基于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不同感染狀態(tài)結(jié)核病牛血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

房立春，高新桃,2，林偉東,3，賈 紅，郭曉宇，侯邵華，姜一曈，朱鴻飛，鑫 婷

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.讓布盧農(nóng)學(xué)院 比利時(shí)烈日大學(xué)，讓布盧 4000）

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis,bTB）是一種危害嚴(yán)重的人獸共患慢性傳染病，該病主要由牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）感染引起，其主要特征是漸進(jìn)性消瘦和患病組織形成結(jié)核結(jié)節(jié)等病變[1-3]。目前世界上對于牛結(jié)核病防控主要是基于“檢測——撲殺”的策略，部分歐美發(fā)達(dá)國家已完成對該病的基本控制甚至根除[4]，但在發(fā)展中國家，由于廣泛的宿主范圍，沒有快速高通量的檢測方法，撲殺淘汰巨大的財(cái)政壓力導(dǎo)致牛結(jié)核病的防控不容樂觀。我國牛結(jié)核病缺乏國家層面上流行病學(xué)調(diào)查的直接數(shù)據(jù)，主要來自于零星報(bào)道：張喜悅等[5]報(bào)道，2018年我國北方33個(gè)縣牛結(jié)核病感染狀況樣品的個(gè)體陽性率為13.99%，群體陽性率為51.51%；韓猛等[6]報(bào)道山東省2010-2012年牛結(jié)核病陽性率分別為29.34%、27.96%和14.93%。近幾年，牛結(jié)核病的防控雖有一定進(jìn)展，但由于多種原因，我國牛結(jié)核病仍未得到有效控制。

結(jié)核病的感染與病程緩慢。目前人結(jié)核病與診斷相關(guān)的研究已經(jīng)相對成熟，根據(jù)痰液檢查是否排菌，可以將人結(jié)核病病程分為活動(dòng)期和非活動(dòng)期[7-12]。牛感染牛結(jié)核分枝桿菌后在活動(dòng)期也可以通過鼻汁、痰液和乳汁等向環(huán)境排菌，研究表明超過15%的牛分枝桿菌感染牛能向外排分枝桿菌[13]，相較于非活動(dòng)期結(jié)核病牛，活動(dòng)期結(jié)核病牛的危害更大。由OIE推薦的巢式PCR方法，通過擴(kuò)增分枝桿菌mpb70基因的特異性片段檢測牛奶、鼻液等分泌物中的病原，這是目前臨床上判定結(jié)核病牛向外是否排菌的重要手段[14]。截止到目前還沒有對牛結(jié)核病活動(dòng)期和非活動(dòng)期的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，而且對于結(jié)核病牛不同感染狀態(tài)的相關(guān)研究也鮮有報(bào)道。牛結(jié)核分枝桿菌感染后的患病機(jī)制及病理學(xué)改變會引起血清中相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子相繼發(fā)生一系列的動(dòng)態(tài)變化，不同的感染階段也具有不同的生理生化狀態(tài)，這些動(dòng)態(tài)變化的檢測可為不同感染狀態(tài)牛結(jié)核病的判定及診斷提供可能。利用血清中的標(biāo)志物檢測具有高效省時(shí)、簡單易用、高通量等其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，因此對結(jié)核病患病牛血清蛋白譜的研究具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tag for relative and absolute quantitation,iTRAQ）是一種具有高通量和高靈敏度的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于人結(jié)核病的早期診斷、治療監(jiān)測和評估預(yù)后[15-16]，在動(dòng)物疫病上的應(yīng)用也有報(bào)道[17-18]，但在牛結(jié)核病的相關(guān)研究中應(yīng)用較少。而平行反應(yīng)監(jiān)測（parallel reaction monitoring,PRM）是一種靶向的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，具有選擇性高、靈敏度佳和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是理想的差異蛋白質(zhì)驗(yàn)證手段[19]。本研究以核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)（tuberculin skin test,TST）、IFN-γ釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay,IGRA）從臨床篩選結(jié)核病陽性牛和陰性牛，再以PCR方法檢測結(jié)核病陽性牛鼻液中牛結(jié)核分枝桿菌的抗原判定結(jié)核陽性牛是否處于排菌期。然后，利用iTRAQ技術(shù)和生物信息學(xué)手段，從不同感染狀態(tài)結(jié)核病牛的血清蛋白質(zhì)入手，篩選、剖析差異表達(dá)蛋白，然后以PRM方法對篩選的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以期尋找到牛結(jié)核病不同感染階段的關(guān)鍵蛋白并闡明不同病程的機(jī)體應(yīng)答生理機(jī)制差異，最終為牛結(jié)核病的診斷和防控提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩 選與分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所結(jié)核病與寵物疫病診斷實(shí)驗(yàn)室完成。從結(jié)核病流行牛場和連續(xù)5年結(jié)核病陰性牛場中分別篩選結(jié)核病陽性、陰性荷斯坦奶牛（核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)。IFN-γ釋放試驗(yàn)參照BovigamTM試劑盒說明書），并按照牛鼻拭子巢式PCR對結(jié)核病陽性牛進(jìn)行亞分類，同時(shí)排除牛副結(jié)核?。↖DEXX公司抗體檢測試劑盒）、牛布魯菌?。⊿vanova公司布魯氏菌病C-ELISA試劑盒）以及牛病毒性腹瀉（IDEXX公司抗體ELISA檢測試劑盒）抗體陽性牛的影響。篩選標(biāo)準(zhǔn)和分組見表1。

表1 結(jié)核病牛判定標(biāo)準(zhǔn)及分組Table 1 Standard and grouping of criteria for determination of bovine tuberculosis

1.2 血清樣品的制備 60頭實(shí)驗(yàn)牛經(jīng)尾根采血收集全血于6 mL促凝管中，血樣經(jīng)4000 ×g離心10 min，收集上層血清于1.5 mL離心管中。為降低奶牛個(gè)體差異的影響，試驗(yàn)選擇混合樣本的方法進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)。在PCR陽性結(jié)核病陽性（TBP組，n=20）、PCR陰性結(jié)核病陽性（TBN組，n=20）和健康牛（NC組，n=20）三組中，每組隨機(jī)選取10份血清按等量蛋白濃度混合均勻，每組有兩個(gè)混合樣品（TBP組：TBP1、TBP2；TBN組：TBN1、TBN2；NC組：NC1、NC2）。

1.3 主要試劑及材料 iTRAQ Reagent-8Plex標(biāo)記試劑盒購自Applied Biosystem公司；ProteoMiner?蛋白質(zhì)濃縮試劑盒購自Bio-Rad公司；高效DINOEX Ultimate 3000 BioRS液相色譜系統(tǒng)、MULTISCAN SPECTRUM 1500酶標(biāo)儀、Legend Micro17R冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；TripleTOF 5600+ LC-MS/MS質(zhì)譜系統(tǒng)、ChromXP C18分析柱購自AB SCIEX公司；Durashell C18 色譜柱購自Agela公司。

1.4 iTRAQ定量蛋白組學(xué)和 PRM 靶向蛋白驗(yàn)證

1.4.1 蛋白抽提及定量 參照文獻(xiàn)[20]提取蛋白，向離心管內(nèi)加入DTT至終濃度10 mmol/L，56℃水浴1 h后立即加入IAM至終濃度55 mmol/L，然后置于暗室放置1 h。所得上清液根據(jù)蛋白質(zhì)濃縮試劑盒說明進(jìn)行血清中低豐度蛋白的富集和高豐度蛋白的去除， 最后使用bradford法定量檢測高豐度蛋白去除前后的血清蛋白樣品。

1.4.2 樣品的酶解、iTRAQ標(biāo)記蛋白及HPLC分級 選取100 μg蛋白質(zhì)，體積整體調(diào)節(jié)到100 μL，加入500 μL（50 mmol/L）NH4HCO3稀釋，以1∶50的質(zhì)量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，37℃酶解過夜；取出上述酶解液，加入等體積的0.1%FA酸化；酸化后的酶解液加入到平衡后的Strata-X C18柱子中，連續(xù)過柱3次；然后加入0.1%FA+5%乙腈清洗Strata-X C18柱子，連續(xù)清洗2次；最后取一個(gè)新的離心管，用1 mL 0.1%FA+80%乙腈洗脫1次，洗脫液經(jīng)冷凍抽干后用20 μL 0.5 mol/L TEAB復(fù)溶。采用 8-plex標(biāo)記，方法參考iTRAQ試劑盒操作說明。以0.5 mol/L TEAB肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Durashell C18（5 μm，100 ?，4.6×250 mm）。

1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析及差異蛋白篩選 由緩沖液A（5%乙腈、0.1%甲酸、95%H2O）和緩沖液B（95%乙腈、0.1%甲酸、5%H2O）構(gòu)成流動(dòng)相，將已分級的樣品上樣到Triple TOF 5600 plus質(zhì)譜儀（AB SCIEX nanoLC-MS/MS）進(jìn)行質(zhì)譜序列測定，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。我們使用與AB Sciex 5600 plus配套的搜索引擎ProteinpilotTMV4.5對質(zhì)譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索和篩選，同時(shí)根據(jù)差異倍數(shù)和P值來篩選出差異蛋白。當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)1.5倍及以上（即上調(diào)倍數(shù)≥1.5和下調(diào)倍數(shù)≤0.67），且經(jīng)過顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P≤0.05時(shí)，視為顯著差異蛋白。

1.4.4 PRM靶向蛋白驗(yàn)證 采用平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)對iTRAQ結(jié)果進(jìn)行靶向蛋白驗(yàn)證。蛋白制備的方法與iTRAQ方法類似，每個(gè)樣品用含0.1%甲酸和3%乙腈的上樣緩沖液進(jìn)行溶解，離心后取上清液點(diǎn)樣。經(jīng)DDA質(zhì)譜檢測后，將Proteome Discoverer數(shù)據(jù)庫檢索的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Skyline軟件建立譜圖庫（spectra libr ary）。在譜圖庫中篩選靶蛋白的肽段，將靶肽段質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)比值（m/z）加入到inclusion list中，然后使用該P(yáng)RM模式對混合樣品進(jìn)行PRM數(shù)據(jù)采集。

1.5 生物信息學(xué)分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對鑒定到的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋GO（gene ontology），并對顯著性差異蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集分析。同時(shí)，利用KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異蛋白通路富集分析，最后對差異蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS軟件（IBM，V20.0）對組間差異蛋白比值應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白定量 高豐度蛋白去除前后蛋白定量結(jié)果如表2所示，從定量結(jié)果來看，本實(shí)驗(yàn)所獲得的3個(gè)不同組別共6份血清樣品（TBP1、TBP2、TBN1、TBN2、NC1、NC2）的總蛋白的提取以及高豐度蛋白的去除成功。

表2 高豐度蛋白去除前后血清樣本蛋白定量結(jié)果Table 2 Concentrations of serum protein before and after deletion of high abundant proteins

2.2 iTRAQ鑒定血清差異蛋白 根據(jù)差異倍數(shù)≥1.5或者≤0.67倍，P≤0.05，同時(shí)剔除未知功能蛋白的條件，我們得到兩兩組間已知的差異蛋白，數(shù)量統(tǒng)計(jì)見表3。由表3可知，TBP/TBN組共鑒定到的顯著性差異蛋白74個(gè)，其中上調(diào)蛋白46個(gè)，下調(diào)蛋白28個(gè)；TBP/NC組和TBN/NC組分別鑒定到195和216個(gè)顯著性差異蛋白，將兩組數(shù)據(jù)合并得到TB/NC組，共得到223個(gè)顯著性差異蛋白，其中上調(diào)112個(gè)，下調(diào)111個(gè)。可見，不同感染狀態(tài)結(jié)核病牛各組間呈現(xiàn)出數(shù)量較多的差異蛋白。

表3 兩兩組間蛋白顯著性差異數(shù)量Table 3 Numbers of differentially expressed proteins in pair-wise comparisons

2.3 PRM驗(yàn)證 由表4可知，在6個(gè)目的蛋白的PRM驗(yàn)證中，由于方法敏感性的提高，部分iTRAQ結(jié)果未鑒定到的顯著性差異蛋白在PRM中被鑒定出來。PRM驗(yàn)證結(jié)果在整體趨勢上與iTRAQ結(jié)果基本一致，但是各組間差異倍數(shù)相較于iTRAQ結(jié)果有不同程度的降低。

表4 PRM驗(yàn)證用血清差異蛋白Table 4 Serum differentially expressed proteins selected for PRM verification

2.4 血清差異蛋白生物信息學(xué)分析 為了更好地解釋和剖析牛結(jié)核病不同感染狀態(tài)之間血清差異蛋白譜，我們對處于排菌期的結(jié)核病陽性牛（TBP組）和非排菌期的結(jié)核病陽性牛（TBN組）的血清差異蛋白，以及結(jié)核病陽性牛（TB組）與健康牛組（NC組）間血清差異蛋白進(jìn)行了注釋，同時(shí)完成了生物信息學(xué)分析。

2.4.1 TBP/TBN組差異蛋白GO與KEGG富集分析 由TBP/TBN組血清差異蛋白GO富集分析可知，在生物學(xué)進(jìn)程方面組間差異蛋白主要參與凝血和纖維蛋白凝塊形成，血小板激活和蛋白質(zhì)聚合；在分子功能方面主要具有結(jié)構(gòu)分子活性，受體結(jié)合以及肝素結(jié)合等功能；在細(xì)胞組分方面主要是定位于胞外區(qū)、外泌體和血液微粒。TBN/TBN組間血清差異蛋白共富集在5條KEGG通路上（P≤0.05），其中補(bǔ)體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cascades）富集顯著性最強(qiáng)（P=6.85E-14）且富集差異蛋白數(shù)目最多（（12/74），見圖1A。

2.4.2 TB/NC組差異蛋白GO與KEGG富集分析 由TB/NC組血清差異蛋白GO富集分析可知，在生物學(xué)進(jìn)程上組間差異蛋白主要參與血小板聚集，細(xì)胞間黏附和內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控；在分子功能方面主要具有鈣離子結(jié)合，鈣粘蛋白結(jié)合參與細(xì)胞間黏附和肝素結(jié)合等功能；差異蛋白在細(xì)胞組分上與TBP/TBN組相似，主要定位于細(xì)胞外泌體，胞外空間和血液微粒。TB/NC組間血清差異蛋白共富集在18條KEGG通路上（P≤0.05），其中補(bǔ)體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cascades）、局灶性黏連（focal adhesion）和血小板激活途徑（platelet activation）富集顯著性較強(qiáng)，見圖1B。

圖1 差異蛋白GO功能分析和KEGG通路分析Fig.1 GO functional analysis and KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins

2.4.3 差異蛋白互作分析 將組間血清差異蛋白進(jìn)一步用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白互作關(guān)系如圖2所示。結(jié)果表明，鑒定到的血清差異蛋白絕大部分被互作網(wǎng)絡(luò)覆蓋，表明具有較好的生物學(xué)聯(lián)系，少數(shù)游離于互作網(wǎng)絡(luò)之外蛋白的可能由于功能相對獨(dú)立或者與其他蛋白互作的可信度不高導(dǎo)致，TBP/TBN和TB/NC組的KEGG通路分析均表明，差異蛋白在補(bǔ)體和凝血級聯(lián)這一通路中不僅顯著性最強(qiáng)，而且富集的蛋白數(shù)目最多；TBP/TBN以及TB/NC組間差異蛋白的STRING蛋白互作關(guān)系同樣證實(shí)了這一現(xiàn)象（圖2A、2B），紅色方框內(nèi)表明補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路中的差異蛋白互作關(guān)系，且該通路模塊位于互作網(wǎng)絡(luò)中較為核心的位置，紅色圈內(nèi)表示上調(diào)表達(dá)蛋白，藍(lán)色圈內(nèi)表示下調(diào)表達(dá)蛋白。

圖2 蛋白質(zhì)互作分析Fig.2 Analysis for protein interactions

3 討論

牛感染結(jié)核分枝桿菌后主要通過免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)對入侵的病原體進(jìn)行防御，結(jié)核分枝桿菌在感染宿主過程中必然改變宿主蛋白質(zhì)的表達(dá)或者改變蛋白質(zhì)的相互作用，這些蛋白的改變則能夠反應(yīng)患病的狀態(tài)。本研究利用iTRAQ技術(shù)對牛結(jié)核病不同感染狀態(tài)下血清差異蛋白進(jìn)行了分析，對比發(fā)現(xiàn)結(jié)核病陽性牛與健康牛間共鑒定到223個(gè)顯著性差異蛋白，在結(jié)核病陽性牛按照是否處于排菌期判定的兩個(gè)亞分類（TBP/TBN）間鑒定到74個(gè)顯著性差異蛋白。通過PRM對部分蛋白靶向驗(yàn)證，結(jié)果與iTRAQ結(jié)果趨勢一致，證實(shí)了差異蛋白篩選的可靠性。因此本研究證實(shí)了結(jié)核病牛在患病后血清蛋白出現(xiàn)了巨大的變化，并且在排菌與非排菌兩個(gè)病癥下血清蛋白也出現(xiàn)了顯著的變化，這些差異蛋白譜均反映了牛結(jié)核病不同感染狀態(tài)內(nèi)的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)和病理機(jī)制。

在差異蛋白生物信息學(xué)分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象。不管TB/NC組還是TBP/TBN組，補(bǔ)體與凝血級聯(lián)這一通路中不僅富集到的差異蛋白數(shù)目最多而且顯著性也最強(qiáng)。

補(bǔ)體系統(tǒng)作為宿主一種重要的生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)，廣泛參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，介導(dǎo)免疫溶菌和溶血作用，同時(shí)也是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁[21]。動(dòng)物患病時(shí)其總補(bǔ)體含量或單一補(bǔ)體分子含量可發(fā)生改變，因此對體液中補(bǔ)體水平的測定，在疫病的診斷中具有一定意義。在本研究中，相對NC組，TB組的C4A、C6、C8B和CFH等補(bǔ)體分子均顯著上調(diào)表達(dá)（圖2），補(bǔ)體分子C4上調(diào)表達(dá)可以趨化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)對病原體的吞噬作用；補(bǔ)體分子C6、C8等作為免疫溶菌的效應(yīng)分子，其上調(diào)表達(dá)表明機(jī)體對結(jié)核桿菌感染的靶細(xì)胞的溶解破壞作用增強(qiáng)。以上表明結(jié)核病病牛補(bǔ)體系統(tǒng)被廣泛的激活，補(bǔ)體系統(tǒng)在機(jī)體抗菌過程中發(fā)揮了重要作用。相對TBN組，TBP組以C1QA和C1QC為代表的補(bǔ)體分子也顯著性上調(diào)（圖2），補(bǔ)體分子C1是經(jīng)典激活途徑中的起始識別成分，C1分子在排菌期的結(jié)核病病牛中較非排菌期表達(dá)量顯著上調(diào)，表明機(jī)體正處于對抗原進(jìn)行識別的階段，據(jù)此推斷排菌期可能是結(jié)核病病程的早期階段。值得注意的是，已有研究表明C1Q在活動(dòng)性結(jié)核病病人外周血中的表達(dá)量顯著高于潛伏性病人和健康對照組[22]，我們的結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)一致，這表明C1Q的表達(dá)量在結(jié)核病病人與結(jié)核病病牛中是一致的。綜上，結(jié)核病病牛機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)在不同感染狀態(tài)下以不同的途徑被全面激活，說明在天然防御系統(tǒng)中，特別是在感染的早期，補(bǔ)體系統(tǒng)起著重要的作用。結(jié)核分枝桿菌作為胞內(nèi)感染菌，雖然能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，但抗體只能與釋放出的細(xì)菌接觸起輔助作用，因此結(jié)核桿菌的免疫殺傷主要依靠吞噬作用以及細(xì)胞因子的殺傷作用。本研究表明結(jié)核桿菌感染后補(bǔ)體系統(tǒng)被廣泛激活，但補(bǔ)體系統(tǒng)和結(jié)核桿菌之間的相互作用以及補(bǔ)體系統(tǒng)如何發(fā)揮抗結(jié)核作用，仍需要進(jìn)一步研究。

針對凝血系統(tǒng)，研究人員在活動(dòng)性肺結(jié)核凝血改變的研究中發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原含量的增加可誘導(dǎo)高凝狀態(tài)，而且結(jié)核病患者比健康人群更容易發(fā)生內(nèi)源性的凝血[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，牛感染結(jié)核桿菌后凝血系統(tǒng)的促凝血途徑和抗凝血途徑發(fā)生了紊亂。一方面，結(jié)核病感染牛的重要的凝血因子纖維蛋白原（Fibrinogen）顯著低于健康牛，具有抑制凝血酶合成的抗凝血因子-維生素K依賴性蛋白S（vitamin K-dependent protein S,PROS）顯著高于健康牛，呈現(xiàn)出抗凝血的作用；另一方面，結(jié)核病感染牛的促凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、ⅩⅢ均顯著高于健康牛，呈現(xiàn)出了疑似高凝血狀態(tài)。

人結(jié)核病容易出現(xiàn)高凝血狀態(tài)的現(xiàn)象與本研究牛結(jié)核病凝血系統(tǒng)的紊亂失調(diào)存在矛盾。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為凝血系統(tǒng)和免疫補(bǔ)體系統(tǒng)二者無關(guān)聯(lián)，但最近發(fā)現(xiàn)，先天性免疫和凝血系統(tǒng)相互作用，在病理或應(yīng)激條件下存在相互聯(lián)系，共同協(xié)調(diào)防御病原體侵入和對機(jī)體造成的傷害[24]。因此我們懷疑牛結(jié)核病凝血系統(tǒng)紊亂與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有關(guān)。多種細(xì)胞因子（包括補(bǔ)體）可直接或間接激活機(jī)體凝血系統(tǒng)，干擾抗凝系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體凝血功能的失調(diào)。結(jié)核分枝桿菌和宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)相互作用而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞合成大量的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)纖溶系統(tǒng)激活，導(dǎo)致凝血因子上升[25]。本研究中的C4a和C6等補(bǔ)體因子水平顯著升高，補(bǔ)體系統(tǒng)過度活化，凝血因子也加重被消耗，則可能是導(dǎo)致結(jié)核病牛凝血因子低于健康牛的原因?？傊到y(tǒng)在牛結(jié)核病感染過程當(dāng)中所發(fā)揮的作用極其復(fù)雜，本研究僅僅是說明了這一現(xiàn)象，其中涉及的機(jī)理仍需進(jìn)一步的探索。

本研究結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲取了不同感染狀態(tài)結(jié)核病病牛血清差異蛋白譜，并構(gòu)建了可視化的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究數(shù)據(jù)顯示了結(jié)核病病牛在不同感染狀態(tài)血清差異蛋白主要與補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)有關(guān)。本研究提供了新的角度來認(rèn)識牛結(jié)核病的不同的發(fā)展階段，為牛結(jié)核分枝桿菌與宿主之間的相互關(guān)系及演變規(guī)律提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為牛結(jié)核病的臨床診斷提供一定的客觀依據(jù)，服務(wù)于我國牛結(jié)核病的防控。