豬TREX1基因的真核表達及其在JEV感染中的作用研究

Safdar Anum，李 慧，李壯壯，相 笑，魏建超，劉 珂，邵東華，李蓓蓓，馬志永，邱亞峰

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

人TREX1（three prime repair exonuclease 1）于1999年首次被發(fā)現(xiàn)，由314個氨基酸組成（分子量約為32 kDa），分為兩個功能域：N末端包含核酸外切酶活性的元件；C末端與細胞質(zhì)的定位相關[1]。TREX1是哺乳動物細胞中重要的3′-5′的核酸外切酶，廣泛地表達于各種細胞，在細胞中該蛋白主要分布于細胞質(zhì)中[2]。在細胞內(nèi)，TREX1通過核酸外切酶的活性清理殘留的DNA片段，發(fā)揮調(diào)控細胞內(nèi)DNA穩(wěn)態(tài)的作用。相反，TREX1基因突變或缺失導致TREX1功能減弱或消失，從而促進DNA片段的沉積?，F(xiàn)有研究顯示，TREX1功能缺陷與自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erthematosus,SLE）[3]和阿拉吉耶綜合征（Alagiye syndrome,AGS）[4]等相關，這與TREX1負調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生相關[5]。在正常情況下，TREX1抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，其具體的機制為：TREX1降解細胞質(zhì)中的DNA，繼而抑制模式識別受體（pattern recognition receptors,PRR）的激活，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[6]。

盡管TREX1負調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生是其抑制自身免疫病的重要機制，但是，Ⅰ型干擾素在抗病毒反應中起著重要的作用[7-9]。已有研究顯示，TREX1抑制HIV感染導致的干擾素[10]。除此之外，TREX1還參與其他病毒的感染，如流感病毒、仙臺病毒和西尼羅熱病毒，有意思的是，TREX1可通過Ⅰ型干擾素非依賴的途徑抑制這些RNA病毒的感染[11]。因此，TREX1通過干擾素依賴的和非依賴的途徑參與宿主先天性抗病毒反應的調(diào)控。

我們感興趣于豬TREX1在病毒感染中的作用，同時，實驗室前期的研究結果顯示，JEV感染上調(diào)TREX1的表達。因此，已發(fā)表的結果以及我們的前期結果促使我們假想豬TREX1在JEV感染中起著重要的作用。然而，目前關于豬TREX1的研究還非常有限，對于其表達特征以及生物學功能還不清楚。本研究聚焦于豬TREX1的真核表達以及其在JEV感染中的作用研究，以期揭示TREX1在JEV感染中的作用，也為研究豬TREX1在其他病毒感染中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達載體p3xFlag-CMV-14、293T細胞、PIEC細胞、BHK-21細胞由本實驗室保存；DNA marker、DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白預染marker、鼠抗Flag一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗購自Abcam公司；Lipofectamine 2000、胎牛血清、雙抗、DMEM購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN；TRIzol試劑、PrimeScript? RT Master Mix （Perfect Real Time）、TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ （Tli RNaseH Plus）、限制性內(nèi)切酶均購自寶日醫(yī)生物技術有限公司。

1.2 真核表達載體的構建、轉染及表達鑒定

1.2.1 真核表達載體的構建 根據(jù)豬TREX1基因的序列（GenBank登錄號：XM_021070628.1）設計引物（Sense：5′-TATAAAGCTTATGGGCTCGCAGGCC CTGCC-3′；Anti-sense：5′-AGTCGGATCCATGCC CAGGTATGGCTATGG-3′），以豬肺泡巨噬細胞的總RNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得豬TREX1基因的ORF（去掉終止密碼），利用HindⅢ和BamHⅠ為酶切位點將其克隆入p3xFlag-CMV-14真核表達載體中，構建重組表達質(zhì)粒pFlag-pTREX1。

1.2.2 重組質(zhì)粒的瞬時轉染 質(zhì)粒提取以及瞬時轉染方法參見參考文獻[12]。利用QIAGEN plasmid Midi kit制備p3xFlag-CMV-14和pFlag-pTREX1，并用于后續(xù)的轉染。于轉染前1 d，將293T細胞鋪到6孔板中，當細胞長至70%～80%滿時，利用Lipofectamine 2000將p3xFlag-CMV-14和pFlag-pTREX1分別瞬時轉染入293T細胞，于轉染24 h后收取細胞樣品，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blot檢測 配制12%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE，濕轉2 h轉印至NC膜，5%脫脂乳室溫搖床封閉1 h，棄去封閉液TBST漂洗后加入稀釋好的鼠抗Flag抗體（1∶3000），4℃搖床孵育過夜，回收抗體后加TBST置室溫搖床漂洗10 min，重復洗3次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗（1∶5000），室溫搖床孵育1 h，棄去抗體加TBST置室溫搖床漂洗10 min，重復洗3次，暗室中進行顯影。

1.2.4 過表達與TCID50分析 PIEC細胞長至70%～80%滿時，根據(jù)上述的方法將p3xFlag-CMV-14和pFlagpTREX1轉染如PIEC中，于轉染后12 h，感染JEV（1 MOI），于感染后24 h收獲細胞上清液和細胞。細胞樣品根據(jù)上述的Western blot方法進行蛋白分析；細胞上清液進行TCID50分析[13]。

1.2.5 RNA干擾與熒光定量PCR 根據(jù)豬TREX1基因的序列進行設計，共獲得3條特異的siRNA，利用LipofectamineTMRNAiMAX進行轉染，于轉染后48 h感染JEV NJ2008毒株[14]（1 MOI），于感染后24 h收獲細胞上清液和細胞。利用TRIzol試劑裂解細胞，根據(jù)說明書進行總RNA的提取，利用反轉錄試劑盒制備cDNA。參考文獻[12]方法進行熒光定量PCR分析[12]，相對表達量通過與內(nèi)標GAPDH進行比對獲得。

2 結果

2.1 表達豬TREX1基因的真核表達載體的構建及表達檢測 將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后克隆到p3xFlag-CMV-14真核表達載體中，獲得的重組質(zhì)粒pFlag-pTREX1。利用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，可見兩條大小分別約為6300 bp及950 bp的片段，與預期結果一致（圖1）。此外，對陽性質(zhì)粒進行測序驗證，結果顯示豬TREX1基因成功插入p3xFlag-CMV-14真核表達載體中。隨后，利用Western blot對Flag-pTREX1的表達進行了分析，具體為將重組表達質(zhì)粒pFlag-pTREX1與pFlag-vector分別轉染293T細胞，24 h后收取細胞總蛋白進行Western blot分析，利用抗Flag標簽抗體鑒定Flag-pTREX1的表達。結果顯示，轉染pFlag-pTREX1的樣品組在約35 kDa處出現(xiàn)特異性的條帶（圖2），F(xiàn)lag-vector的樣品組沒有出現(xiàn)條帶。說明重組蛋白Flag-pTREX1獲得成功表達。

圖1 pFlag-pTREX1重組載體的雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion of pFlag-pTREX1

圖2 真核表達載體pFlag-pTREX1的Western blot表達鑒定Fig.2 Western blot of expression of pFlag-pTREX1

2.2 過表達豬TREX1基因?qū)EV感染的影響 為了探討豬TREX1在JEV感染中的作用，首先，通過過表達Flag-pTREX1分析豬TREX1對JEV感染的影響，Western blot的結果顯示，pFlag-pTREX1在PIEC上獲得有效表達，同時，與vector組相比，過表達豬TREX1增加JEV NS3的表達（圖3A）。進一步，利用TCID50對病毒的滴度進行了分析，結果顯示，與vector組相比，過表達豬TREX1增加JEV感染（圖3B），這與Western blot的結果相符。因此，過表達豬TREX1促進JEV的感染。

圖3 過表達豬TREX1對JEV感染的影響分析Fig.3 Analysis of the effect on JEV infection by overexpression of porcine TREX1

2.3 豬TREX1基因knock-down對JEV感染的影響 為了進一步探討TREX1在JEV感染中的作用，我們利用RNA干擾技術沉默TREX1基因的表達，驗證TREX1在JEV感染中的作用。qPCR檢測的RNA干擾效率結果顯示，在病毒感染組，基因特異的siRNA可以有效地沉默TREX1基因的表達（圖4A）。另外，JEV感染可以有效增加TREX1基因的表達（圖4A），這與我們前期觀察到的結果相符。此外，對病毒感染情況的分析結果顯示，與感染的NC組相比，沉默TREX1基因的表達顯著抑制JEV E基因的表達（圖4B）。以上結果表明，沉默豬TREX1基因的表達抑制JEV在PIEC上的感染。

圖4 沉默豬TREX1基因?qū)EV感染的影響分析Fig.4 Analysis of the effect of porcine TREX1 on JEV infection by RNA interference

3 討論

本研究率先利用真核表達系統(tǒng)研究了豬TREX1基因的表達特點，并初步鑒定了豬TREX1能促進JEV的感染。首先，我們將編碼314氨基酸的豬TREX1基因克隆入真核表達載體p3xFlag-CMV-14中，通過瞬時轉染及Western blot檢測豬TREX1的表達特點。隨后，通過過表達揭示了豬TREX1有利于JEV的感染。最后，通過RNA干擾揭示了JEV通過上調(diào)豬TREX1基因的表達促進JEV的感染。

根據(jù)我們克隆的豬TREX1基因的序列，推導獲得氨基酸的序列。首先，序列分析的結果顯示豬TREX1中也包含有3個核酸外切酶保守的基序即ExoⅠ、ExoⅡ及Exo Ⅲ（數(shù)據(jù)未顯示）[1]。進一步，對編碼的蛋白分子量預測，結果顯示豬TREX1約為33 kDa。分析結果顯示重組融合蛋白Flag-pTREX1的分子量約為35 kDa（圖2），這與預測的結果吻合。由于目前還沒有針對豬TREX1的特異抗體，因此，豬TREX1在不同組織中的表達特征需要進一步研究。

TREX1作為3′-5′核酸外切酶，通過降解細胞質(zhì)中的DNA負調(diào)控先天性免疫反應，即TREX1可以通過干擾素依賴的或非依賴的途徑負調(diào)控先天性抗病毒反應[10-11]。前期研究結果顯示JEV感染上調(diào)TREX1的表達，本研究結果進一步證實JEV感染增加豬TREX1的表達。雖然目前關于豬TREX1是否參與JEV感染還不清楚，但本研究結果顯示，過表達豬TREX1促進JEV的感染，相反，沉默豬TREX1基因的表達抑制JEV的感染，本研究結果提示，豬TREX1基因可能通過負調(diào)控先天性抗病毒反應促進JEV的感染?？傊?，本研究初步鑒定了豬TREX1基因的表達特點，并揭示了豬TREX1促進JEV的感染。然而目前，對豬TREX1促進JEV感染的機制不清楚，這需要將來進一步的研究。此外，除了JEV外，是否豬TREX1也參與其他病毒的感染，也需要進一步的研究。因此，本研究不僅為揭示豬TREX1基因在病毒感染中的作用奠定基礎，而且為理解病毒和宿主的相互作用奠定基礎。