,而國外品種(瘦肉型)和中國品種(相對肥胖型)的差異格外明顯[16]。同時(shí),飼養(yǎng)方式對豬腸道微生物也有較大的影響[8]。舜皇山母豬具有雜食性,以粗糧為食,多采用散養(yǎng)方式,本地的飼料資源,如稻谷、碎米、米糠、豆腐渣、紅薯、麥麩以及叢生于田間地頭的禾間菜、野花生、千層樓、四輪草、水竹葉等幾十種優(yōu)質(zhì)牧草,均可食用[1]。正是這種植食性的無抗喂養(yǎng)方式,造就了舜皇山母豬獨(dú)特的肉質(zhì)和耐粗飼、抗病能力強(qiáng)等性能,而這些品質(zhì)的形成與腸道微生物群密切相關(guān),推測可能存在特殊的益生菌。因此,深入了解豬腸道微生物的組成和特征,挖掘其在抗病以及耐粗飼料等方面的作用,開發(fā)腸道內(nèi)特殊的益生菌,對我國養(yǎng)殖動物的健康、畜產(chǎn)品質(zhì)量的升級以及養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展均具有重要作用。

本研究以同一養(yǎng)殖場的舜皇山母豬和商品化豬(長×大二元雜母豬)腸道微生物為研究對象,通過16S rDNA高通量測序技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)對兩種品系豬腸道微生物的組成和多樣性進(jìn)行分析,解析兩個(gè)品系豬腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu),尋找兩個(gè)品系豬腸道微生物的差異信息,從而揭示腸道微生物在抗病以及耐粗飼料等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年12 月,在湖南永州東安縣恒惠農(nóng)牧有限公司生豬養(yǎng)殖場實(shí)地采集舜皇山母豬及普通商品化長×大二元雜系列母豬(以下簡稱二元雜母豬)成熟階段的糞便樣品。舜皇山母豬樣本5組,編號M;二元雜母豬樣本6組,編號ER,置于4℃冷藏,2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。將采集的樣品置于超凈工作臺內(nèi),分別稱取0.2～0.3 g,裝入2 mL離心管內(nèi)。剩余樣本用7 mL離心管分類分裝,放入-80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.2 樣本總DNA提取

按照柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程提取舜皇山母豬以及二元雜母豬糞便樣品中的細(xì)菌總DNA,簡要步驟如下:在裝有糞便樣本的2 mL離心管中加入0.5 mL 65℃預(yù)熱的溶液A,劇烈震蕩10 min,65℃水浴5 min;12 000 r/min離心3 min后轉(zhuǎn)移上清,加入等體積的溶液B,上下顛倒混勻,冰浴5 min;12 000 r/min離心3 min,轉(zhuǎn)移上清,加入0.2 mL氯仿,震蕩混勻;12 000 r/min離心3 min,小心轉(zhuǎn)移上清至新離心管中,加入0.8 mL的溶液C,上下顛倒30 s混勻,分兩次加入吸附柱;12 000 r/min離心30 s,棄廢液,加0.7 mL通用洗注液,隨后12 000 r/min離心30 s,棄穿透液;再加0.3 mL通用洗注液,12 000 r/min離心30 s,棄穿透液;空管12 000 r/min離心1 min,隨后將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的2 mL離心管中,加入100 μL DNA洗脫液2.0,室溫靜置2 min;12 000 r/min離心30 s,得到細(xì)菌總DNA。將獲得的總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,并用微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度,最后將其置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 16S rDNA高通量測序

將提取的細(xì)菌總DNA分別取60 μL送往杭州利貞生物醫(yī)藥科技有限公司,利用 Illumina MiSeq平臺進(jìn)行16S rDNA V3～V4區(qū)高通量測序,測序引物為通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和 805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′),其中 N 表示 A、C、G、T 的任何一種,W表示A或T,H表示A、C或T,V表示A、C或G。測序原始數(shù)據(jù)上傳NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得的GenBank序列號為PRJNA644137。

根據(jù)公司提供的樣本OTUs(operational taxonomic units)及物種注釋信息,利用Visual Genomics-AS-v1.4.1軟件中的“Alpha Diversity Analysis”模塊計(jì)算每個(gè)樣本的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及覆蓋率,用以分析單個(gè)樣本的物種豐富度及均勻度,并利用SPSSAU-v20.0(https://www.spssau.com)對不同品種樣本的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及覆蓋率在線進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,考察兩個(gè)品種樣本的物種多樣性差異。利用“Beta Diversity Analysis”模塊比較不同品種間的微生物多樣性,考察兩個(gè)品種間是否具有顯著的微生物群落差異。同時(shí),對相同豬種不同樣本的OTU豐度求平均值,選擇平均相對豐度大于0.01%的OTUs,并利用Bioinformatics&Evolutionary Genomics網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線制作Venn圖,以分析兩個(gè)品系豬種共有OTU數(shù)目。然后,通過“Community Structure Analysism”模塊分析各品系豬腸道微生物的門水平組成及屬水平組成,利用SPSSAU-v20.0在線分析腸道微生物組成的豐度差異,并利用Microsoft Excel繪制門水平和屬水平的微生物組成條形圖。最后,通過“Lefse Analysis”模塊分析不同品種豬腸道內(nèi)差異顯著的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)是估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù),兩者數(shù)值越大,表明群落的豐富度越高。Shannon指數(shù)常用來估算樣品中微生物的多樣性,其數(shù)值越高,表明群落的多樣性越高。覆蓋率(coverage)反映的是測序深度。由表1可知,舜皇山母豬樣本和二元雜母豬樣本的測序深度較高,覆蓋率在98.90%以上。此外,舜皇山母豬的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于二元雜母豬,且舜皇山母豬的ACE指數(shù)顯著高于二元雜母豬(P<0.050 0),說明舜皇山母豬腸道中的物種豐度及菌群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性更高。

表1 16S rDNA高通量測序數(shù)據(jù)的α多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis of high-throughput sequencing data of 16S rDNA genes(±s)

表1 16S rDNA高通量測序數(shù)據(jù)的α多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis of high-throughput sequencing data of 16S rDNA genes(±s)

Sample information ACE Chao Shannon Coverage Landrace-Yorkshire binary sows(n=6)1 314.553 8±197.277 6 1 333.186 4±209.570 3 5.239 3±0.277 7 0.991 2±0.001 3 Shunhuangshan sows(n=5)1 556.286 5±144.615 6 1 553.032 5±156.227 5 5.467 2±0.244 1 0.989 7±0.000 9 t P-2.270 4-1.933 8-1.429 8 2.061 8 0.049 3*0.085 1 0.186 5 0.069 3

2.2 β多樣性分析

PCoA圖主要反映樣本組間的差異,兩點(diǎn)之間的距離越近,表示兩者的群落構(gòu)成差異越小。圖1的結(jié)果顯示,舜皇山母豬的5份樣品聚成一類,整體上明顯與二元雜母豬樣品分為了兩類(圖1A),說明兩個(gè)品系豬種之間的腸道微生物存在較大差異。進(jìn)一步用Venn圖分析兩個(gè)豬種共有的OTUs,結(jié)果顯示,331個(gè)OTUs為二元雜母豬特有,323個(gè)OTUs為舜皇山母豬特有(圖1B)。二元雜母豬的樣本之間距離較遠(yuǎn)且分布疏散,說明二元雜母豬樣本之間的微生物組成存在較大差異。舜皇山母豬的樣本之間距離相對較小,說明雖然舜皇山母豬樣本之間的微生物組成存在差異,但差異性低于二元雜母豬樣本。

圖1 腸道微生物β多樣性分析圖(A)PCoA分析圖;(B)基于OTUs的Venn圖。Fig.1 β-Diversity analysis of intestinal microbial flora(A)Diagram of PCoA;(B)Diagram of Venn based on OTUs.

2.3 腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)各樣本OTUs分類結(jié)果進(jìn)行物種注釋,結(jié)果顯示:舜皇山母豬和二元雜母豬糞便樣本中共檢測到9個(gè)門、11個(gè)綱、18個(gè)目、32個(gè)科和47個(gè)屬。

在細(xì)菌門分類水平上,舜皇山母豬和二元雜母豬的腸道微生物均以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)為主,但舜皇山母豬腸道中厚壁菌門(45.69%)與擬桿菌門(38.64%)的比例(F/B)高于二元雜母豬腸道中厚壁菌門(41.74%)與擬桿菌門(46.18%)的比例(圖2)。厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門在舜皇山母豬和二元雜母豬腸道中的平均總豐度分別為92.86%和94.05%。

圖2 門水平物種組成圖Fig.2 The microbial compositions of each sample at the level of phylum

合并同屬制圖,發(fā)現(xiàn)兩種品系豬腸道微生物群的優(yōu)勢種類在屬水平上存在一定的相似性,均以Muribaculaceae、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌(Eubacterium coprostanoligenes)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、密螺旋體屬(Treponema)、Christensenellaceae 等為主,但它們的相對豐度存在較明顯的差異(圖3)。普雷沃氏菌科在二元雜母豬樣本中的含量(14.00%)明顯高于舜皇山母豬樣本(9.39%),而密螺旋體屬在舜皇山母豬樣本中的含量(7.71%)明顯高于二元雜母豬樣本(4.82%)。此外,毛螺菌科(Lachnospiraceae)和鏈球菌屬(Streptococcus)在舜皇山母豬樣本中的含量顯著高于二元雜母豬樣本(P<0.050 0)。

圖3 屬水平物種組成圖在屬水平上未能準(zhǔn)確鑒定的,用其所隸屬的科描述。Fig.3 The microbial compositions of each sample at the level of genusThose uncertain species at the genus level are described at the family level.

2.4 腸道微生物的組間差異分析

利用Lefse進(jìn)一步分析兩個(gè)品種之間特異性細(xì)菌類群的富集情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):二元雜母豬腸道微生物中豐度差異顯著高于舜皇山母豬的物種有15種(P<0.050 0),包括普氏菌屬(Prevotella)、黃桿菌屬(Flavonifractor)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、小球菌屬(Subdoligranulum)、Holdemanella、Solobacterium、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、糞球菌屬(Coprococcus)、活潑瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、Ruminococcus gauvreauii、柯林斯氏菌屬(Collinsella)等(圖4)。

圖4 通過Lefse分析獲得的微生物區(qū)系的系統(tǒng)發(fā)育分布圖無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色,差異物種跟隨組(紅和綠)進(jìn)行著色,其中紅色為二元雜母豬腸道中的微生物,綠色為舜皇山母豬腸道中的微生物。Fig.4 Cladogram of microbiota phylogenetic distribution obtained from Lefse analysisThe species with no significant differences are uniformly colored in yellow,and those with significant differences are colored in red or green.Red and green show the microorganisms in the intestinal tracts of Landrace-Yorkshire binary sows and Shunhuangshan sows,respectively.

舜皇山母豬腸道微生物中豐度差異顯著高于二元雜母豬的物種有28種,包括毛螺菌科(Lachnospiraceae)、香味菌屬(Myroides)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、厭氧孢桿菌屬(Anaerosporobacter)、Dorea、Lachnoclostridium、氏菌屬(Roseburia)、產(chǎn)乙醇醋弧菌(Acetivibrio ethanolgignens)、產(chǎn)氫厭氧桿菌屬(Hydrogenoanaerobacterium)、顫螺菌屬(Oscillospira)、互營單胞菌屬(Syntrophomonas)、奎因氏菌屬(Quinella)、紅桿菌屬(Rhodobacteraceae)等(圖4)。此外,在舜皇山母豬豐度差異顯著的物種中,毛螺菌科的細(xì)菌有10種(圖5)。

圖5 舜皇山母豬與二元雜母豬毛螺旋菌科細(xì)菌的差異比較(A)毛螺菌科NK4B4;(B)毛螺菌科UCG_010;(C)產(chǎn)乙醇醋弧菌;(D)氏菌屬;(E)毛螺菌科XBB1006;(F)厭氧胞桿菌屬;(G)Dorea;(H)毛螺菌科UCG_002;(I)Lachnoclostridium 10;(J)毛螺菌科XPB1014。圖中實(shí)線為豐度信息的平均值,虛線為豐度信息的中值。Fig.5 Comparison of Lachnospiraceae bacteria between Shunhuangshan sows and Landrace-Yorkshire binary sows(A)Lachnospiraceae NK4B4 group;(B)Lachnospiraceae UCG_010;(C)Acetivibrio ethanolgignens;(D)Roseburia;(E)Lachnospiraceae XBB1006;(F)Anaerosporobacter;(G)Dorea;(H)Lachnospiraceae UCG_002;(I)Lachnoclostridium 10;(J)Lachnospiraceae XPB1014 group.The solid and the dotted lines in figures display the average value and median value of abundance information,respectively.

3 討論與結(jié)論

本研究采用高通量DNA測序方法,對同一養(yǎng)殖場的舜皇山母豬和二元雜母豬的腸道微生物進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):舜皇山母豬腸道微生物的物種豐度及菌群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性均高于二元雜母豬(表1),且兩個(gè)品種豬腸道的微生物差異較大(圖1)。相比于二元雜母豬,舜皇山母豬的飲食更為復(fù)雜和多樣,它能以當(dāng)?shù)氐膸资N牧草為食[1],而這種植食性的無抗喂養(yǎng)方式造就了舜皇山母豬腸道微生物群落的高度多樣性,這與Lau等[17]的報(bào)道一致,即雜食性的動物具有更多樣化的腸道微生物群。微生物多樣性是腸道健康的良好指標(biāo)[18],感染了流行性腹瀉病毒的豬和新生仔豬[19]、患有炎癥性腸病[20]和腹腔疾病[21]的人類,其腸道細(xì)菌的多樣性均較低。因此,舜皇山母豬抗病能力強(qiáng)的特性,可能也與其腸道微生物的高多樣性密切相關(guān)。

進(jìn)一步對兩個(gè)品種豬的腸道微生物群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,在門水平分析中發(fā)現(xiàn),同一養(yǎng)殖環(huán)境下的舜皇山母豬與二元雜母豬的腸道優(yōu)勢菌群具有一定的相似性,均以厚壁菌門(F)與擬桿菌門(B)為優(yōu)勢菌群,但兩者的豐度(F/B比例)存在明顯差異(圖2)。目前已報(bào)道的資料顯示,豬腸道微生物中F/B越高,其脂肪沉積速率也越高,體內(nèi)脂肪貯存則越多[22]。舜皇山母豬與二元雜母豬F/B的差異,與兩者分別為肉脂兼用型和瘦肉型的品質(zhì)特征一致,這進(jìn)一步說明豬群腸道微生物門水平豐度的差異與豬群的品種特征存在相關(guān)性。

屬水平分析結(jié)果顯示,舜皇山母豬和二元雜母豬腸道微生物的優(yōu)勢菌群在種類上存在一定的相似性,均以Muribaculaceae、普雷沃氏菌科、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌、瘤胃球菌、密螺旋體屬、Christensenellaceae等為主(圖3),這與已有文獻(xiàn)報(bào)道的豬腸道微生物的優(yōu)勢菌屬存在一定差異。文獻(xiàn)報(bào)道,杜長大雜交豬的腸道優(yōu)勢菌屬主要是乳酸菌、鏈球菌、瘤胃菌科和梭菌[8];相同飼養(yǎng)條件下,梅花豬和長白豬的腸道優(yōu)勢菌屬依次是普氏菌、乳酸菌、擬桿菌和鏈球菌[23]。上述文獻(xiàn)報(bào)道的優(yōu)勢菌均含有乳酸菌和鏈球菌,而在舜皇山母豬和二元雜母豬腸道中,乳酸菌和鏈球菌的豐度并不高(<1.20%),這種差異可能與飼養(yǎng)環(huán)境以及養(yǎng)殖方式有關(guān)。

此外,兩種品系豬腸道內(nèi)差異顯著的物種分析結(jié)果顯示,二元雜母豬有15種細(xì)菌的含量顯著高于舜皇山母豬,包括乳酸菌屬、糞球菌等益生菌,乳酸菌在宿主的消化吸收方面具有重要作用,這可能與二元雜母豬具有更快的生長速率有關(guān);舜皇山母豬有28種細(xì)菌的含量顯著高于二元雜母豬,其中包括毛螺菌科和鏈球菌屬細(xì)菌(圖4～5)。文獻(xiàn)報(bào)道,毛螺菌科細(xì)菌參與機(jī)體碳水化合物的代謝、細(xì)胞組分的合成和能量轉(zhuǎn)換等過程,具有降解纖維素和半纖維素的能力,同時(shí)也是丁酸鹽等短鏈脂肪酸的產(chǎn)生菌[24～25],因此,舜皇山母豬的優(yōu)良肉質(zhì)以及耐粗飼特性可能與腸道中富含毛螺菌科細(xì)菌有關(guān)。另一方面,毛螺菌是一類產(chǎn)丁酸菌,丁酸是腸道上皮細(xì)胞所偏好的能源物質(zhì),能夠調(diào)節(jié)腸道的能量代謝,具有抗炎、促進(jìn)黏液合成的功能;并且,丁酸可作為組蛋白乙?；敢种苿┱{(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)等[26～29]。由此推測,毛螺菌在舜皇山母豬的抗病能力方面可能也發(fā)揮了重要作用;文中發(fā)現(xiàn)的舜皇山母豬特有的毛螺菌,可能具有很高的益生菌開發(fā)潛力。此外,在消化道疾病相關(guān)的致病菌豐度的差異方面,雖然舜皇山母豬腸道內(nèi)含有的多種致病菌的豐度顯著高于二元雜母豬,特別是致病性鏈球菌屬的細(xì)菌,但舜皇山母豬反而顯示了相比于二元雜母豬更強(qiáng)的抗病能力,其胃腸道相關(guān)疾病發(fā)病率和死亡率均低于二元雜母豬,這可能與土豬整體腸道微生物群更高的多樣性、穩(wěn)定性和其他未知特殊抗病性菌群有關(guān),這也賦予了土豬抗病性強(qiáng)的品種特性。

綜上所述,即使在同一養(yǎng)殖環(huán)境下,不同品種豬腸道的微生物在門水平的豐度上存在顯著差異,而這種差異與豬群的品種特征存在相關(guān)性。此外,具有特定功能的腸道菌群,其種屬上的顯著差異與豬品種的肉質(zhì)、抗病性以及耐粗飼有較大相關(guān)性。舜皇山母豬腸道微生物群整體具有更高的多樣性、穩(wěn)定性,這賦予了它抗病性強(qiáng)、耐粗飼的品種特性,同時(shí)其又具備一些特有的潛在益生菌群資源,值得更深入的挖掘和研究。