星狀病毒感染免疫應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)展

汪 最 ，李 麗 ，劉 鵬 ，劉麗娜 ，汪 琛 ，楊文君 ，羅青平

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種小型、無囊膜RNA病毒，是嬰兒、免疫缺陷人群和老年人發(fā)生腸胃炎的主要病因，同時(shí)也會導(dǎo)致哺乳動物和禽類患病。星狀病毒可以通過口-糞、接觸、受污染的食物或水傳播[1]。人類患者通常會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、腹痛和發(fā)燒等癥狀，偶爾也有一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的報(bào)告，如急性弛緩性麻痹、腦膜炎和腦炎[2]。動物感染多數(shù)表現(xiàn)為腸胃炎、腎炎，少數(shù)雞、鵝等[3]出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀，以及牛、貂、鵝等[3-4]神經(jīng)癥狀。星狀病毒可以跨物種傳播且極易發(fā)生重組現(xiàn)象。因此研究星狀病毒對臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有重大意義，然而目前為止其依然是研究最少的腸道RNA病毒[5]，所以綜述星狀病毒感染的先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答以及星狀病毒如何逃避免疫系統(tǒng)是很有必要的。

1 星狀病毒感染

星狀病毒主要經(jīng)過糞口途徑感染宿主，進(jìn)入機(jī)體后與腸上皮細(xì)胞上的某個未知受體結(jié)合[6]，并通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[7]。病毒在核內(nèi)體酸化和成熟的地方發(fā)生脫衣殼[7]。研究表明病毒與細(xì)胞表面結(jié)合的時(shí)間約為10 min，病毒脫殼大約需要130 min[7]。在病毒脫殼后，正鏈RNA會翻譯出兩個非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a和ORF1b，而這兩個多聚蛋白又會被裂解成轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。負(fù)鏈RNA主要通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組和亞基因組RNA，其結(jié)構(gòu)蛋白ORF2就是由亞基因組RNA編碼表達(dá)[9]。有學(xué)者在雙膜上觀察到星狀病毒粒子，提示這里可能是其復(fù)制和裝配的場所。星狀病毒完成裝配后，子代病毒粒子會通過caspase激活的非裂解機(jī)制釋放到細(xì)胞外[10]，而這種機(jī)制可以通過eIF2α-ATF4-CHOP通路來激活[11]（圖1）。

圖1 星狀病毒感染、免疫逃逸以及宿主天然免疫應(yīng)答模式圖Fig.1 Patterns of astrovirus infection,immune escape and host innate immunity

盡管星狀病毒被認(rèn)為是胃腸型病原，但其病毒RNA已在多個非腸道器官和組織中檢出（表1）。然而，通過原位分子雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)這些組織均呈陰性，表明該病毒只在腸道內(nèi)復(fù)制。原因可能是星狀病毒需要通過衣殼蛋白改變腸上皮細(xì)胞屏障通透性，破壞腸道緊密連接，使表面受體暴露，從而達(dá)到侵入的目的，但仍然需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)這個初始結(jié)合步驟。

表1 星狀病毒的組織分布Table 1 Tissue distribution of AstV

2 天然免疫對星狀病毒感染的作用

2.1 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 天然免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，可以高效、迅速抑制病毒感染并激活適應(yīng)性免疫。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）長期以來被認(rèn)為是天然免疫的關(guān)鍵介質(zhì)[12]。它在抗癌、抗寄生蟲、抗菌和抗病毒反應(yīng)中都具有重要的作用。研究顯示，星狀病毒感染火雞的腸上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和雞巨噬細(xì)胞系HD11均會刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)及其隨后免疫介質(zhì)NO的增加[13]。使用iNOS抑制劑預(yù)處理后，再感染星狀病毒，結(jié)果火雞體內(nèi)和體外的病毒滴度都顯著上調(diào)[13]。相反，使用亞硝酸鹽預(yù)處理的星狀病毒去感染火雞，則會顯著降低其病毒復(fù)制能力[12]。這些數(shù)據(jù)表明iNOS可以通過產(chǎn)生NO來抑制星狀病毒的復(fù)制，但NO是如何抑制星狀病毒的復(fù)制還需要進(jìn)一步研究。

2.2 Ⅰ型干擾素

2.2.1 抑制病毒復(fù)制 許多腸道病毒的復(fù)制和傳播依賴于腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)免疫因子，特別是Ⅰ型干擾素。如輪狀病毒利用腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素促進(jìn)病毒的早期復(fù)制。隨著細(xì)胞培養(yǎng)體系和動物模型的建立，人們才逐步了解Ⅰ型干擾素在AstV感染期間的作用。Guix等[14]發(fā)現(xiàn)HAstV感染可以誘導(dǎo)輕微和延遲性的IFN-β上調(diào)，接著Marvin等[15]發(fā)現(xiàn)腸癌細(xì)胞系Caco2感染HAstV 24 hpi，IFN-β的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都發(fā)生上調(diào)，而用UV滅活的病毒和桿狀病毒表達(dá)的衣殼蛋白刺激Caco2并沒有這種現(xiàn)象，表明星狀病毒的復(fù)制是誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵。為了確定IFN-I是否影響星狀病毒的感染和復(fù)制，用HAstV分別感染外源IFN-α和IFN-β預(yù)處理的Caco2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)病毒RNA都顯著降低，而用干擾素中和抗體預(yù)處理后，病毒 滴度增加了2.5倍[14-15]。通過抑制干擾素調(diào)控因子3（interferon regulatory factor 3,IRF3）上游激酶TBK1時(shí)，病毒RNA和傳染性病毒顆粒增加了2倍[14]。這些結(jié)果均提示IFN-I在體外能抑制星狀病毒的復(fù)制。研究還發(fā)現(xiàn)外源IFN-β預(yù)處理的Caco2細(xì)胞，感染星狀病毒8 h和16 h時(shí)正鏈RNA合成受到明顯抑制，而1 h和4 h沒有觀察到這種現(xiàn)象[15]，表明IFN-I并不作用于星狀病毒的粘附、侵襲階段，而是通過阻礙正鏈RNA的合成來抑制星狀病毒復(fù)制。此外，干擾素受體敲除小鼠IFNaR-/-與野生型小鼠分別感染MuAstV，發(fā)現(xiàn)野生組53 dpi糞便中已停止排毒，而敲除組53 dpi排毒量依然處于較高水平[15]，這表明在體內(nèi)IFN-I也能對星狀病毒起到清除作用。與I型IFN信號通路類似，信號轉(zhuǎn)換器和激活因子1（STAT1）在限制星狀病毒感染方面同樣發(fā)揮了作用，STAT1基因敲除小鼠（STAT1-/-）感染MuAstV 14 d后，脾臟和腸系淋巴結(jié)病毒載量是野生型小鼠的10倍[16]。猜測IFN-I免疫應(yīng)答激活STAT1通路，進(jìn)而激活了抗病毒蛋白轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抑制星狀病毒復(fù)制的目的。

2.2.2 保護(hù)屏障通透性 腸上皮細(xì)胞可以提供一個屏障，以調(diào)節(jié)溶質(zhì)和病原體進(jìn)出體內(nèi)，如果調(diào)節(jié)不當(dāng)，就可能導(dǎo)致機(jī)體腹瀉，而星狀病毒感染會增加腸上皮細(xì)胞的屏障通透性。研究發(fā)現(xiàn)體外IFN-β預(yù)處理Caco2細(xì)胞可以減少HAstV-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的跨上皮電阻（transepithelial electrical resistance,TER），并降低惰性染料flux從細(xì)胞單層頂端向基底外側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，小鼠感染MuAstV 3 d后，服用 FITC標(biāo)記的葡聚糖，3 h后測血清熒光強(qiáng)度，結(jié)果IFNaR-/-小鼠檢測的熒光強(qiáng)度比正常小鼠組高[15]。這些數(shù)據(jù)表明Ⅰ型IFN體內(nèi)體外均能對星狀病毒引起的腸上皮屏障通透性變大問題起到緩解作用。

3 適應(yīng)性免疫對星狀病毒感染的作用

適應(yīng)性免疫發(fā)生在天然免疫之后，是淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下對抗原做出的特異性反應(yīng)。適應(yīng)性免疫反應(yīng)包括兩個部分：體液免疫和細(xì)胞免疫。適應(yīng)性免疫在控 制星狀病毒感染過程中起到重要作用。

3.1 體液免疫 體液免疫是通過產(chǎn)生特異性抗體來達(dá)到保護(hù)目的的免疫機(jī)制。血清學(xué)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)健康成年人體內(nèi)都含有針對最流行HAstV血清型的抗體。這種特異性抗體可以通過母嬰途徑傳播給初生兒，母源抗體會持續(xù)大概6至8個月[17]。這與早期人類志愿者的臨床研究結(jié)果一致，大多數(shù)沒有或僅有輕微臨床癥狀的受試者在受試前體內(nèi)已產(chǎn)生了抗星狀病毒抗體。相反，表現(xiàn)出嚴(yán)重疾病的受試者受試前體內(nèi)沒有抗星狀病毒抗體[18]。此外，體液免疫在動物體內(nèi)也發(fā)揮了重要作用，研究發(fā)現(xiàn)雛鵝感染星狀病毒后的康復(fù)血清可以有效中和星狀病毒，血清中和效價(jià)達(dá)到1∶ 3200，而健康鵝血清未表現(xiàn)出任何中和活性[19]。同時(shí)，雞群感染星狀病毒后的康復(fù)血清也能與病毒發(fā)生中和反應(yīng)，中和效價(jià)達(dá)到1∶6400[20]。星狀病毒衣殼蛋白ORF2的特異性抗體在病毒中和反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用[21]。雖然還不清楚其具體中和機(jī)制，但ORF2蛋白的免疫源性極好，免疫重組桿狀病毒表達(dá)ORF2蛋白后，可有效刺激種鵝產(chǎn)生主動免疫、雛鵝產(chǎn)生被動免疫，攻毒保護(hù)率達(dá)到100%[22]。由于星狀病毒可以跨種傳播，宿主也可以產(chǎn)生特異性抗體對抗其他物種的星狀病毒。例如，與火雞密切接觸的人會產(chǎn)生抗TAstV的抗體[23]。雖然特異性抗體可以與星狀病毒發(fā)生中和反應(yīng)，但星狀病毒的血清型繁多，有必要進(jìn)一步評估所有血清型之間是否存在交叉反應(yīng)和交叉保護(hù)。

3.2 細(xì)胞免疫 研究發(fā)現(xiàn)，火雞在感染TAstV-2 21 h后，可以檢測到低水平的血清IgG和膽汁IgA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抗體不能與抗原發(fā)生中和反應(yīng)，且二次感染時(shí)也不能提供免疫保護(hù)[24]。此外，將感染組與對照組比，T細(xì)胞中CD4+/CD8+的比率在5、9和16 dpi時(shí)并未發(fā)生變化，這表明TAstV-2感染是一個較差的適應(yīng)性免疫反應(yīng)誘導(dǎo)因子[24]。與火雞感染模型不同，小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫是控制星狀病毒感染的關(guān)鍵。Mombaerts等[25]使用MuAstV感染重組激活基因1（rag1）基因敲除小鼠（Rag1-/-），其缺乏成熟的B細(xì)胞和T細(xì)胞，與野生型小鼠比，Rag1-/-小鼠的糞便和腸道中具有更高的病毒載量，其腎臟、肝臟和腸系膜淋巴結(jié)均能檢出星狀病毒，而野生型小鼠這些器官的檢測結(jié)果呈陰性，表明野生型小鼠感染和傳播星狀病毒受到B和T細(xì)胞的限制。此外，Molberg等[26]從星狀病毒感染的組織學(xué)上正常腸組織中檢測到了特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞。所以，有理由推測T細(xì)胞在星狀病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

越來越多的報(bào)道顯示，星狀病毒可以感染免疫缺陷患者腸道外組織。部分星狀病毒分離株已被確定為免疫缺陷患者腦炎的潛在病因。有研究在死于腦炎兒童的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了星狀病毒，并認(rèn)為是骨髓或造血干細(xì)胞移植后引起腦炎的病因[27]。此外，星狀病毒也在嚴(yán)重免疫缺陷患者鼻咽分泌物、血清和血漿中檢測到[28]。所以可以推測是免疫系統(tǒng)限制了星狀病毒向其他組織傳播，那么免疫系統(tǒng)是如何限制星狀病毒向腸外組織的傳播也許將成為未來研究的重要問題。

4 星狀病毒感染對腸道菌群的影響

大量證據(jù)表明腸道病毒可以通過選擇細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物來促進(jìn)其感染。那么腸道菌群在星狀病毒感染中扮演什么角色呢？研究發(fā)現(xiàn)兒童癌癥患者中的星狀病毒感染率很高，其中大多數(shù)（＞89%）正在接受抗菌治療[29]。此外，在一項(xiàng)對5歲以下患有急性和持續(xù)性腹瀉的兒童的研究中也發(fā)現(xiàn)，未服用抗生素的患者，星狀病毒的檢出率較低[30]。由于其他因素影響，這些數(shù)據(jù)并不足以證明菌群在星狀病毒感染過程中所起的作用。最近建立的小鼠星狀病毒模型對于探索星狀病毒與腸道菌群之間的因果關(guān)系機(jī)制至關(guān)重要。Valerie等[31]發(fā)現(xiàn)小鼠在感染星狀病毒后0、9和21 d引起了腸道菌群組成和多樣性的變化。在感染高峰期（第9 d），感染小鼠的腸道菌群多樣性降到最低。同時(shí)，梭狀芽孢桿菌XVⅢ的數(shù)量顯著增加，直到病毒水平開始下降的第21 d其數(shù)量也保持在一個較高水平[31]。研究表明腸道菌群與宿主的免疫應(yīng)答有密切關(guān)系，它能夠刺激腸粘膜的杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，保護(hù)黏液層的完整性以及維持腸道屏障功能，所以腸道菌群很可能通過刺激宿主的免疫應(yīng)答來幫助宿主抵御星狀病毒感染。然而，目前還不清楚星狀病毒是如何導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化，以及這種變化對宿主的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的影響。因此，以后腸道菌群、宿主和星狀病毒三者 之間的相互作用將是研究的熱點(diǎn)。

5 免疫逃逸

5.1 抑制補(bǔ)體系統(tǒng)識別 星狀病毒可以通過阻止補(bǔ)體激活從而逃避免疫系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的重要組成部分，可以識別并清除各種致病菌和病毒。補(bǔ)體系統(tǒng)有三條激活途徑：經(jīng)典激活（classical pathway,CP）、凝集素激活（lectin pathway,LP）和替代激活（alternative pathway,AP）。研究發(fā)現(xiàn)星狀病毒的衣殼蛋白能夠與關(guān)鍵引發(fā)分子C1q和MBL結(jié)合，抑制經(jīng)典途徑和凝集素途徑，阻止下游信號通路激活[32]。由于補(bǔ)體的一個關(guān)鍵作用是引發(fā)炎癥反應(yīng)，而星狀病毒不引起炎癥反應(yīng)，提示星狀病毒抑制補(bǔ)體活化是逃避免疫系統(tǒng)和抑制炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素。此外，Tam等[33]發(fā)現(xiàn)星狀病毒感染后補(bǔ)體介導(dǎo)的NF-κB活化水平較低，這表明星狀病毒具有逃避補(bǔ)體因子C3檢測的方法。補(bǔ)體因子C3可以激活了IRF3的信號通路，從而大量產(chǎn)生IFN-β。這可能就是Guix和Marvin等在感染后期檢測I型干擾素水平較低的原因。未來可以通過構(gòu)建不與補(bǔ)體分子結(jié)合的星狀病毒突變體去研究感染期間星狀病毒抑制補(bǔ)體活化的機(jī)制。

5.2 降低巨噬細(xì)胞殺菌能力 星狀病毒感染能夠抑制免疫反應(yīng)，使宿主更容易受到隨后的感染。體外實(shí)驗(yàn)表明，星狀病毒感染火雞巨噬細(xì)胞降低了巨噬細(xì)胞的生存能力以及隨后對大腸桿菌的胞內(nèi)殺傷能力[34]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，從感染TAstV的火雞中分離的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)殺菌能力變?nèi)?，同時(shí)巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子IL-1 和IL-6活性降低，從而使宿主更容易受到繼發(fā)性細(xì)菌感染[34]。此外，感染星狀病毒的火雞血清中能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的免疫抑制細(xì)胞因子（transforming growth factoro β,TGF-β）[34]，推測這可能是感染火雞只出現(xiàn)輕微的組織學(xué)病變的原因。然而TGF-β對星狀病毒復(fù)制的影響以及在免疫應(yīng)答中的作用還有待研究。

5.3 利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)復(fù)制 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome pathway,UPS）是細(xì)胞的主要降解系統(tǒng)。該系統(tǒng)的主要作用包括錯誤折疊/受損蛋白的降解以及調(diào)控與控制細(xì)胞周期進(jìn)展、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄、免疫反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白水平。其主要由蛋白酶體和泛素蛋白組成。有證據(jù)表明蛋白酶體抑制劑能夠顯著降低了星狀病毒病毒RNA和病毒衣殼蛋白合成[35]；同樣，化學(xué)抑制劑或RNAi對泛素蛋白的抑制也顯著降低了子代病毒的產(chǎn)生以及衣殼蛋白合成[35]。UPS是星狀病毒有效復(fù)制所必需的，最有可能參與合成星狀病毒病毒gRNA和sgRNA[35]。但星狀病毒是如何通過UPS來抑制宿主體內(nèi)的抗病毒因子水平以及固有的抗病毒信號通路還需要進(jìn)一步的研究。

6 研究展望

綜上所述，雖然我們對星狀病毒感染的免疫應(yīng)答機(jī)制有了一定了解，但還需要進(jìn)一步的研究來描述介導(dǎo)星狀病毒感染免疫應(yīng)答的細(xì)胞和分子因素。為了治療和控制星狀病毒引起的疾病，未來可以從以下幾個方面研究：了解星狀病毒抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制；干擾素如何保護(hù)腸道的屏障通透性以及掌握星狀病毒不同血清型之間的交叉免疫保護(hù)情況。此外，近年來腸道菌群的抗病毒、抗癌作用成為了研究熱點(diǎn)，充分了解星狀病毒、宿主和腸道菌群三者之間的關(guān)系，有利于將來通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)來治療甚至預(yù)防星狀病毒感染。