七彩山雞內(nèi)源性禽白血病病毒的鑒定及其env基因序列分析

劉 健，李凱航，鞠厚斌，李 鑫，葛菲菲，楊德全，楊顯超，葛 杰，鄧 波，周錦萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

禽白血病（avian leukosis,AL）是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽白血病病毒引起的以禽類造血組織中某些細胞成分過度增生為主的一類可傳染的腫瘤性疾病，根據(jù)病原學(xué)和病理學(xué)的特點，可以將禽白血病分成四個型，即淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病和髓細胞性白血病[1-2]。根據(jù)在不同遺傳型雞胚成纖維細胞上的宿主范圍、與相同或不同亞群成員的干擾模式以及用病毒血清中和試驗鑒定的病毒囊膜抗原，禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）可分為A至K共11個亞群，其中A、B、C、D、J和K屬于外源性白血病病毒，E、F、G、H和I屬于內(nèi)源性白血病病毒[3]。A、B、C、D、E、J和K亞群分離于雞，A、B亞群在野外是常見的外源性病毒，很少有C和D亞群病毒在野外被發(fā)現(xiàn)的報道，E亞群包括極普通的內(nèi)源性低致病力白血病病毒[4]。J亞群主要引起雞的傳染性致骨髓細胞瘤疾病或成髓性白血病[5]。K亞群禽白血病病毒是2012年王鑫等[6]首次從我國地方品種蘆花雞中分離到的新亞群。另外F亞群和G亞群也曾經(jīng)被從環(huán)頸雉、黃金稚和Lady Amberst雉中分離到。H亞群分離自匈牙利鷓鴣，I亞群分離自岡比亞鵪鶉[7]。

本研究從七彩山雞品系中檢測到1株內(nèi)源性禽白血病病毒，將其命名為PC1701，并進行了病毒的鑒定及其env基因序列分析。

1 材料與方法

1.1 試劑 禽白血病p27抗原檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰酶消化液（0.25%）購自GIBCO公司；DF1細胞由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院禽病研究室贈送。

1.2 樣品采集及處理 使用肝素鈉真空采血管無菌采集雌性山雞血樣品200份，完全混勻，24 h內(nèi)（冷藏條件）送至實驗室，2000 ×g離心2 min后冷藏備用。

1.3 病毒分離和傳代 吸取樣品上清液底部白細胞層100 μL接種到長有單層DF1細胞的24孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，用含1%胎牛血清的細胞維持液換液后連續(xù)培養(yǎng)9 d。傳代時將24孔板中的細胞消化傳代，同時將細胞上清液也接種于新的DF1細胞中傳代。

1.4 病毒鑒定

1.4.1 p27抗原的測定 按試劑盒說明書進行ALV p27抗原的檢測。如果檢測結(jié)果為陰性，則在DF1細胞上可盲傳至第3代，若第3代盲傳結(jié)果為陽性時，則繼續(xù)盲傳至第9代，若結(jié)果為陰性，則判定結(jié)果為陽性。

1.4.2 env基因擴增和測序 參考文獻[8]合成引物（上游引物：5′-G ATGAGGCGAGCCCTC TCTTTG-3′；下游引物：5′-TGTGGTGGGAGGT AAAATGGCGT-3′）。擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%凝膠電泳觀察擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)有2200 bp大小的片段時，即可將PCR產(chǎn)物送至測序公司進行測序。

1.5 測序結(jié)果與各亞群參考株的同源性比較 利用GenBank中的BLAST工具查找與已測序列同源性較高的毒株，并使用DNAStar軟件，將本研究測得的序列分別與GenBank中已發(fā)表的不同亞群ALV序列作同源性比較，根據(jù)同源性及遺傳進化樹來確定該分離株的亞群類型。不同亞群ALV參考毒株的信息見表1。

表1 用于env基因比較的不同亞群ALV參考株Table 1 env gene sequence comparisons of different ALV subgroups reference strains

2 結(jié)果

2.1 p27抗原檢測和傳代結(jié)果 對200份血漿樣品的第1代細胞上清液進行p27抗原測定，有13份細胞上清液為ALV p27抗原陽性，陽性率為6.5%。將第1代ALV p27抗原陽性的細胞裂解液和細胞上清液進行傳代培養(yǎng)，其第2代細胞和上清液ALV p27抗原均為陰性。盲傳至第9代，除第1代細胞上清液ALV p27抗原陽性外，其余代次ALV p27抗原均為陰性。

2.2 細胞上清液PCR結(jié)果 對ALV p27陽性的細胞上清液進行PCR檢測，除第1代細胞上清液擴增出2200 bp大小的PCR產(chǎn)物外，其余代次均無2200 bp大小的PCR產(chǎn)物（圖1）。

圖1 env基因擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of env gene

2.3 已測序列與各亞群參考株的同源性比較結(jié)果 對陽性的PCR結(jié)果進行測序，共測得2段均為1001 bp的片段，其中上游引物片段與已知序列同源性為39.1%～66.7%，下游引物片段為非目的片段或者隨機片段，在GenBank中BLAST后與CLB908M（GenBank登錄號：JX855935）和NX0101（GenBank登錄號：DQ115805）同源性最高，分別為65.3%和66.7%（表2）。遺傳進化樹也表明分離株1701與其他亞群參考株同源性最低，不屬于已知的A～E和G～K的任何亞群（圖2）。

圖2 分離株P(guān)C1701與其他ALV亞群參考株env基因遺傳進化樹關(guān)系Fig.2 Phylogenetic tree for env gene sequences of isolated strains PC1701 and ALV reference strains of different subgroups

表2 分離株env基因與其他ALV亞群參考株同源性比較Table 2 Sequence comparison of env gene between isolated strain and other ALV reference strains of different subgroups

3 討論

迄今為至，已報道的ALV有11個亞群，按分離鑒定的先后分別定名為A～K，其中A～E及J、K七個亞群是從雞分離到的，其余是從其他鳥類分離到的[1]。內(nèi)源性病毒是正常雞基因組中與外源性基因組十分相似的結(jié)構(gòu)元件，一般不以病毒粒子的形式進行傳播，只作為雞基因組的一部分按孟德爾遺傳規(guī)律進行代次間傳遞[9]。本研究從七彩山雞的蛋清中檢測到p27陽性，采集其血漿在DF1細胞上進行病毒分離，其第一代細胞培養(yǎng)液為p27陽性，進行細胞盲傳后，其后代次的細胞培養(yǎng)液p27均為陰性。研究結(jié)果表明，七彩山雞雞群中存在內(nèi)源性禽白血病病毒感染，其同源性與已公開的禽外源性和內(nèi)源性白血病同源性都較低，不能在DF1細胞中正常的增殖和傳代，能夠在蛋清中產(chǎn)生p27抗原，由此我們推斷其攜帶內(nèi)源性禽白血病病毒。

將第1代細胞培養(yǎng)物進行env基因檢測，電泳結(jié)果出現(xiàn)一條與目的條帶大小一致的條帶，測序后在GenBank中進行Blast，其序列與GenBank中已公開ALV-A～K序列同源性普遍較低，與J亞群的NX0101和CLB908M兩株毒株同源性最高，分別為66.7%和65.3%，其中NX0101來源于國內(nèi)的白羽肉雞，CLB908M是俄羅斯分離株，與其他已公開的ALV病毒同源性僅為39.1%～59.4%，由于GenBank中沒有F亞群全基因序列，且測序結(jié)果與已知序列不匹配，因此與F亞群的同源性未作分析。

我國部分地方雞種中存在內(nèi)源性ALV感染，容易干擾外源性禽白血病凈化程序，本項目中七彩山雞屬于雉，其禽白血病的帶毒情況鮮有報道，因此其禽白血病的感染和帶毒狀況并不清楚，不利于其禽白血病的凈化[10-11]。研究過程中，在其蛋清和血漿中未分離到外源性ALV，說明其無外源性ALV，但是其內(nèi)源性ALV在細胞內(nèi)進行表型表達，造成ELISA檢測結(jié)果陽性，這對外源性禽白血病的凈化造成了嚴重的干擾。本研究通過對七彩山雞原種場核心群進行禽白血病檢測，證實了七彩山雞體內(nèi)存在內(nèi)源性白血病病毒，對于七彩山雞禽白血病的防控與凈化有參考價值。