麥冬水提物對貓腎細胞的影響研究

陳 融 ，陳 凱 ，張賽奇 ，劉 博 ，王 米 ，張可煜 ，郭利偉

（1.長江大學(xué)，荊州 434023；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物及制劑學(xué)重點實驗室，上海 200241；3.上海比瑞吉寵物用品股份有限公司，上海 201506）

隨著國民生活水平的提高，越來越多的人會選擇飼養(yǎng)各種寵物，如貓、狗。不同于普通畜禽，寵物是人類的伴侶動物，往往被當做家庭成員，寵物的身體健康備受重視。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，寵物主人對寵物的重視程度不斷提高，且大都愿意為其寵物貓購買優(yōu)質(zhì)的貓糧而花費更多資金[1]。隨之會帶動如寵物食品等行業(yè)的迅速發(fā)展[2-3]。寵物食品與寵物的健康成長息息相關(guān)，若飼養(yǎng)不當，極易引起寵物患上肥胖癥、皮膚病、泌尿道疾病或糖尿病等。相反，從食物入手也可以提高寵物免疫力，減少患病幾率。

近些年，將中草藥添加在飼料中療效顯著，且已得到廣泛應(yīng)用[4-6]。中草藥無副作用，不易產(chǎn)生抗藥性，尤其在治療寵物慢性疾病上也比西藥更加溫和。另外，它還可以通過日常攝入提高動物的免疫力，起到預(yù)防疾病的效果。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，80%以上的寵物醫(yī)生和寵物主人都對將中獸藥和針灸用于寵物表示認可[1]。但許多兼?zhèn)浔＝『椭委煹闹胁菟幎紱]有相關(guān)實驗研究，缺乏安全性評價，導(dǎo)致無法進行下一步臨床應(yīng)用。

麥冬是一味保健與治療皆備的中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱其“久服輕身，不老不饑”，列為養(yǎng)陰潤肺的上品。麥冬來源于百合科植物麥冬（Ophiopogon japonicus（Thumb.） Ker-Gawl.）的干燥塊根，內(nèi)含多種甾體皂苷、β-谷固醇、黃酮和多糖等，有養(yǎng)胃、生津、潤肺、止咳的功效，也可治心煩、便秘?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血糖等作用[7-9]也被廣泛應(yīng)用于飼料研發(fā)中。但是，關(guān)于將麥冬添加在寵物食品中的安全性還需進一步驗證，而F81為貓的腎臟細胞，可作為體外模型研究使用。在本文中，筆者從細胞的形態(tài)、增殖、凋亡和周期四個方面研究了麥冬水提物對F81細胞的影響，希望為麥冬在貓食品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM（含酚紅）購自賽默飛世爾科技；PBS（pH7.2，不含Ca2+、Mg2+）、胎牛血清、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司；噻唑藍（MTT）購自Sigma公司；細胞周期與Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物試劑公司；二甲基亞砜購自江蘇宜興化學(xué)工程公司；所有的化學(xué)試劑均是分析純；F81細胞株由中國科學(xué)院細胞庫提供。細胞培養(yǎng)液為含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。

1.2 麥冬水提物制備 參照文獻[10]，稱取定量的麥冬加水浸泡，水煮沸改小火，重復(fù)兩次，所得液體合并后過濾，濾液濃縮，噴霧干燥，即得麥冬水提取物。使用前用完全培養(yǎng)液溶解并用水相濾膜（0.22 μm）過濾除菌，儲存于4℃。

1.3 細胞活力檢測—MTT法 參照文獻[11]，取對數(shù)生長期的F81細胞，稀釋濃度為4×104個/mL，取100 μL接種于96孔板，邊緣孔加等量ddH2O。24 h后加不同濃度的麥冬水提物（濃度為3.19 μg/ mL ～8000 μg/mL），48 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL。4 h后棄去孔內(nèi)液，加入二甲亞砜150 μL，輕輕震蕩10 min，測定波長為570 nm時吸光度值，參比波長為630 nm，每項試驗重復(fù) 3 次。

1.4 細胞周期檢測—PI單染法 取對數(shù)生長期細胞，稀釋至5×105個/mL，以2 mL/孔接種于6孔板，24 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入麥冬水提物（濃度為3.91 μg/mL～62.50 μg/mL）每個濃度重復(fù)3孔，48 h后收集細胞，70%乙醇固定過夜，加500 μL的碘化丙啶染色液，37℃避光溫浴30 min，隨后冰浴避光放置，24 h內(nèi)完成流式檢測。

1.5 細胞凋亡檢測—Annexin V/PI雙染法 取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/孔接種至6孔板，24 h更換藥物，操作方法同1.4。48 h后按試劑盒說明書操作，在染色后2 h內(nèi)完成流式檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 細胞周期數(shù)據(jù)使用軟件ModFit LT分析；細胞凋亡數(shù)據(jù)使用軟件FlowJo V10分析；用SPSS24.0對所有的實驗結(jié)果進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準誤”表示，當P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 正常的F81細胞是貼壁生長，形態(tài)為梭形或卵圓形。對照組和不同濃度給藥組的細胞生長狀態(tài)及伸展性良好，并未隨用藥濃度變化而出現(xiàn)明顯的細胞皺縮、裂解的現(xiàn)象（圖1）。表明適當濃度的麥冬水提物對F81細胞形態(tài)未產(chǎn)生影響。

圖1 不同濃度的麥冬水提取物對F81細胞形態(tài)學(xué)的影響（×10）Fig.1 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on the morphology of F81 cells （×10）

2.2 細胞增殖 由圖2可知，隨著麥冬水提物濃度從3.91 μg/mL升高到8000 μg/mL，F(xiàn)81細胞相對增殖率先升高后略有降低，但均高于100 %。在給定的濃度范圍內(nèi)（3.91～8000 μg/mL）對細胞增殖沒有影響。從本研究結(jié)果來看，麥冬水提物對體外培養(yǎng)的腎臟細胞是安全的。

圖2 不同濃度的麥冬水提物對貓腎細胞（F81）增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on the increment cat kidney cells（F81） in cats

2.3 細胞周期 在細胞周期（G0、G1、S、G2、M）的各個時期，DNA含量呈現(xiàn)周期性的變化。碘化丙啶（PI）與雙鏈DNA可結(jié)合產(chǎn)生熒光，通過流式細胞儀測得DNA含量，得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出GO/G1%、S%、G2/M%。另外，細胞周期G2期、S期、M期均反映了細胞的增殖活性，故通常用G2/M%+S%可以反映細胞的增殖能力。并通過比較相應(yīng)細胞的不同周期差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，說明藥物釋是否對細胞造成周期阻。結(jié)合圖3及表1可知，各濃度用藥組細胞的G0/G1、S、G2/M期差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，故可推測不存在細胞阻滯。結(jié)合表1可知，隨工作濃度升高，G2/M%+S%比值呈現(xiàn)上升趨勢，即細胞的增殖能力提升。并在濃度為62.5 μg/mL時達到最高，故此時細胞增殖能力也最強。

圖3 不同濃度的麥冬水提取物對F81細胞周期的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on F81 cell cycle

表1 不同濃度的麥冬水提取物對F81細胞周期的影響Table 1 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on F81 cell cycle

2.4 細胞凋亡 Annexin V-FITC和PI兩種染液通過細胞膜內(nèi)外兩側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，可以區(qū)別細胞的不同凋亡狀態(tài)。經(jīng)流式細胞儀檢測所得圖中，左下象限表示活細胞（Annexin V-/PI-）；右下象限表示期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）；右上象限表示晚期凋亡/壞死細胞（Annexin V+/PI-）。結(jié)合圖4、表2可知，與對照組相比，隨著麥冬水提物工作濃度的升高，早期凋亡細胞占比和中晚期凋亡的細胞占比均有升高，高于對照組的細胞占比，但統(tǒng)計學(xué)檢驗證實差異均不顯著。因此，麥冬水提物對F81細胞凋亡無顯著影響。

圖4 不同濃度的麥冬水提取物對F81細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on apoptosis of F81 cells

表2 不同濃度的麥冬水提取物對F81細胞凋亡的影響Table 2 Effects of different concentrations of Ophiopogon japonicus water extract on apoptosis of F81 cells

3 討論

作為寵物市場中極為重要的一環(huán)，寵物食品行業(yè)的發(fā)展極快，在2015年末，國內(nèi)的銷售收入已達245億元[12]。為了保證我國此行業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，除了完善寵物食品行業(yè)的標準規(guī)范，優(yōu)化寵物食品質(zhì)量也十分重要。麥冬是我國的傳統(tǒng)中藥，資源豐富，價格低廉，副作用低，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，是許多中成藥和保健食品的原料[13]。麥冬水提物提取方法簡單，易推廣。研究發(fā)現(xiàn)其可延長缺氧小鼠的存活時間，且1萬以下分子量組分具有極顯著性，為抗心肌缺血的主要活性部位[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)麥冬水提物從 3.91 μg/mL到8000 μg/mL的濃度，貓腎細胞相對增殖率隨濃度升高而降低（但均高于100%），說明F81對麥冬水提物有一定的量效關(guān)系，其中在1000 μg/mL時促進F81細胞增值作用效果最好。為了進一步研究麥冬水提物對F81細胞的影響，我們對細胞的形態(tài)、周期和凋亡等方面進行觀察和檢測。發(fā)現(xiàn)麥冬水提物的濃度從3.91 μg/mL升高到62.5 μg/mL，對F81細胞形態(tài)無明顯影響；而細胞周期和凋亡率與對照組比無明顯差異，表明麥冬水提物在該濃度范圍內(nèi)對F81無毒性作用。這與葛樂樂[15]將其用于人肝癌細胞系HepG2時所得的研究結(jié)果一致。

細胞周期檢測表明，麥冬水提物在62.5 μg/mL的濃度，細胞的增殖力稍強于其他濃度和對照組，這可能是通過促進S期到G2/M期的過程而達到?？紤]到在MTT檢測中，麥冬水提物在1000 μg/mL時，細胞的相對增殖率達到最高，推測與此機制有關(guān)。在本研究中，麥冬水提物被證實在一定濃度范圍內(nèi)對F81細胞無毒性作用，而具有益處。

綜上所述，通過麥冬水提物在體外對F81細胞的生長、形態(tài)、凋亡和周期作用考察，可以看出，麥冬水提物對腎細胞無抑制作用，證明了該物質(zhì)在實驗濃度范圍內(nèi)體外無毒性作用；本研究首次對麥冬水提物對貓的體外安全性初步研究提供了參考，為麥冬水提物在貓食品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。