細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TSP8基因在其不同發(fā)育階段的差異表達(dá)及生物信息學(xué)分析

王煒燁,王云菲，陸寶燕，馬 勛，張艷艷，孟季蒙，王正榮，薄新文

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，石河子 832000）

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus granulosus,E.g）是包蟲(chóng)?。╤ydatidosis）的主要病原，是造成我國(guó)西部地區(qū)“因病致貧，因病返貧”的主要原因之一[1-3]。我國(guó)作為包蟲(chóng)病的高發(fā)地區(qū)，包蟲(chóng)病對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)造成的危害不計(jì)其數(shù)，給我國(guó)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的群眾造成了生命健康的巨大威脅[4]。

由于包蟲(chóng)病的巨大危害，其免疫預(yù)防已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)，如何篩選到高效的免疫抗原是其關(guān)鍵前提[5-7]。四跨膜蛋白（tetraspanin,TSP）作為質(zhì)膜蛋白超家族的一員，其一些成員已經(jīng)被證明可作為泡狀棘球蚴?。╝lveolar echinococcosis,AE）、血吸蟲(chóng)?。╯chistosomiasis）、華支睪吸蟲(chóng)病（clonorchiasis）等的候選疫苗靶標(biāo)[8-13]。雖然目前四跨膜蛋白已經(jīng)被證實(shí)在廣泛的細(xì)胞活動(dòng)以及病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但關(guān)于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)四跨膜蛋白家族成員的研究報(bào)道仍較少[14-17]。

四跨膜蛋白家族作為一類在多種生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的小分子跨膜蛋白家族，分子量多為20～30 kDa，其包含39個(gè)家族成員，有33個(gè)家族成員已經(jīng)確認(rèn)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，包括TSP1-TSP33家族成員[18]。本研究旨在通過(guò)對(duì)TSP家族TSP8基因進(jìn)行克隆及分子特性初步分析，為進(jìn)一步研究細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)候選免疫診斷抗原奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴、包囊及成蟲(chóng) 細(xì)粒 棘球絳蟲(chóng)原頭蚴、包囊均采自新疆石河子市石河子鎮(zhèn)沙依巴克村牛羊定點(diǎn)屠宰廠，成蟲(chóng)為由省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 質(zhì)粒、菌種及試劑 菌株 Escherichia coli DH5α、PCR反應(yīng)試劑、pMD19-T載體和DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司，RN A提取試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴、成蟲(chóng)的RNA。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)在GenBank上查找到的TSP基因相關(guān)序列，使用采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小為669 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。TSP8上游引物：5′-ATGAACAACTCACTCTCAGTTAAC-3′；TSP8下游引物：5′-TTACACCGGCTCATTTT TATTC-3′。

1.5 TSP8基因的克隆 以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴cDNA為模板進(jìn)行TSP8基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物，于1.5%瓊脂糖凝膠130 V、60 A電泳30 min，在凝膠成像儀中觀察電泳條帶。膠回收目的片段，并連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5α，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆的菌株送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.6 TSP8基因的生物信息學(xué)分析 利用Prot-Param在線軟件分析TSP8基因編碼蛋白的氨基酸序列及理化性質(zhì)；利用SOPMA程序預(yù)測(cè)TSP8蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)得到TSP8蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，利用生物分析在線軟件（ncbi.nlm.nih.gov/cdd、ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)TSP8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和開(kāi)放閱讀框，利用DNAStar軟件預(yù)測(cè)TSP8蛋白的親水性、可塑性、表面可及性及抗原表位。利用SignaIP 4.1 Server預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜區(qū)及信號(hào)肽等。

1.7 TSP8基因在蟲(chóng)體不同發(fā)育階段的差異分析 以細(xì)粒棘球絳 蟲(chóng)原頭蚴、包囊以及成蟲(chóng)cDNA為模板對(duì)TSP8基因進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。上游引物：5′-gagatggactgttgtggtgc-3′，下游引物：5′-ttatggcgcctacttcgagt-3′。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Mastermix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用相對(duì)比較△Ct（Qr=2-△△Ct）法對(duì)TSP8基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴、包囊以及成蟲(chóng)中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行分析。

1.8 TSP8基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS17.0軟件以及Graoh Pad5.0對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算其各組之間的相對(duì)表達(dá)量，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TSP8基因的克隆 對(duì)TSP8基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增可見(jiàn)一條約669 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1），并且測(cè)序結(jié)果與目的序列一致。

圖1 TSP8基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of TSP8 gene

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì) TSP8基因cDNA全長(zhǎng)669 bp，編碼222個(gè)氨基酸，分子式為C1104H1751N271O302S17，分子質(zhì)量為24 kDa，理論等電點(diǎn)（PI）為5.06，預(yù)測(cè)含有 2個(gè)潛在的N端糖基化位點(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（圖2）；半衰期：30 h（mammalian reticulocytes）＞20 h（yeast）＞10 h（Escherichia coli），不穩(wěn)定指數(shù)為36.67，為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)120.36，親水性為0.767。

圖2 TSP8基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Deduced amino acids sequence of TSP8 cDNA

2.2.2 TSP8二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用SOMPA程序預(yù)測(cè)TSP8蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。由圖3可知TSP8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含59.01%的α-螺旋，22.52%的無(wú)規(guī)則卷曲，12.61%的延伸鏈結(jié)構(gòu)和5.86%的β-轉(zhuǎn)角。

圖3 SOMPA程序預(yù)測(cè)TSP8的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 TSP8 secondary structure predicted by SOMPA software

2.2.3 TSP8的跨膜區(qū)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 使用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)TSP8的跨膜結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖4。TSP8可形成4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，由N-C端分別為13-35、50-72、84-106、194-216。以SWISSMODEL預(yù)測(cè)得到TSP8蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，見(jiàn)圖5。

圖4 TSP8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.4 Transmembrane domain of TSP8

圖5 TSP8蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of TSP8 protein

2.2.4 TSP8的結(jié)構(gòu)域和ORF分析 利用在線網(wǎng)站（ncbi.nlm.nih.gov/cdd和ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)TSP8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和開(kāi)放閱讀框，結(jié)果表明，該蛋白屬于跨膜蛋白家族（圖6），該蛋白具有5個(gè)開(kāi)放閱讀框（圖7）。

圖6 TSP8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved domains of TSP8 protein

圖7 TSP8蛋白的開(kāi)放閱讀框Fig.7 ORFs of TSP8 protein

2.2.5 TSP8抗原表位預(yù)測(cè) 利用DNAS tar軟件中對(duì)該蛋白的抗原性指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，TSP8蛋白含有的主要抗原區(qū)域在1-3、5-6、37-45、46-48、69-70、72-73、75-79、104-114、124-134、143-171、179-181、182-192、216-222個(gè)氨基酸附近（圖9）。

2.2.6 TSP8 B抗原預(yù)測(cè) 通過(guò)IEDB在線軟件對(duì)TSP8蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TSP8蛋白有4個(gè)B細(xì)胞表位（表1）。

表1 生物信息學(xué)軟件IEDB預(yù)測(cè)的TSP8的B細(xì)胞抗原表位Table 1 Analysis of the B cell epitopes of TSP8 protein using IEDB online prediction software

2.2.7 TSP8蛋白的表面可及性分析 通過(guò)DNAStar軟件對(duì)TSP8蛋白的表面可及性進(jìn)行分析（圖8），結(jié)果表明，TSP8的表面可及性呈現(xiàn)在1-2、39-44、74-76、107-113、115-116、125-132、133-134、141-144、154-160、166-168、181-189、216-222位氨基酸附近。

2.2.8 TSP8蛋白的親水性 用DNAStar和Protscale對(duì)TSP11蛋白進(jìn)行親水性分析，結(jié)果顯示，TSP8蛋白具有兩親性，總體上為親水性蛋白，親水性區(qū)域主要分布在1-3、4-5、39-46、74-77、106-107、108-117、125-135、140-141、142-171、182-190、217-222位氨基酸附近（圖8、9）。

圖8 TSP8蛋白的親水性、柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性參數(shù)Fig.8 The hydrophilicity plot-kyte-doolittle of VASA protein,flexible regions-karplus-schulz,antigenic indexjameson-wolf and surface probability plot-emini

2.2.9 TSP8蛋白的柔性區(qū)域 用DNAStar對(duì)TSP11蛋白進(jìn)行柔性區(qū)域分析。結(jié)果顯示，TSP11蛋白柔性區(qū)域主要分布在1-6、39-48、69-73、77-80、85-88、107-111、116-119、129-133、145-156、158-162、163-168、217-220位氨基酸附近（圖9）。

圖9 TSP8蛋白的親水性分析Fig.9 Hydrophilic analysis of TSP8 protein

2.2.10 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TSP8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TSP8基因的蛋白序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里其他物種的蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中的TSP8基因與細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)跨膜蛋白（GenBank登錄號(hào)：CDS17460.1）同源性為100%，且TSP8在不同物種中均具有保守性（圖10）；應(yīng)用MEGA 6.0分析軟件，將上述蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，繪制TSP8基因編碼序列進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TSP8蛋白與多房棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus multilocularis）、亞洲帶絳蟲(chóng)（Taenia asiatica）在進(jìn)化關(guān)系上較近，而與家鼠（House Rat）、智人（homo sapiens）等在進(jìn)化關(guān)系上較遠(yuǎn)（圖11）。

圖10 不同宿主來(lái)源TSP8基因編碼（部分）氨基酸比對(duì)Fig.10 Conservatism analysis of partial amino sequence of TSP8 gene in different hosts

圖11 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TSP8蛋白進(jìn)化樹(shù)Fig.11 Phylogenetic tree of E.g TSP8 protein

2.2.11 TSP8基因在蟲(chóng)體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄 TSP8基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴和成蟲(chóng)階段均有轉(zhuǎn)錄，但在包囊壁中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，且在成蟲(chóng)階段轉(zhuǎn)錄水平較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖12）

圖12 Tsp8基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)不同發(fā)育階段的差異表達(dá)Fig.12 Differential transcription of Tsp8 in different stages of E.g

3 討論

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)作為包蟲(chóng)病的主要病原，一直以來(lái)都是我國(guó)包蟲(chóng)病的主要防治對(duì)象。包蟲(chóng)病作為一種不易及時(shí)發(fā)現(xiàn)、藥物治療時(shí)間長(zhǎng)且手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)極高的疾病，對(duì)其的防控與治療是一個(gè)長(zhǎng)期且艱巨的過(guò)程，我國(guó)目前對(duì)包蟲(chóng)病的防控采用“犬犬投藥，月月驅(qū)蟲(chóng)”的策略[1]。但由于近年包蟲(chóng)耐藥風(fēng)險(xiǎn)的不斷增加和防控效果的不理想，包蟲(chóng)病的防治研究方向逐漸以免疫預(yù)防為主[19]。

截止目前，包蟲(chóng)病的疫苗預(yù)防已經(jīng)取得突破，成功研制出EG95包蟲(chóng)病疫苗，其保護(hù)率可達(dá)96%～100%，但EG95疫苗對(duì)包蟲(chóng)病的防治效果僅僅針對(duì)于其中間宿主羔羊，存在很大的局限性，而目前我國(guó)并未有成熟的商品化包蟲(chóng)病終末宿主疫苗[20-21]。此外，楊光友等[23]在2015年第一次對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)四跨膜蛋白家族TSP1蛋白進(jìn)行了克隆表達(dá)，證明了TSP1在小鼠模型中顯示出明顯的Th1型免疫應(yīng)答，可作為包蟲(chóng)病治療、預(yù)防和控制的干預(yù)靶點(diǎn)。四跨膜蛋白作為寄生蟲(chóng)體表蛋白的重要組成部分，不僅在參與寄生蟲(chóng)和宿主相互作用中起重要作用，其四跨膜蛋白許多家族成員也可作為許多寄生蟲(chóng)的候選疫苗靶標(biāo)[8-13]。四跨膜蛋白8屬于四跨膜蛋白家族的一員，在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)上的研究還未有相關(guān)報(bào)道，但已經(jīng)證明其有重要作用。Manale等[24]研究證明靶向TSP8蛋白可以作為防止腫瘤擴(kuò)散的重要調(diào)節(jié)因子。Aurelie等[25]研究證明TSP8特異性抗體是一種檢測(cè)大腸癌（colorectal cancer,CRC）的高度敏感和特異的血液生物標(biāo)志物，被認(rèn)為是有希望治療人類癌癥的一個(gè)靶點(diǎn)。莊蘭艮等[26]研究證明TSP8可能通過(guò)激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）信號(hào)通路，負(fù)向調(diào)節(jié)糖尿病腎小管上皮細(xì)胞的自噬活性。

本研究首次對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)四跨膜蛋白TSP8進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和可能被作為候選疫苗靶標(biāo)的潛力進(jìn)行了描述。我們對(duì)TSP8基因進(jìn)行了克隆，TSP8蛋白的理論分子量為24 kDa，不含信號(hào)肽，不參與信號(hào)傳導(dǎo)作用，提示TSP8蛋白是非分泌型蛋白。TSP8多序列比對(duì)結(jié)果顯示TSP8蛋白的編碼氨基酸序列與智人的蛋白序列相似性同源性最低，僅有16.7%。另外，TSP8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，具有良好的穩(wěn)定性，且為親水性蛋白，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象可以使存在于蛋白表面的親水殘基和溶液中的極性分子結(jié)合，從而中和蛋白質(zhì)電荷，使蛋白質(zhì)保持最小能量，所以，親水性區(qū)域與抗原表位有關(guān)[27]。由此我們對(duì)TSP8蛋白的B抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出4個(gè)抗原表位，用其免疫動(dòng)物可能能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。綜上所述，TSP8蛋白有望成為控制人類棘球蚴病的有價(jià)值的疫苗靶點(diǎn)。