狂犬病病毒G蛋白的克隆表達(dá)及其抗體膠體金檢測試紙條的研制

鄧柏林，鄭雪瑩，范君文，鄭金來，王 培，郭俊林，張守峰

（1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；2.北京標(biāo)馳澤惠生物科技有限公司，北京 102629；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122）

狂犬病是（Rabies）由狂犬病病毒（Rabies virus,RV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的的急性人畜共患病，主要引起急性腦炎或腦膜腦炎，幾乎所有的溫血動物均易感，一旦發(fā)病，其病死率幾乎100%[1]，據(jù)測算，全世界每年因狂犬病可導(dǎo)致59 000多人死亡，95%發(fā)生在非洲和亞洲，原因是被已感染的犬只咬傷[2-3]。近年來，我國狂犬病發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)雖在一直下降，但仍處于我國法定報告?zhèn)魅静∏傲?，給人民群眾生命健康造成威脅。目前我國17個狂犬病主要流行省區(qū)的62個狂犬病病毒代表流行株均為基因1型，毒株相對穩(wěn)定[4]。北京市自2005年以來均有人感染狂犬病，其中2013年是13例，達(dá)到了近年來的高峰，而近幾年對傷人犬的病原學(xué)檢測中均發(fā)現(xiàn)了狂犬病確診病例，大部分確診病例均為流浪犬。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）及世界動物衛(wèi)生組織（office international des épizooties,OIE）規(guī)定血清中和抗體效價高于0.5 IU/mL表明機(jī)體對狂犬病病毒感染具有抵抗力，疫苗免疫覆蓋率達(dá)到70%以上時，才能有效控制動物狂犬病的流行[5]。當(dāng)前國內(nèi)檢測犬狂犬病病毒抗體的診斷方法主要是免疫熒光抑制灶實(shí)驗（rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT）、熒光抗體病毒中和試驗（fluorescent antibody virus neutralization test,FAVN）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法等[6-8]，但這些方法存在場地設(shè)備要求高、操作難度大、檢測時間長以及需要專業(yè)人員操作等問題，因此，本研究基于膠體金方法的簡便、快速，開展了狂犬病病毒G蛋白的重組純化及狂犬病病毒IgG抗體膠體金試紙條的研制，為寵物診療機(jī)構(gòu)、實(shí)驗室監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查工作帶來便利。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、菌株及試劑 供體質(zhì)粒pcDNA3.1（+）、大腸桿菌Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；CHO-S細(xì)胞購自Invitrogen公司；試驗用各類抗體血清由疫控中心保存提供；DL2000 DNA marker、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ（NEB）購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；氯金酸溶液、檸檬酸三鈉溶液國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自上海捷寧生物科技有限公司。

1.2 狂犬病病毒G蛋白重組載體構(gòu)建 將克隆載體pcDNA3.1（+）與目的基因置于4℃條件，在T4 DNA連接酶作用下過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Mach1T1菌株，涂布含氨芐的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)12～15 h后提取重組質(zhì)粒。

1.3 CHO-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染 1×107細(xì)胞與10 μg重組質(zhì)?；靹蛴?00 μL電擊杯中，電擊條件為1100 V/30 ms，取出電擊后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有30 mL CD08無血清培養(yǎng)基的125細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃條件下5%CO2培養(yǎng)箱中、65 rpm持續(xù)培養(yǎng)。

1.4 Western blot鑒定 轉(zhuǎn)染48 h后4000×g 離心20 min，分別收集培養(yǎng)基和胞體，培養(yǎng)基電泳上樣50 μL，取適量胞體進(jìn)行還原處理后上樣50 μL。SDS-PAGE結(jié)束轉(zhuǎn)膜（300 mA/1 h），5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Anti-6His-HRP抗體孵育1 h，再利用TBST洗滌5次后進(jìn)行顯色處理。

1.5 純化 培養(yǎng)基共收集約60 mL進(jìn)行親和純化。親和純化后的樣品利用10 kDa超濾管進(jìn)行超濾濃縮換液至1×PBS，終體積約500 μL、80 μg，-20℃保存。

1.6 狂犬病病毒IgG抗體膠體金檢測試紙條的制備

1.6.1 膠體金溶液的制備 氯金酸溶液煮沸后勻速攪動下加入檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱煮沸5 min后冷卻至室溫，2～8℃避光保存。

1.6.2 重組抗原的標(biāo)記 取1 mL膠體金溶液于離心管中，加入0.2 mol/L碳酸鉀15 μL。取10 μg純化的重組G蛋白，加入到膠體金溶液中，迅速混勻，室溫放置30 min。加入20%牛血清白蛋白溶液10 μL，混勻，室溫平衡5 min。加入20% PEG20000溶液10 μL，混勻，室溫平衡30 min。將金標(biāo)抗體溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以10 000 ×g離心10 min，棄上清液。沉淀中加入100 μL金標(biāo)復(fù)溶液，混勻，2～8℃避光保存。

1.6.3 金墊的制備 將用膠體金標(biāo)記好的重組G蛋白與金標(biāo)復(fù)溶液1∶1稀釋混勻后均勻噴在浸泡過的干凈的玻璃纖維素膜上，置干燥室干燥過夜（16～24 h），備用。

1.6.4 硝酸纖維素包被膜的制備 用PBS（0.1 mol/L，pH值7.2）將鼠抗G蛋白調(diào)整濃度為0.5 mg/mL，制備質(zhì)控（C線），將鼠抗犬IgG、鼠抗貓IgG 1∶1調(diào)整濃度為1.0 mg/mL，噴于PVC底板的NC膜上，制備檢測線（T線）。將所劃膜的板子置干燥室（相對濕度≤35%）干燥過夜（16～24 h）。

1.6.5 樣品墊的制備 玻璃纖維素膜置樣品墊處理液中浸泡完全后干燥備用。

1.6.6 試紙條組裝 在相對濕度≤35%的條件下，將試紙條按要求進(jìn)行組裝后，將組裝好的板子修剪整齊，切成寬3.0 mm的試紙條。挑取印膜無劃痕、無污染、邊緣整齊的試紙條，裝入塑料卡中壓緊制成測試卡，其中樣品墊區(qū)域?qū)?yīng)于測試卡的加樣孔；硝酸纖維素膜區(qū)域?qū)?yīng)于塑料卡的視窗位置。

1.7 試紙條質(zhì)量的評估

1.7.1 特異性 用狂犬病病毒抗體檢測試紙條檢測狂犬病毒IgG抗體陽性血清、狂犬病病毒IgG抗體陰性血清、犬細(xì)小病毒IgG抗體陽性血清、犬冠狀病毒IgG抗體陽性血清和SPF犬血清各1份。觀察檢測結(jié)果，評價試紙條的特異性。

1.7.2 靈敏性 采用中和抗體方法檢測出狂犬病病毒抗體血清滴度，并按比例稀釋后，用于評價試紙條的靈敏性。

1.7.3 重復(fù)性 制備三批狂犬病病毒IgG抗體檢測試紙條，用同一批次內(nèi)和不同批次的試紙條同時檢測相同狂犬病病毒IgG抗體陽性血清和狂犬病病毒IgG抗體陰性血清各三份，重復(fù)三次，觀察檢測結(jié)果，評價試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.7.4 穩(wěn)定性 將組裝好的試紙條連同一個干燥劑一起放入鋁箔袋，封口。同一批次試紙條，先使用標(biāo)準(zhǔn)血清檢測抗體，再分別在4℃環(huán)境和37℃環(huán)境下放置1、2、3、4、5、6個月后檢測，檢驗試紙條的檢出效果。

1.7.5 臨床樣品檢測 收集100份犬血清樣品，分別使用本試紙條和市售的兩種狂犬病病毒G蛋白膠體金試紙條進(jìn)行檢測。比較本試紙條與其他產(chǎn)品的符合程度。

2 結(jié)果

2.1 核酸序列 通過對NCBI（GenBank登錄號：NC_001542.1）和UniProt（P03524-strain ERA）等數(shù)據(jù)庫的查詢，同時為了提高G基因在真核生物的表達(dá)量，以同義密碼子替換的方式，進(jìn)行了多處密碼子優(yōu)化（圖1）。在所示基因?qū)?yīng)氨基酸的前面設(shè)計了促進(jìn)真核表達(dá)體系分泌表達(dá)的信號肽（MVPQALLFVP LLVFPLCFG）和利于后期純化的His標(biāo)簽（HHHHHH）。將上述編碼目的蛋白的基因通過化學(xué)合成法由北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成。

圖1 優(yōu)化后的核苷酸序列Fig.1 The optimized nucleotide sequence

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將目的基因?qū)氲絧cDNA3.1（+）載體中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Mach1T1菌株，培養(yǎng)后，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，可見2條大小分別為5500 bp和1500 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），命名為pcDNA3.1（+）-G。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid enzyme digestion

2.3 目的蛋白鑒定和純化 收集細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行鎳柱親和純化（圖3），親和純化后的樣品利用10 kDa超濾管進(jìn)行超濾濃縮換液至1×PBS，終體積約500 μL，約80 μg，-20℃保存，得到的重組G蛋白即為人工合成狂犬病病毒G基因（RV-G基因）經(jīng)重組質(zhì)粒在真核表達(dá)系統(tǒng)CHO-S細(xì)胞表達(dá)、純化后的G蛋白（圖4）。使用NanoDrop2000超微量分光光度計外測定G蛋白濃度為1.3 mg/mL。

圖3 鎳柱親和圖譜Fig.3 Ni affinity purification

圖4 Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Test result of Western blot

2.4 試紙條特異性 狂犬病病毒IgG抗體檢測試紙條檢測狂犬病病毒IgG抗體陽性血清為陽性，狂犬病病毒IgG抗體陰性血清和SPF犬血清為陰性，同時不與犬細(xì)小病毒IgG抗體陽性血清、犬瘟熱病毒IgG抗體陽性血清、犬冠狀病毒IgG抗體陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該試紙條具有較好的特異性（圖5）。

圖5 試紙條特異性檢測結(jié)果Fig.5 Strip specificity test results

2.5 試紙條敏感性 使用中和抗體方法（FAVN）測得犬狂犬病病毒IgG抗體濃度為為40 IU/mL的陽性血清分別做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640倍比稀釋，當(dāng)稀釋血清為1∶160時檢測線仍可見，表明該試紙條敏感性良好。

圖6 試紙條敏感性檢測結(jié)果Fig.6 Strip sensitivity test results

2.6 試紙條重復(fù)性 用同一批次內(nèi)的試紙條檢測相同狂犬病病毒IgG抗體陽性血清3份，檢測結(jié)果為陽性，用同一批次內(nèi)的試紙條檢測相同狂犬病病毒IgG抗體陰性血清3份，檢測結(jié)果為陰性。重復(fù)3次檢測結(jié)果相同。不同批次的試紙條檢測相同狂犬病病毒IgG抗體陽性血清3份，檢測結(jié)果為陽性，不同批次內(nèi)的試紙條檢測相同狂犬病病毒IgG抗體陰性血清3份，檢測結(jié)果為陰性，重復(fù)3次檢測結(jié)果相同。表明該試紙條重復(fù)性好。

2.7 試紙條穩(wěn)定性 使用稀釋濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)血清檢驗試紙條的穩(wěn)定性，6個月后仍可檢測出抗體水平呈陽性，穩(wěn)定性較好。

2.8 臨床樣品檢測 100份犬血清樣品，試驗試紙條共檢測出陽性樣品75份，陰性樣品25份，市售試紙條A共檢測出陽性樣品73份，陰性樣品27份，試紙條B共檢測出陽性樣品72份，陰性樣品28份（表1）。試驗試紙條和市售試紙條A總符合率為94%，和市售試紙條B總符合率為91%。

表1 狂犬病病毒抗體檢測方法符合率試驗Table 1 Coincidence rate test of Rabies virus antibody detection method

3 討論

G蛋白由524個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為56 kDa，其抗原性主要依賴于空間構(gòu)象表位，主要的抗原位點(diǎn)有GⅠ區(qū)、GⅡ區(qū)和GⅢ區(qū)[9]。G蛋白作為狂犬病病毒唯一的糖蛋白，糖基化對其穩(wěn)定性、抗原性、生物活性及糖蛋白的表達(dá)與分泌起關(guān)鍵作用，因此在利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段表達(dá)G蛋白時必須采用真核表達(dá)體系才能相對接近的表達(dá)出RV在侵入機(jī)體后所翻譯表達(dá)的G蛋白結(jié)構(gòu)。市場上常用的狂犬病病毒抗體檢測主要是ELISA和膠體金方法，膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)在多種動物疾病診斷中應(yīng)用，柳旭偉等[10]統(tǒng)計表明該方法已用于多種動物細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病的診斷，哈登觸日亞等[11]也通過在專利數(shù)據(jù)中檢索中發(fā)現(xiàn)上述三個領(lǐng)域目前已申請專利161項，占膠體金技術(shù)申請專利總數(shù)的31.45%。本實(shí)驗室曾做過狂犬病ELISA試劑盒的比對試驗，結(jié)果表明目前市場上的常用ELISA試劑盒一致性有差異且整體一致性不高[12]，其中G蛋白包被的盒子效果明顯好于N蛋白標(biāo)記的盒子，因此本研究制備的狂犬病病毒重組糖蛋白，作為抗原包被效果好。膠體金檢測技術(shù)無需對標(biāo)記物進(jìn)行分離，省去了ELISA中洗滌等繁瑣步驟，極大的縮短了檢測時間，抗體滴度高時5 min即可出結(jié)果。該試紙條不僅檢測時間短且檢測的一致性與ELISA相仿。

近幾年，隨著寵物犬?dāng)?shù)量的增長，犬活動區(qū)域不斷擴(kuò)大，寵物擾民、傷人、污染社區(qū)環(huán)境等一系列問題也隨之產(chǎn)生，在全球范圍內(nèi)，為一只犬免疫的平均支出是4美元，但治療被犬咬傷的患者平均需要108美元，這是前者的27倍[13]。通過暴露前后檢測抗體水平，以科學(xué)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果為依據(jù)，可準(zhǔn)確掌握動物個體免疫狀況，一方面指導(dǎo)寵物醫(yī)生為犬、貓制定個性化的免疫程序，確保犬、貓得到有效保護(hù)；另一方面犬、貓接種狂犬疫苗并獲得有效保護(hù)，是人類在狂犬病暴露前和暴露后進(jìn)行預(yù)防的一項重要的、可行的、有效的措施，它進(jìn)一步降低了狂犬病病毒傳播給人的幾率，更好地消除被動物咬傷（或者抓傷）人員的擔(dān)心與恐懼為人類狂犬病防控建立一道堅實(shí)的屏障。此外，根據(jù)當(dāng)前航空以及跨境運(yùn)輸犬、貓相關(guān)規(guī)定，必須出具相關(guān)犬、貓狂犬病免疫情況的檢測報告，達(dá)到保護(hù)水平方可運(yùn)輸。因此本研究制備的試紙條檢測狂犬病毒IgG抗體操作簡單、快速得到檢測結(jié)果，可檢測出犬是否獲得中和保護(hù)抗體，對接種狂犬病疫苗動物的免疫接種效果進(jìn)行評估，以消除免疫不確實(shí)動物帶來的潛在威脅。