馬駑巴貝斯蟲PCR和qPCR檢測方法的建立

李菁雯，楊 帆，崔 強，張鵬飛，聶芝君，陳少博

（1.二連海關(guān)技術(shù)中心，二連浩特 011100；2.呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心，呼和浩特 010018）

馬駑巴貝斯蟲病（Babesia caballi）屬于馬梨形蟲病的一種，由寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動物紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲引起[1,2]，被世界動物衛(wèi)生組織（Office international dés epizooties,OIE）列為法定報告檢疫疫病，在我國被列為二類動物疫病。該病在歐洲南部地區(qū)、中東地區(qū)、非洲、亞洲、南美洲均有發(fā)生，廣泛存在于世界各地[3,4]；在我國新疆維吾爾族自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省、甘肅省、河北省、廣東省、貴州省等均有報道，發(fā)病率為20%～77.6%[5-8]。蜱蟲是該病最主要的中間宿主，也是馬駑巴貝斯蟲病的主要傳播者[9]。該病臨床表現(xiàn)為體溫升高、精神沉郁、肌肉振顫、呼吸和脈搏加速等癥狀[4,10]，慢性病例耐過后體內(nèi)會長期帶蟲，急性病例嚴(yán)重時會發(fā)生死亡。隨著“一帶一路”和“中蒙俄經(jīng)濟走廊”的建設(shè)，內(nèi)蒙古自治區(qū)和新疆維吾爾自治區(qū)等北部地區(qū)正大力發(fā)展馬產(chǎn)業(yè)，馬產(chǎn)業(yè)已成為地區(qū)性的朝陽產(chǎn)業(yè)。但近年來，馬駑巴貝斯病的發(fā)生，給馬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，也對國際馬匹進(jìn)出口貿(mào)易產(chǎn)生了很大的影響。本研究基于我國檢疫工作的實際需要，旨在建立兩種實用、便捷、高效的馬駑巴貝斯蟲的分子生物學(xué)檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 馬駑巴貝斯蟲（B.caballi）、馬巴貝斯蟲（B.equi）、環(huán)形泰勒蟲（T.annulata）等陽性DNA由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院實驗室提供，33份馬的血液臨床樣品采自蒙古國。

1.2 引物探針的設(shè)計及合成 參考馬駑巴貝斯蟲Bc48特異性基因序列（GenBank登錄號：MG94 8457.1）保守區(qū)，應(yīng)用Beacon Designer 7軟件設(shè)計了一對特異性引物和熒光探針，由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。BBS-F：5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′；BBS-R：5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′；BBS-P：5′-FAM-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTGTAMRA-3′。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備 利用本研究所設(shè)計的引物，根據(jù)確定的陽性DNA進(jìn)行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，將純化后的PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體相連接，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，將其置于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再挑取白色單菌落接種于含有氨芐青霉 素的LB液體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并送測序進(jìn)行分析。

1.4 PCR方法及qPCR方法的建立

1.4.1 PCR方法 PCR反應(yīng)體系為：2×Premix Taq預(yù)混液20 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補齊至40 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s；58℃退火1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。用3%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.4.2 qPCR方法 熒光定量PCR反應(yīng)體系組成為：2×Premix Ex TaqTM預(yù)混液12.5 μL，上、下游引物及探針各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊至 2 5 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，58℃退火1 min，45個循環(huán)；退火延伸時讀取熒光信號值。

1.5 PCR及qPCR特異性試驗 分別以馬駑巴貝斯蟲、馬巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲和健康馬血清樣品的DNA為模板，空白對照中加入無菌ddH2O，用本研究建立的PCR和qPCR方法進(jìn)行擴增，評價該方法的特異性。

1.6 PCR及qPCR靈敏性試驗 用已測定好濃度（17.4 ng/μL）的馬駑巴貝斯蟲陽性質(zhì)粒為模板，對該陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，即4.04×109copies/μL～4.04×100copies/μL，用本研究建立的PCR和qPCR方法對稀釋后的樣品進(jìn)行擴增，檢測該方法的靈敏性。

1.7 熒光定量PCR穩(wěn)定性試驗 選取5個濃度梯度（4.04×108copies/μL～4.04×104copies/μL）的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗，每個梯度的樣本20個平行進(jìn)行檢測，根據(jù)擴增反應(yīng)的Ct值，計算變異系數(shù)（CV），評價試驗的穩(wěn)定性。

1.8 PCR和qPCR檢測方法的比較 應(yīng)用建立好的PCR方法和qPCR檢測方法，分別對33份采自蒙古國馬的血液臨床樣品進(jìn)行檢測。

2 試驗結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定及序列比對結(jié)果 提取質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR擴增試驗，用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，可觀察到一條約為200 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致，將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目的片段（GenBank登錄號：MG948457.1）比較，相似性為99%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。擴增結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.2 特異性試驗結(jié)果

2.2.1 PCR特異性試驗結(jié)果 PCR擴增結(jié)果顯示，駑巴貝斯蟲有大小為200 bp的特異性條帶，與目的片段相符（圖2）。條帶清晰無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物出現(xiàn)，其他蟲種均無條帶出現(xiàn)，說明建立的方法對駑巴貝斯蟲具有良好的特異性。

圖2 PCR特異性試驗結(jié)果Fig.2 The result of specificity experiment

2.2.2 qPCR特異性試驗結(jié)果 實時熒光定量PCR擴增結(jié)果顯示，駑巴貝斯蟲有特異性曲線（圖3）。馬巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲和健康馬血清樣品均無曲線出現(xiàn)，說明建立的實時熒光定量PCR方法對駑巴貝斯蟲有良好的特異性。

圖3 實時熒光定量PCR特異性擴增曲線圖Fig.3 Specificity test curve of fluoresce quantitative PCR

2.3 靈敏性試驗結(jié)果

2.3.1 PCR靈敏性試驗結(jié)果 PCR擴增結(jié)果可見，第1～8泳道均能觀察到目的片段，且條帶亮度依次減弱，條帶寬度依次變窄，說明模板DNA濃度依次降低，當(dāng)模板DNA倍比稀釋至4.04×102copies/μL時，即第8泳道，仍有擴增條帶（圖4）。結(jié)果顯示，建立的PCR方法所能檢測到的最低檢出限為4.04×102copies/μL。

圖4 PCR靈敏性試驗結(jié)果Fig.4 The result of sensitivity experiment

2.3.2 qPCR靈敏性試驗結(jié)果 如圖5所示，曲線對應(yīng)的模板濃度分別為4.0 4×109copies/μL～4.04×100copies/μL，隨著模板DNA濃度依次降低，擴增曲線Ct值依次增大。當(dāng)模板濃度為4.04×101copies/μL時，仍有Ct值和標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線，因此，本實驗所建立的qPCR方法能夠檢出的最低濃度為4.04×101copies/μL。利用每個濃度對應(yīng)的Ct值建立線性關(guān)系，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-3.263x+39.79，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.999，模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖5 qPCR靈敏性擴增曲線圖Fig.5 Sensitivity test curve of fluoresce quantitative PCR

2.4 qPCR穩(wěn)定性試驗結(jié)果 選取5個濃度梯度（4.04×108copies/μL～4.04×104copies/μL）的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗，根據(jù)擴增反應(yīng)的Ct值，計算變異系數(shù)（CV），評價試驗的穩(wěn)定性。結(jié)果如表1所示，5個濃度對應(yīng)Ct值的變異系數(shù)較小，表明所建立的方法具有較好的穩(wěn)定性。

表1 熒光定量PCR組內(nèi)重復(fù)性試驗Table 1 The inter-assay reproducibility test of fluoresce quantitat ive PCR

2.5 PCR方法和qPCR方法在臨床中的應(yīng)用比較 對33份采自蒙古國的臨床樣品分別應(yīng)用建立的PCR方法及qPCR檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PCR方法檢測的陽性樣品數(shù)為9，陽性率為27.3%（9/33）；qPCR方法檢測的陽性樣品數(shù)為 23，陽性率為69.7%（23/33），經(jīng)卡方檢驗，兩種方法的陽性率有著極顯著性差異（P＜0.01，x2=10.25），說明本試驗所建立的qPCR檢測方法比PCR方法靈敏性更好，效果更優(yōu)。

3 討論

近年來，馬駑巴貝斯蟲病傳播面積逐年增大[8]，該病沒有特殊的臨床癥狀，只是表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、黃疸、貧血等[4,10]。有的慢性感染甚至癥狀極不明顯[11-12]，因此，該病從癥狀方面很難作出確診，只能進(jìn)行實驗室診斷。馬駑巴貝斯蟲病的實驗室診斷方法主要有血涂片法、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷方法，血涂片法是一個比較傳統(tǒng)、有效的檢測手段，但是該方法對于感染的蟲體量較大時容易檢出，對于體內(nèi)蟲體較少或慢性感染的病畜檢出率都不高[4-11,13-14]，大批量檢測時還需要大量的檢測時間和專業(yè)的技術(shù)人員。免 疫學(xué)檢測方法包括補體結(jié)合試驗、間接熒光抗體試驗和 酶聯(lián)免疫結(jié)合試驗,雖然后 兩者是國際貿(mào)易的指定試驗[2]，但這些方法也有著各自的缺點，如補體結(jié)合試驗和間接熒光抗體試驗對于慢性病畜的靈敏性低；酶聯(lián)免疫結(jié)合試驗易出現(xiàn)的假陽性結(jié)果[4,11,13-14]；感染初期，血清學(xué)手段無法檢測到足夠的抗體水平而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果等[11]，這些問題都制約了檢測的準(zhǔn)確性。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因其直接檢測病原體核酸而非抗體這一特性，有效的解決了上述方法的不足[16]，且該方法更適用于對進(jìn)出口馬匹的檢測[4]。在國外，很多學(xué)者更愿意嘗試血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法結(jié)合起來，共同診斷或檢測馬梨形蟲病[11,17-19]。因此，根據(jù)實際工 作的需要， 本研究建立了馬駑巴貝斯蟲PCR檢測方法，并且運用該方法做出了較為滿意的試驗結(jié)果。

本研究根據(jù)馬駑巴貝斯蟲Bc48特異性基因序列設(shè)計并合成了一對特異性引物和熒光探針，分別建立了馬駑巴貝斯蟲病PCR方法和qPCR檢測方法。Bc48蛋白目前被認(rèn)定為專門用于蟲種鑒別上的特異性蛋白，該蛋白以及其特異性基因序列，廣泛應(yīng)用于E LISA方法和PCR方法蟲種的鑒定[8-9,18,20-22]。經(jīng)特異性試驗表明，本文設(shè)計的引物只針對馬駑巴貝斯蟲體DNA擴增出大小為200 bp的產(chǎn)物，對其他蟲種均無特異性產(chǎn)物。 在方法優(yōu)化上，采用了均勻設(shè)計方法，篩選出最優(yōu)的反應(yīng)退火溫度及時 間，最終確定退火溫度為58℃，退火時間為1 min，因為上述兩種方法共用一對引物，所以退火溫度及時間相同。

在馬駑巴貝斯蟲的PCR檢測方面，國內(nèi)外學(xué)者也做了一些相關(guān)研究，早在1999年，Bashiruddin等[12]利用16S rRNA基因建立了馬駑巴貝斯蟲PCR檢測方法，2005年，Alhassan等[23]利用Bc48基因建立了馬駑巴貝斯蟲PCR檢測方法；在國內(nèi)，有學(xué)者分別利用18S rRNA和Bc48基因建立了該病的PCR檢測方法。這些 方法均有著良好的檢測效果，但是大部分都是普通PCR檢測，不僅檢測周期長、操作復(fù)雜，靈敏度也和qPCR方法有著差別[20,24]。本文建立的PCR方法最低檢出限為4.04×102copies/μL，qPCR方法最低檢出限為4.04×101copies/μL，兩種方法靈敏度差距10倍，在方法靈敏度方面接近張揚等[8]的研究結(jié)果。應(yīng)用兩種方法對33份樣品檢測可知，qPCR方法的檢出率要顯著高于普通PCR方法，且陽性樣品用qPCR方法檢出的Ct值均介于30～38之間，由此可知，陽性樣品中病原是極微量的。對于PCR方法，最低檢出限為4.04×102copies/μL，所對應(yīng)Ct值為33.55，即Ct值大于33.55時，將超出PCR方法的最低檢出限，該方法難以檢出。因此，對于樣品中極微量的病原檢測時，qPCR方法更為敏感，且該方法不需要電泳檢測，更適合對大批量樣品的檢測工作。

近幾年來，馬的進(jìn)口數(shù)量急劇增多，為了促進(jìn)地區(qū)間的馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展，建立一種準(zhǔn)確、可靠、快速、經(jīng)濟的檢測方法十分必要。本研究為后續(xù)建立馬駑巴貝斯蟲病數(shù)字PCR檢測方法奠定了扎實的基礎(chǔ)，不僅可以為檢測提供重要的技術(shù)儲備，同時也為其他同類病病原的快速檢測提供借鑒和經(jīng)驗。