豬流行性腹瀉病毒變異株XP2018的分離及S基因序列分析

趙攀登 ，冀夢(mèng)瑤 ，朱文龍 ，陳 益 ，盧建洲 ，楊 霞 ，朱 芳 ，田 欣 ，程 云 ，潘頌佳，張 寧，范寶超

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046；2.河南豐源和普農(nóng)牧股份有限公司，駐馬店 463900；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南京 210014）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種以腹瀉、脫水和死亡為主要癥狀的急性腸道傳染病。各年齡段豬均易感，尤其是產(chǎn)房7日齡以內(nèi)的仔豬，發(fā)病率和死亡率最高[1]。1971年，該病在英國(guó)被首次報(bào)道，其后在比利時(shí)、荷蘭、德國(guó)、法國(guó)、加拿大等國(guó)家陸續(xù)流行起來，給全球的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的危害[2]。自2010年的10月份以來，PEDV出現(xiàn)變異毒株，并在我國(guó)大面積流行和暴發(fā)，僅在我國(guó)南方10多個(gè)省份就引起了約100萬頭仔豬死亡。有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在2011年底，我國(guó)約100萬頭仔豬死于PED[3]。2013年美國(guó)發(fā)生豬流行性腹瀉，隨后在北美地區(qū)暴發(fā)和流行[4]。豬流行性腹瀉給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）。該病毒是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，基因組大約為28 kb，編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白是纖突糖蛋白（spike glycoprotein,S）、囊膜蛋白（envelope protein,E）、膜蛋白（membrane protein,M）、核蛋白（nucleoprotein,N）[5]。S蛋白在吸附受體細(xì)胞、膜融合及中和抗體產(chǎn)生方面起著重要作用[6]。不同毒株的S基因差異較大，故S基因不僅可以為基因工程疫苗的設(shè)計(jì)提供參考價(jià)值，也能夠作為分析不同毒株間差異的參考基因[7]。

PEDV很難在細(xì)胞上分離培養(yǎng)。1988年，Hofmann等[8]通過在培養(yǎng)基中加入胰酶的方式，利用Vero細(xì)胞成功分離PEDV。本研究旨在從臨床仔豬腹瀉樣品中分離豬流行性腹瀉病毒，并對(duì)分離毒株的S基因進(jìn)行測(cè)序分析，以期為PEDV致病機(jī)理研究和疫苗的研發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料 河南省某豬場(chǎng)產(chǎn)房腹瀉仔豬腸道組織。剪碎腸道組織，加入10倍體積生理鹽水，研磨后反復(fù)凍融3次，4℃、10 000×g離心10 min，取上清液，加入雙抗（青霉素終濃度為100 U/mL，鏈霉素終濃度為100 mg/L），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞與主要試劑 Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit購自南京諾維贊生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清（FBS）和胰酶購自Gibco公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠二抗購自Abcam公司；PEDV N蛋白單克隆抗體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.4 病原RT-PCR檢測(cè) 取200 μL樣品，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。利用HiScript ⅡOne Step RT-PCR Kit進(jìn)行RT-PCR，相應(yīng)引物鑒定豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、F/R鑒定傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和輪狀病毒（Rotavirus,RV）。反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.5 病毒分離 病毒分離方法參照文獻(xiàn)[8-9]，稍作修改。將Vero細(xì)胞傳入6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)接毒。接毒樣品事先用含有10 μg/mL胰酶的DMEM在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h。取出6孔板，用PBS洗滌2次，將處理過的樣品接種至6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，期間每隔20 min輕微晃動(dòng)一次。1 h后取出6孔板，棄掉樣品，加入含有10 μg/mL胰酶的維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～7 d，每天觀察細(xì)胞病變。

1.6 間接免疫熒光鑒定 將Vero細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞板中，接毒后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，4℃固定1 h。PBS洗滌后，加入0.1%TritonX-100作用后經(jīng)PBS洗滌，加入0.5%BSA封閉。加入PEDV N蛋白單克隆抗體（1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，PBS洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶1000稀釋），37℃孵育1 h后觀察。

1.7 S基因擴(kuò)增及測(cè)序 將S基因分為四段，分別為Sa、Sb、Sc和Sd。用相應(yīng)引物（表1）擴(kuò)增分離毒株的S基因，反應(yīng)程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送生工生物（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.8 序列分析 將測(cè)序得到的S基因和NCBI上14株國(guó)內(nèi)外的參考毒株（表2）進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。

表2 PEDV參考毒株信息Table 2 Information of PEDV reference strains

2 結(jié)果

2.1 病料核酸鑒定 RT-PCR檢測(cè)腸道樣品中豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒，結(jié)果如圖1所示，豬流行性腹瀉病毒在670 bp處出現(xiàn)了條帶，而傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒均為陰性。

圖1 RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.1 RT-PCR identification results of PEDV

2.2 病毒的分離 將檢測(cè)為陽性的病料處理后接種于單 層的Vero細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞腫脹、變圓、融合，繼而細(xì)胞脫落（圖2）。將分離得到的毒株命名為XP2018株。

圖2 分離毒株接種Vero細(xì)胞后的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathy of Vero cell inoculated with isolated strains

2.3 間接免疫熒光鑒定 將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)XP2018感染的細(xì)胞出現(xiàn)特異性的綠色熒光，熒光集中在細(xì)胞質(zhì)中，正常細(xì)胞沒有熒光。如圖3所示。

圖3 PEDV XP2018接種Vero細(xì)胞間接免疫熒光鑒定Fig.3 IFA idenfication of Vero cells infected with PEDV XP2018

2.4 S基因的擴(kuò)增 提取病毒液中總RNA，RT-PCR擴(kuò)增S基因四個(gè)片段，大小分別為1358 bp、1380 bp、1321 bp、712 bp，均在相應(yīng)位置擴(kuò)增出目的片段。如圖4所示。

2.5 S基因的遺傳進(jìn)化分析 將分離得到的XP2018毒株的S基因與NCBI上公布的國(guó)內(nèi)外流行毒株進(jìn)行繪制遺傳進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示XP2018毒株與MEX株、中國(guó)近年來流行毒株（SH、GD3、PEDV-LY、SD2014、CH-ZMDZY-11、BJ-2011-1、PEDV-15F）和美國(guó)毒株（NPL-PEDV、MN、IA1、IA2）在一個(gè)分支上，說明親緣關(guān)系也較近；XP2018毒株與韓國(guó)的毒株DR13、瑞士毒株CV777不在一個(gè)分支上。

圖4 分離株XP2018 S基因的RT-PCR結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of XP2018 S gene isolated

2.6 同源性分析 對(duì)14株P(guān)EDV的S基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性的分析（表6、表7），XP2018株與經(jīng)典毒株CV777核苷酸的同源性為94%，氨基酸同源性為93.4%；與韓國(guó)毒株DR13的核苷酸同源性為95.2%，氨基酸同源性為94.9%；與近年來中國(guó)分離的其他毒株的核苷酸同源性為98.1%～98.8%，氨基酸同源性為97.8%～98.8%；與美國(guó)的參考毒株間的核苷酸同源性為98.8%～98.9%，氨基酸同源性為98.4%～98.8%；與莫斯科毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均為98.8%。

3 討論

自2010年以來，豬流行性腹瀉給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。疫苗免疫是防控主流行性腹瀉的重要手段。盡管市面上有豬流行性腹瀉疫苗，但免疫效果不甚理想。究其原因，引起豬流行性腹瀉暴發(fā)的原因是變異毒株，傳統(tǒng)的CV777疫苗毒株對(duì)該病的防控免疫效果較差，使得部分免疫PEDV疫苗的豬場(chǎng)仍暴發(fā)PED[10]。接種來源于變異毒株的疫苗是當(dāng)前防控豬流行性腹瀉的主要手段。

圖5 PEDV S基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis based on S gene of PEDV

豬流行性腹瀉病毒的分離難度較大，受到多種因素影響，比如細(xì)胞系、樣品類型、培養(yǎng)條件等。Vero細(xì)胞是當(dāng)前豬流行性腹瀉病毒分離常用細(xì)胞系。在所有的樣品類型中，腸道內(nèi)容物可能是分離PEDV的最佳病料，先前報(bào)道的分離毒株大部分是從自然感染或試驗(yàn)接種豬的腸道內(nèi)容物中分離出來[11-15]。Hofmann等[8]研究認(rèn)為胰酶對(duì)PEDV S蛋白切割作用能夠增加病毒對(duì)Vero細(xì)胞的感染力，并利用在培養(yǎng)液中加入胰酶的方法成功分離PEDV。后人在此基礎(chǔ)上，對(duì)胰酶的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，提高了分離成功率[16-17]。本實(shí)驗(yàn)利用Vero細(xì)胞分離PEDV，前期反復(fù)優(yōu)化確定胰酶濃度為10 μg/mL，樣品來自臨床腹瀉癥狀明顯的仔豬腸道，處理后直接用于病毒分離。病料樣品接種至Vero細(xì)胞5 d出現(xiàn)CPE，并且多次傳代后CPE明顯并穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)成功分離1株P(guān)EDV，命名為XP2018株。

圖6 PEDV S基因序列同源性比對(duì)Fig.6 Homology alignment of S gene sequence

圖7 PEDV S基因序列同源性比對(duì)Fig.7 Homology alignment of S gene sequence

S蛋白是位于PEDV表面的纖突蛋白，能夠介導(dǎo)病毒結(jié)合細(xì)胞和刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。編碼S蛋白的S基因是病毒容易發(fā)生變異的主要基因，能夠很大程度上反映PEDV不同毒株遺傳變異及親緣關(guān)系[18]。

為進(jìn)一步了解XP2018毒株的特性，本研究對(duì)S基因擴(kuò)增并分析。XP2018毒株S基因全長(zhǎng)4161 bp，與經(jīng)典毒株CV777相比，存在16個(gè)堿基的插入和7個(gè)堿基的缺失。同源性分析顯示該毒株S基因與CV777氨基酸同源性為91.0%，與DR13氨基酸同源性為90.6%，而與中國(guó)近年來流行毒株和美國(guó)毒株的同源性高達(dá)96.6%～98.3%。遺傳進(jìn)化分析顯示，XP2018毒株與CV777和DR13不在同一分支，與中國(guó)近年來流行毒株和美國(guó)毒株處于同一分支。說明XP2018毒株屬于變異毒株。

綜上所述，本研究明確了該豬場(chǎng)腹瀉的病原、分離到1株豬流行性腹瀉病毒變異毒株XP2018并分析了該毒株S基因特性。該毒株對(duì)Vero細(xì)胞具有較高的適應(yīng)性，為PEDV致病機(jī)理研究和疫苗研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。