羊弓形蟲病間接ELISA診斷方法的建立

李迎迎，侯 倫，王 敏，李亞瓊，李明俊，周艷琴,2，趙俊龍,2，申 邦,2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，武漢 430070）

弓形蟲是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的人獸共患寄生原蟲，可以引起人和多種動物患病，據(jù)估計，全球約有1/3的人感染弓形蟲[1]。我國農(nóng)業(yè)動物中，豬的感染率很高，一般在20%以上，有的養(yǎng)殖場甚至高達100%[2]。羊是除小鼠以外對弓形蟲最敏感的動物，羊感染弓形蟲后容易引起流產(chǎn)、死胎、弱胎等，在有些國家，高達20%的羊流產(chǎn)由弓形蟲感染引起[3-4]，給畜牧業(yè)帶來了很大的損失。在中國，羊群平均感染率在10%左右，而在北部和西北部達到了20%或更高[5]。目前國際上雖然有一個針對羊弓形蟲病的商業(yè)疫苗（Toxovax），但安全風(fēng)險較大[6]，沒有被大范圍使用[7]。

羊弓形蟲感染沒有特征性的臨床癥狀，因此鑒別診斷比較困難。目前實驗室嘗試過的弓形蟲病檢測方法有很多，包括病原學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)方法[8]，但針對羊弓形蟲病檢測的方法或標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品少之又少。在眾多方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）具有敏感特異，可短時間內(nèi)處理大量臨床樣品的優(yōu)點，適用于現(xiàn)場調(diào)查和推廣，因此受到廣泛的關(guān)注。目前，ELISA方法診斷弓形蟲病應(yīng)用的抗原較多，在人的弓形蟲病檢測上主要有速殖子全蟲抗原（Total Toxoplasma gondii tachyzoites antigens,TXA）、表面抗原1（Surface antigen 1,SAG1）[9]、致密顆粒蛋白8（Dense granule protein 8,GRA8）等，但是檢測不同動物的感染可能需要不同的抗原。在本實驗中，分別用全蟲抗原（TXA）、微線體蛋白3（Microneme protein 3，MIC3）、致密顆粒蛋白1（Dense granule protein 1,GRA1）、緩殖子抗原1（Bradyzoite antigen 1,BAG1）、多表位抗原（Multi-epitope antigen,MAG）進行正交試驗，通過對比P/N（陽性血清OD630值/陰性血清OD630值）值大小以及每種蛋白提純的難易程度和刺激機體免疫力的情況等，比較并篩出診斷抗原。綜合考慮抗原純化的難易程度等多個因素選擇分泌蛋白GRA1作為候選抗原，建立了檢測羊弓形蟲病的GRA1-iELISA（檢測IgG抗體）方法，這些結(jié)果為羊弓形蟲病ELISA試劑盒商品化生產(chǎn)提供了參考價值，對羊弓形蟲病的臨床診斷和疾病控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種與蟲株 弓形蟲RH蟲株（本實驗室保存）在HFF細(xì)胞（ATCC公司，美國）中擴大繁殖，HFF細(xì)胞培養(yǎng)在含2%FBS（胎牛血清）的DMEM中；BL21（DE3）表達菌株為本實驗室保存；pGEX-KG-MIC3[10]、pGX6P-1-MAG[10]、pET-28a-BAG1[11]重組質(zhì)粒為本實驗室構(gòu)建并保存。pE-SUMO-GRA1質(zhì)粒的構(gòu)建方式如下：提取弓形蟲RH株速殖子的RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）得到cDNA，并以此為模板利用GRA1（CDS）-F和GRA1（CDS）-R（表1）為引物擴增GRA1的編碼區(qū)，然后用ClonExpess一步法無縫克隆試劑盒將GRA1-CDS片段連接到pE-SUMO載體上得到pE-SUMO-GRA1，經(jīng)酶切鑒定測序驗證無誤后，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中用于GRA1的誘導(dǎo)表達。

表1 構(gòu)建pE-SUMO-GRA1質(zhì)粒用到的引物序列Table 1 Primers used to construct the pE-SUMO-GRA1 plasmid

1.2 樣本來源 80份黑山羊血清采自湖北省黃岡市某屠宰場；20份山羊弓形蟲陰性血清采自湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所；弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照血清、山羊無漿體陽性血清、山羊莫氏巴貝斯蟲陽性血清、山羊呂氏泰勒蟲陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所朱興全老師、關(guān)貴全老師惠贈。

1.3 5種抗原的制備 全蟲抗原的制備：RH速殖子培養(yǎng)在T25細(xì)胞瓶中，待弓形蟲速殖子（約107個）逸出后收集細(xì)胞，用注射器吹打以裂 解宿主細(xì)胞并釋放蟲體，用3 μm濾器過濾，1500 ×g離心收集蟲體并用PBS洗滌3次，向沉淀中加入200 μL裂解液（RIPA），置于超聲清洗機中裂解30 min至液體清亮，離心取上清液，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得蛋白濃度，然后放在-80℃保存?zhèn)溆?。制備MIC3、MAG、BAG1蛋白的具體操作參照文獻中相應(yīng)步驟[10-11]。GRA1的制備方法如下：將BL21（DE3）/pE-SUMO-GRA1表達菌株擴大培養(yǎng)至OD600為0.4，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，用壓力破碎儀破碎菌體，4℃條件下12000 ×g離心10 min取上清液，將上清液用0.45 μm的濾器過濾，然后經(jīng)親和層析柱純化。

1.4 以4種重組蛋白和全蟲抗原為包被抗原的正交試驗 將5種抗原分別按5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL的梯度稀釋，包被酶標(biāo)條，每個濃度包被一縱列5孔。將陰、陽性對照血清分別按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，每個稀釋度加到一橫列5孔，二抗用Rabbit Anti-Goat IgG（HRP Conjugated）。按文獻描述的方法[11]進行ELISA操作，比較各抗原對應(yīng)的P/N值的大小，依次選擇最優(yōu)抗原。同時，選擇正交實驗中P/N值最大處對應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)作為最佳條件優(yōu)化后續(xù)的iELISA方法。

1.5 GRA1-iELISA方法

1.5.1 各項反應(yīng)條件優(yōu)化 在正交試驗結(jié)果基礎(chǔ)上對封閉濃度（0.5%、1.0%、1.5%與2.0%的BSA）和時間（20、30、45、60 min）、待檢血清作用時間（30、45、60、75 min）、二抗使用濃度（1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000）及時間（30、45、60、75 min）、底物反應(yīng)作用時間（5、7.5、10、12.5 min）進行優(yōu)化。上述試驗重復(fù)3次以確定最佳條件。

1.5.2 重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)試驗采用同一批次包被的酶標(biāo)板，分別在包被后第0、3、6、9、12 d對3份陽性血清和2份陰性血清按照已經(jīng)優(yōu)化好的條件進行檢測，并計算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。批間重復(fù)試驗分別取5個批次包被的酶標(biāo)板在同一時間對3份陽性血清和2份陰性血清按照已經(jīng)優(yōu)化好的條件進行檢測。

1.5.3 敏感性試驗和特異性試驗 敏感性試驗：5份陽性血清各作1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋，然后用優(yōu)化好的條件進行GRA1-iELISA檢測，并設(shè)陽性、陰性、空白對照，尋找檢測結(jié)果為陽性的最大血清稀釋度作為敏感性試驗的結(jié)果。特異性試驗：用建立的方法對山羊莫氏巴貝斯蟲陽性血清、山羊呂氏泰勒蟲陽性血清、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性血清進行檢測，檢查是否有交叉反應(yīng)。

1.5.4 檢測臨床樣本 應(yīng)用建立的方法對采集自湖北省某屠宰場的80份山羊血清進行檢測，分別設(shè)置陽性、陰性和空白對照，計算陽性率。同時，應(yīng)用改良凝集試驗（MAT）對該批血清檢測，計算陽性率，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 5種抗原的SDS-PAGE凝膠電泳分析和Western blot驗證 本研究選定弓形蟲速殖子全蟲抗原（TXA）以及4個重組蛋白（GRA1、MIC3、MAG、BAG1）作為羊弓形蟲病診斷的候選抗原。為檢查抗原的表達情況，對純化后的4個蛋白以及全蟲抗原進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1。重組His-SUMO-GRA1、GST-MIC3、GST-MAG、His-BAG1大小分別約為39、68、43、42 kDa，目的條帶大小與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 5種抗原的SDS-PAGE鑒定Fig.1 SDS-PAGE analysis of five antigens

同時，為驗證候選抗原的免疫反應(yīng)性，對5種抗原進行Western blot分析，結(jié)果見圖2。Western blot顯示，5種抗原均能被山羊弓形蟲特異的陽性血清識別，與陰性血清不反應(yīng)（圖2），說明免疫反應(yīng)性良好。

圖2 5種抗原的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of 5 different antigens

2.2 確定診斷抗原 將上述5種蛋白包被ELISA酶標(biāo)板,用陰（N）、陽性（P）對照血清進行間接ELISA試驗，整合數(shù)次方陣滴定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以GRA1為包被抗原的滴定試驗對應(yīng)的OD630P/N值最大，說明GRA1適合作為建立羊弓形蟲病診斷方法的候選抗原。同時，GRA1重組蛋白能夠以可溶形式大量表達，易純化，因此我們選定GRA1作為羊弓形蟲病iELISA診斷方法的最佳抗原。方陣滴定的結(jié)果還表明，GRA1-iELISA OD630P/N值最大值處對應(yīng)的蛋白包被濃度是1.25 μg/mL，血清稀釋度是1∶100。

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化 在正交試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以GRA1為包被抗原，對后續(xù)反應(yīng)條件進行篩選，根據(jù)P/N值大小明確了最佳封閉時間是30 min，最佳封閉濃度是1%的BSA（牛血清白蛋白），血清最佳作用時間是60 min，酶標(biāo)二抗最佳稀釋比是1∶5000，二抗最佳作用時間是45 min，顯色時間是10 min。

圖3 方陣滴定試驗確定最佳診斷抗原Fig.3 Titration test to identify the best antigen

2.4 陰、陽性臨界點的判定 按照以上優(yōu)化的反應(yīng)條件，對20份陰性血清（經(jīng)改良凝集試驗MAT驗證）用建立的間接ELISA方法進行檢測，結(jié)果如表2所示。根據(jù)表中數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，求得20份陰性血清樣品的S（樣本OD630值）/N（標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD630值）的平均值x為1.4815，標(biāo)準(zhǔn)方差SD為0.2742，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理x+3SD置信區(qū)間為99%，計算出ELISA陰陽性的臨界值是x+3SD=2.304，因此待測樣品的S/N值≥2.3為陽性，反之，則判斷為陰性。

表2 20份陰性血清檢測結(jié)果Table 2 Detection results of 20 negative sera

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 以優(yōu)化后的間接ELISA檢測方法分別對批內(nèi)、批間（5個）各5份樣品重復(fù)5次進行檢測。結(jié)果顯示，重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于7%，說明建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性。結(jié)果見表3和表4。

表3 批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果Table 3 Reproducibility of intra-batch test of the GRA1-iELISA

表4 批間重復(fù)試驗結(jié)果Table 4 Reproducibility of GRA1-iELISA between batches

2.6 敏感性試驗和特異性試驗結(jié)果 為評估本研究所建立方法的敏感性，對5份陽性血清各作1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋進行檢測，并設(shè)陽性、陰性、空白對照，結(jié)果見表5。在本次檢測中，所以血清稀釋100倍以后還能被檢為陽性，說明本方法敏感性大于1∶100。

表5 敏感性試驗結(jié)果Table 5 Sensitivity test of GRA1-iELISA

為評估本研究所建立方法的特異性，用建立的方法對山羊莫氏巴貝斯蟲陽性血清、山羊呂氏泰勒蟲陽性血清、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性血清進行檢測，并設(shè)陽性、陰性、空白對照，結(jié)果見表6。該方法不與羊莫氏巴貝斯蟲、羊呂氏泰勒蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)（表6），說明特異性良好。

表6 特異性試驗結(jié)果Table 6 Specificity test of GRA1-iELISA

2.7 臨床樣本檢測結(jié)果 應(yīng)用本研究優(yōu)化后的GRA1-iELISA方法，對采自湖北省黃岡市羅田縣某屠宰場的80份黑山羊血清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該批山羊群體中弓形蟲抗體陽性率為28.75%（23/80）。將該結(jié)果與改良凝集試驗MAT檢測結(jié)果比較，二者的符合率為82.5%（66/80），見表7。

表7 MAT和ELISA檢測結(jié)果對比Table 7 Comparison analysis of MAT and ELISA

3 討論

弓形蟲病是一種世界范圍內(nèi)的人畜共患病，羊弓形蟲病對畜牧業(yè)發(fā)展以及公共衛(wèi)生安全均有重大威脅，因此，建立準(zhǔn)確、有效的羊弓形蟲病現(xiàn)場診斷方法非常必要。目前，弓形蟲病的檢測方法在實驗室內(nèi)有很多嘗試，但是針對羊弓形蟲病，國際上尚無十分完善的快速診斷方法，國內(nèi)也缺少標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化試劑盒。ELISA方法靈敏、特異、微量高效，無需昂貴設(shè)備和特殊技術(shù)，可在短時間內(nèi)檢測大量樣本，能夠滿足獸醫(yī)基層批量檢測的需要。

在本實驗中，我們表達純化了與弓形蟲相關(guān)的5種蛋白，通過一系列試驗，篩選出了各方面均比較突出的致密顆粒蛋白GRA1作為診斷抗原建立檢測方法。GRA1蛋白作為弓形蟲的分泌蛋白[12]，在弓形蟲生活史的各個時期均有表達，并且可溶性好，表達量高，易提純，經(jīng)濟成本低，是建立診斷方法的優(yōu)秀抗原[13]。建立本方法的不足之處是進行特異性試驗的樣本較少，僅選用了兩種原蟲和一種蠕蟲陽性樣品，原因是臨床上較難找到無特定病原體的山羊血清。本研究中以GRA1為診斷抗原的羊弓形蟲病間接ELISA方法靈敏度適中、特異性較好，適合養(yǎng)殖和屠宰現(xiàn)場的快速和高通量檢測，為后續(xù)商業(yè)化試劑盒的生產(chǎn)提供了參考價值，為羊弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查以及免疫效果的監(jiān)測提供了技術(shù)支持，對羊弓形蟲病的防控具有重要意義。