小鼠雙光子激光掃描顯微鏡活體成像窗口構(gòu)建技術(shù)

李娟，關(guān)苑君，梁翠莎，張嵐嵐，吳玨珩

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510080

前言

雙光子激光掃描顯微鏡結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)，以紅外飛秒激光作為光源，使用高能量脈沖激光器，具有高峰值能量和低平均能量的特點(diǎn)，可深入組織內(nèi)部非線(xiàn)性地激發(fā)熒光，成像不需針孔，非焦平面外熒光分子不被激發(fā)，成像亮度和信噪比高，且光漂白只在焦平面產(chǎn)生。此外，因采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)，散射較小，易穿透樣本；且近紅外光對(duì)細(xì)胞毒性小。雙光子顯微鏡基于組織器官穿透性深、光漂白及光毒性低等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),相比單光子顯微鏡更適用于厚標(biāo)本及活體組織的觀察和成像，目前已成為生命科學(xué)各領(lǐng)域的重要研究工具［1］。

目前小動(dòng)物雙光子活體光學(xué)成像在神經(jīng)科學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)、腫瘤治療、免疫學(xué)、干細(xì)胞應(yīng)用等研究領(lǐng)域中有廣泛應(yīng)用。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，感知覺(jué)、行為、學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知活動(dòng)以及疾病損傷相關(guān)研究中，大量實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)［2-6］、離子濃度［7-10］、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［11-12］、分子相互作用［13-15］等生理現(xiàn)象和過(guò)程進(jìn)行成像監(jiān)測(cè)、神經(jīng)-膠質(zhì)-血管構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)通訊成像［16-17］以及光漂白［18］、光刺激［19］、光損傷［20］等光學(xué)操縱。在癌癥診斷與病理學(xué)研究中，很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)通過(guò)多色雙光子活體光學(xué)成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并對(duì)治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估［21-23］。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，雙光子活體成像技術(shù)在免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)監(jiān)測(cè)［24-25］、免疫細(xì)胞間的相互作用［26-27］、免疫應(yīng)答分子細(xì)胞機(jī)制研究［28-30］等方面有廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用雙光子成像技術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞研究主要集中在監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的移植，示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和遷移等［31-33］。此外，雙光子活體成像技術(shù)也應(yīng)用于小鼠其他組織如皮膚［34］、眼睛［35］、肌肉［36］、胃腸［37］等的活體觀察成像以及斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育監(jiān)測(cè)［38］等方面。

對(duì)于雙光子光學(xué)活體成像，由于光散射，目前成像深度≤1 mm［39］。器官的可視化僅限于淺表組織如皮膚，其他臟器的在體成像則一般需手術(shù)暴露成像部位。而暴露器官成像需要進(jìn)行侵入性手術(shù)，并從解剖位置操作器官，這些操作使實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間限制在36 h內(nèi)［40］。然而，大多數(shù)的生理和病理過(guò)程發(fā)生在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)。需連續(xù)幾天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)同一只動(dòng)物多次成像。因此雙光子活體成像除了熒光標(biāo)記技術(shù)，待觀察組織的暴露及固定技術(shù)非常重要。此外，正置雙光子顯微鏡配置紅外專(zhuān)用水鏡，物鏡角度不可調(diào)節(jié)，小鼠活體成像過(guò)程中會(huì)因穩(wěn)定性不足發(fā)生抖動(dòng)，樣品與物鏡間的水缺失以及活體動(dòng)物自身的呼吸和心跳等影響因素也會(huì)造成圖像成像焦面的丟失。因此對(duì)于動(dòng)物成像部位的維持與固定有非常高的要求，固定裝置不能對(duì)動(dòng)物有太大的損傷，既要保證能夠得到清晰的圖像，還要保證動(dòng)物生命體征正常。

目前已有多項(xiàng)研究通過(guò)構(gòu)建和使用雙光子活體成像窗口，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同臟器進(jìn)行固定和長(zhǎng)期成像。其中腦部顱骨薄窗成像技術(shù)較為成熟，因其位置優(yōu)勢(shì)，前處理和固定相對(duì)較容易，結(jié)合熒光標(biāo)記物已廣泛應(yīng)用于腦神經(jīng)科學(xué)相關(guān)研究。腹部器官如肝臟、淋巴組織、腸、脾臟和腎等都很軟且血管密布，由于解剖位置不同，缺乏可以固定成像窗的骨骼結(jié)構(gòu)，給窗口適配器的固定增加了難度；而且腹部臟器普遍離心臟較近，拉伸距離有限，更需要較好的固定和麻醉來(lái)抵抗心跳造成的圖像抖動(dòng)。因此腹部器官的活體成像更具挑戰(zhàn)性。

除了小鼠頭部固定適配器器已有商業(yè)化產(chǎn)品，其他固定適配器均需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)自制或定制。商業(yè)化的頭部固定適配器，如Narishige 成茂公司的MAG-2 Head Holding Device，成本較高。目前自制的各種雙光子活體成像窗口維持與固定裝置，通過(guò)多次活體動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定性與適用性均達(dá)到科研要求，并且成本低廉，使用方便，具有更強(qiáng)的通用性和拓展性，可廣泛應(yīng)用于各相關(guān)研究領(lǐng)域。

1 腦活體成像的薄顱窗

小鼠大腦中的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)的活體成像已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)研究。Yang等［41］建立活鼠顱骨薄窗活體成像方案，通過(guò)創(chuàng)建一個(gè)顱骨厚度為20 μm 的薄顱顱窗來(lái)對(duì)皮層的熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像（圖1）。手術(shù)可在30～45 min 內(nèi)完成，術(shù)后可立即成像，幾天至數(shù)月中可重復(fù)多次成像。顱骨薄窗成像避免了腦膜和皮質(zhì)的暴露，為研究正常和病理?xiàng)l件下活腦細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化提供了一種微創(chuàng)方法。該技術(shù)通過(guò)膠水將成像區(qū)域固定在定制的顱骨固定器的內(nèi)部開(kāi)口上，形成閉合水槽［42］。在解剖鏡下，用顱骨鉆打磨成像圓形區(qū)域（直徑為0.5～1.0 mm），獲得中心約20 μm 厚度的成像區(qū)域（直徑約200 μm）。利用雙光子顯微鏡對(duì)顱骨進(jìn)行自熒光成像，可直接測(cè)量顱骨厚度。若二次成像，則刮除成像區(qū)域上重新生長(zhǎng)的結(jié)締組織，或使用刀片仔細(xì)刮除顱骨直到獲得清晰圖像。

圖1 活鼠顱骨薄窗成像Figure 1 Thinned-skull cranial window imaging for live mice

顱骨薄化技術(shù)的難度主要在于顱骨厚度和均勻度，均勻地達(dá)到最佳厚度需要大量的手術(shù)實(shí)踐。不均勻的顱骨厚度可能導(dǎo)致球面像差，從而導(dǎo)致深處結(jié)構(gòu)的雙光子激發(fā)減弱和畸變。同時(shí)，要確保在顱骨變薄區(qū)域下的表層皮層沒(méi)有發(fā)生手術(shù)引起的皮質(zhì)損傷，打磨區(qū)域過(guò)大（面積直徑＞300 μm）、厚度過(guò)?。ǎ?5 μm）可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)結(jié)構(gòu)混亂、激活免疫細(xì)胞等。輕微腦外傷或出血會(huì)引起炎癥和神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞，影響后續(xù)成像質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

除薄顱骨技術(shù)外，還可以通過(guò)開(kāi)顱骨窗觀察皮質(zhì)［43］。不過(guò)相對(duì)于薄顱骨法，顱骨摘除更容易引起明顯的炎癥反應(yīng)。此外，Zhao 等［44］研發(fā)了可逆的顱骨透明化技術(shù)，在顱骨表面涂抹光透明劑，顱骨可在數(shù)分鐘內(nèi)變得透明，形成可觀測(cè)顱窗；生理鹽水擦洗及干燥處理即可恢復(fù)原態(tài)。

雙光子活體成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在深層組織細(xì)胞水平上的形態(tài)和生理學(xué)監(jiān)測(cè)。然而，組織散射將最大成像深度限制在小鼠大腦皮質(zhì)層，目前成像皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)需要移除覆蓋的腦組織［45］或插入光纖［46-47］，或采用結(jié)合了更長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)和高階非線(xiàn)性激發(fā)的三光子熒光顯微鏡，從而實(shí)現(xiàn)小鼠海馬內(nèi)的血管和神經(jīng)元非侵入性的高分辨率成像［48］。

2 肝臟活體成像的腹部成像窗

由于腹部器官的解剖位置不同，較皮膚、顱骨等部位的成像，其成像窗口的設(shè)計(jì)和需考慮的因素更復(fù)雜。Tanaka 等［49］設(shè)計(jì)了肝臟環(huán)狀吸盤(pán)，用可逆膠水固定肝臟來(lái)進(jìn)行雙光子活體成像。側(cè)面用夾子固定住環(huán)狀吸盤(pán)，同時(shí)嘴部可進(jìn)行吸入式麻醉，此方法只適用于正置顯微鏡，也有血液溢出、組織發(fā)炎問(wèn)題等，同時(shí)環(huán)狀吸盤(pán)固定后能夠連續(xù)采集24 h，但是較難重復(fù)多次采集。

Ritsma 等［50］利用鈦合金建立腹部窗口式模型（圖2），實(shí)現(xiàn)低損傷長(zhǎng)時(shí)間觀察肝臟，長(zhǎng)達(dá)5～6周。腹部成像窗由一個(gè)鈦環(huán)組成，側(cè)面有一個(gè)1 mm 的凹槽，頂部有玻璃蓋玻片用膠水固定，便于更換。手術(shù)將腹部成像窗植入皮膚和腹壁，用隱藏在腹部成像窗環(huán)槽內(nèi)的荷包縫線(xiàn)固定，并將縫線(xiàn)隱藏在凹槽內(nèi)，以防止老鼠撕扯。

圖2 腹部成像窗尺寸圖Figure 2 Dimensions of abdominal imaging window

由于肝臟的解剖位置位于胸腔下方并附著在膈肌上，通過(guò)腹部成像窗進(jìn)行肝臟成像和減少呼吸運(yùn)動(dòng)需要額外的手術(shù)步驟。首先，切除胸骨劍突，切開(kāi)鐮狀韌帶，操縱肝臟到尾部腹側(cè)的位置，將其固定在腹部成像窗上，減少呼吸運(yùn)動(dòng)。其次，在橫膈膜和肝臟之間的空間中放置無(wú)菌棉紗卷，以進(jìn)一步吸收呼吸運(yùn)動(dòng)并使肝臟穩(wěn)定在其尾部位置。最后，用膠水將肝臟牢固在成像窗后的位置。

由于重力等原因，該腹部成像窗在長(zhǎng)時(shí)間觀察時(shí)肝臟可能依然會(huì)有位移。因此該成像窗更適合倒置型雙光子顯微鏡的活體成像，通過(guò)在老鼠腹部貼上膠帶，將腹部成像窗固定在物鏡上方的成像盒子中間的空隙處。在倒置顯微鏡下，重力有助于將器官固定在合適的位置，并減少呼吸作用下的組織運(yùn)動(dòng)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)吸入式麻醉、保持恒溫、重力暴露窗口和固定組織的綜合作用。該腹部成像窗技術(shù)也可實(shí)現(xiàn)肝臟、胰臟、小腸和脾臟活體長(zhǎng)時(shí)間觀察成像。

3 肺活體成像的負(fù)壓胸吸窗

帶血管的器官中，細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像需在維持完整生理特性的同時(shí)優(yōu)化圖像分辨率。這一問(wèn)題在肺中尤為突出，對(duì)于活體成像，肺部自主呼吸和心臟搏動(dòng)將嚴(yán)重影響觀察區(qū)的穩(wěn)定，在吸氣-呼氣循環(huán)中，由于心臟收縮、脈動(dòng)血流導(dǎo)致大范圍的組織運(yùn)動(dòng)，使肺的活體成像難度較大。此外，肺有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)，物質(zhì)交換頻繁，生命活動(dòng)旺盛。肺組織質(zhì)地疏松薄弱，極易受損。任何對(duì)肺的氣-液界面完整性的擾動(dòng)都可能產(chǎn)生破壞性的后果，導(dǎo)致肺血管泄漏和氣體交換受損。

之前的肺成像方案依賴(lài)于諸如活體肺隔離和再灌注［51］、夾住通氣［52］或在肺呼氣末或機(jī)械通氣［53］停止后捕捉圖像等方法。盡管這些方法都對(duì)肺成像有用，但這些方法不適用于研究生理氣體交換和血液流動(dòng)下高速、三維細(xì)胞動(dòng)力學(xué)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

Lamm 等［54］構(gòu)建了小鼠肺活體成像胸窗（圖3），中空的凹槽內(nèi)徑6 mm，底部粘有18 mm 的玻璃蓋玻片，該裝置的特點(diǎn)是真空通過(guò)成像區(qū)域附近的溝槽循環(huán)，使用20～25 mmHg可逆真空負(fù)壓吸力輕拉肺組織進(jìn)入蓋玻片的淺錐形區(qū)域。然后輕輕固定肺。

圖3 肺活體成像負(fù)壓胸窗Figure 3 Negative pressure chest window in in vivo lung imaging

Looney 等［55］在Lamm 等［54］構(gòu)建的胸窗基礎(chǔ)上，修改凹槽內(nèi)徑為4 mm，并優(yōu)化了一種溫和穩(wěn)定系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以限制組織運(yùn)動(dòng)，同時(shí)允許血液流動(dòng)，并提供連續(xù)吸入氣體，可用來(lái)觀察穩(wěn)態(tài)生理和肺炎癥以及損傷模型下的免疫細(xì)胞循環(huán)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

負(fù)壓胸吸窗不涉及伴隨肺血管收縮反應(yīng)的通氣中斷，也不涉及人工灌注。血流速率與從其他器官推測(cè)的值相似。該技術(shù)也保留了通風(fēng)，但不妨礙成像。局限性在于：成像在正壓通風(fēng)而不是在自主呼吸狀態(tài)下；成像深度在胸膜表面以下125μm處，僅掃描胸膜下血管和肺泡。但通常認(rèn)為胸膜下和深層實(shí)質(zhì)微血管網(wǎng)絡(luò)在血管調(diào)控方面相似。

4 脊髓活體成像窗

動(dòng)物的心臟和肺與脊柱的緊密接近導(dǎo)致由心跳和呼吸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的偽影，顯著阻礙了從活體小鼠脊髓成像獲得穩(wěn)定的圖像。Misgeld等［56］建立了一種脊髓活體成像技術(shù)，這種方法需結(jié)合溫度控制灌注系統(tǒng)和動(dòng)物插管的多個(gè)連續(xù)層切除術(shù)，在圖像采集過(guò)程中通過(guò)中斷動(dòng)物的呼吸以及廣泛的圖像后處理來(lái)去除失焦幀。

此后，Davalos 等［57］建立了另一種穩(wěn)定和重復(fù)成像的簡(jiǎn)化方法，通過(guò)結(jié)合定制的脊柱穩(wěn)定裝置和深度麻醉方法，利用全身懸吊和局部夾緊脊髓以減少呼吸和心跳引起的剩余運(yùn)動(dòng)偽影。可在沒(méi)有動(dòng)物插管或呼吸控制的情況下對(duì)精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行活體成像，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持一個(gè)穩(wěn)定的生理窗口。但Davalos 等［57］建立的方法為實(shí)現(xiàn)多次成像，每次成像完后需縫合，下次成像時(shí)再打開(kāi)，重新暴露脊髓節(jié)段，存在增加動(dòng)物感染風(fēng)險(xiǎn)、造成脊髓局部損傷、激活脊髓局部的免疫反應(yīng)、對(duì)動(dòng)物造成長(zhǎng)期疼痛等問(wèn)題。

Farrar 等［58］建立了一種小鼠脊柱脊髓固定觀察裝置，通過(guò)將觀察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓節(jié)段上涂生物硅膠，用玻璃片封閉裝置，從而使小鼠能夠長(zhǎng)期攜帶觀察裝置生存，避免了重復(fù)手術(shù)對(duì)成像帶來(lái)的干擾（圖4）。每次成像時(shí)，將小鼠麻醉后固定到定制的手術(shù)和成像平臺(tái)上，從而穩(wěn)定脊柱并將小鼠從手術(shù)臺(tái)上抬起，以允許在吸氣過(guò)程中胸腔自由擴(kuò)張，從而減少運(yùn)動(dòng)偽影。

圖4 小鼠脊柱脊髓固定觀察裝置Figure 4 An imaging chamber for mouse spinal cord

5 腫瘤活體成像窗

腫瘤細(xì)胞的侵襲性遷移和進(jìn)入循環(huán)是腫瘤的共同特征，是轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵早期步驟。而腫瘤在動(dòng)物模型和患者中都是異質(zhì)性的。能夠在體觀察腫瘤細(xì)胞行為對(duì)于理解轉(zhuǎn)移機(jī)制及微環(huán)境的定義等都至關(guān)重要。

通過(guò)皮瓣法可對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行數(shù)小時(shí)的跟蹤，但僅限于單次成像，且存在組織脫水、體溫調(diào)節(jié)控制受損的問(wèn)題。另一種廣泛使用的動(dòng)物成像方法是背側(cè)皮膚褶皺腔。背部皮褶腔模型已應(yīng)用于血管生成、腫瘤微環(huán)境和治療反應(yīng)［59-60］。背窗室技術(shù)包括通過(guò)外科手術(shù)植入一個(gè)鈦框架來(lái)支撐一個(gè)透明的窗戶(hù)［61］。將小鼠的背部皮膚向上折疊成框架，在直徑約1 cm 的圓形區(qū)域內(nèi)切除一側(cè)皮膚。此外，圓形蓋玻片放置在開(kāi)口上，從而實(shí)現(xiàn)高分辨率顯微鏡檢查。對(duì)于腫瘤微環(huán)境的研究，在窗口植入過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞被注射到下面的皮膚組織中。腫瘤將在窗口中生長(zhǎng)，能夠?qū)δ[瘤的開(kāi)始和生長(zhǎng)進(jìn)行縱向成像。但這種技術(shù)的缺點(diǎn)是背側(cè)窗室要求腫瘤在皮下生長(zhǎng)，而不是在原位生長(zhǎng)；其次，受窗室大小的限制，只能監(jiān)測(cè)小腫瘤；而且，因?yàn)楸巢科ゑ薜膹椥噪S著時(shí)間的推移而降低以及炎癥反應(yīng)等，窗口觀察和成像僅能在不超過(guò)2周的觀察期內(nèi)重復(fù)進(jìn)行。

為了對(duì)正位腫瘤進(jìn)行高分辨率多重成像，Keedrin等［62］開(kāi)發(fā)了一個(gè)適用于倒置雙光子顯微鏡的乳腺腫瘤成像窗口，成像窗底座由兩個(gè)粘在一起的塑料環(huán)組成，較小環(huán)的內(nèi)徑9 mm/外徑10 mm，較大環(huán)的內(nèi)徑9 mm/外徑14 mm（圖5）。較大環(huán)上有便于縫合皮膚的孔。小環(huán)頂部粘有8 mm 玻璃蓋玻片。根據(jù)腫瘤的大小和形狀，成像窗可以組裝成扁平（圖5a）或解剖彎曲（圖5c），放置在可觸及腫瘤的頂部（直徑4～10 mm），也可在乳腺上方加入腫瘤細(xì)胞。該成像窗適用于原位小鼠異種移植、轉(zhuǎn)基因小鼠或注射到乳腺脂肪墊的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。成像時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)21 d。為了將成像窗固定在合適的位置，并減少呼吸引起的組織運(yùn)動(dòng)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)吸入式麻醉，Keedrin等［62］同時(shí)設(shè)計(jì)了成像盒進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇翱诙ㄎ?，成像窗口被固定在盒子底部的縫隙間，物鏡位于縫隙下方，便于成像。

圖5 腫瘤成像窗組件Figure 5 Components of tumor imaging window

6 總結(jié)

雙光子激光掃描成像技術(shù)以其組織器官穿透性強(qiáng)、光漂白及光毒性低等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為小鼠高空間分辨率活體成像的重要工具，廣泛應(yīng)用于癌癥病理、神經(jīng)疾病及腦功能成像等相關(guān)研究。正置雙光子顯微鏡因鏡下空間較大，更適合小鼠等模式動(dòng)物的活體成像，尤其身體上方的部位，如頭部和背部，適合用正置水鏡觀察。倒置雙光子顯微鏡主要應(yīng)用于細(xì)胞層面上的研究，如在納米領(lǐng)域、雙光子熒光探針領(lǐng)域以及與雙光子相結(jié)合的細(xì)胞通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)，也適用于一些身體下方如腹部軟組織的活體觀察，如腎臟、肝臟、腸、淋巴結(jié)、腫瘤等，重力有助于將器官固定在合適的位置，并減少呼吸作用下的組織運(yùn)動(dòng)，提高成像畫(huà)質(zhì)。對(duì)于3D類(lèi)器官、細(xì)胞微球等標(biāo)本，用倒置雙光子成像也相對(duì)更方便。

雙光子活體成像的實(shí)驗(yàn)步驟大概分為：樣品處理手術(shù)、樣品固定、儀器操作和圖像處理。儀器操作相對(duì)簡(jiǎn)單，用戶(hù)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)一般可獨(dú)立操作。難度較大的是樣品處理和固定，尤其腹腔內(nèi)的組織需要進(jìn)行較大的外科暴露手術(shù)，并需要利用金屬環(huán)、金屬支架等進(jìn)行固定，在進(jìn)行開(kāi)窗的外科手術(shù)中，容易感染，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于需數(shù)天甚至更長(zhǎng)時(shí)間觀察成像的實(shí)驗(yàn)，對(duì)手術(shù)操作的要求則更嚴(yán)苛。手術(shù)中動(dòng)物死亡、流血、窗口脫落、感染及組織輕微抖動(dòng)等問(wèn)題的出現(xiàn)使成像實(shí)驗(yàn)的失敗率很高。

除了合適的暴露手術(shù)，還需選擇合適的固定方式，盡量減少抖動(dòng)對(duì)成像的影響。腦部由于遠(yuǎn)離心臟，且顱骨位置相對(duì)其他臟器較容易固定和成像；而脊髓位于軀體深處，易受到呼吸及心跳的影響。腹部臟器的成像難度更大，除了腸之外，往往無(wú)法拉出臟器蓋上蓋玻片觀察；即使拉出臟器，蓋上蓋玻片后由于傾斜問(wèn)題，使用正置水鏡較難保留水分。因此合適的成像固定適配器至關(guān)重要。此外，成像時(shí)需保證動(dòng)物始終處于良好的麻醉效果，有利于抑制小鼠肢體運(yùn)動(dòng)和呼吸頻率，提高成像質(zhì)量。另外，動(dòng)物載物臺(tái)的溫度等細(xì)節(jié)對(duì)于保證動(dòng)物生理機(jī)能處于正常水平以及活體成像觀察數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性也非常重要。

軟組織，如肝臟、肺、脂肪、淋巴結(jié)、腸、脾臟、腎臟等，在體成像時(shí)，因呼吸和心跳導(dǎo)致的圖像抖動(dòng)問(wèn)題尤其明顯，解決這個(gè)問(wèn)題有幾個(gè)思路，首先，選擇合適的固定器穩(wěn)定標(biāo)本，除了上述的臟器適配器，真空負(fù)壓吸窗通過(guò)負(fù)壓吸附固定組織，無(wú)需使用膠水，吸力連續(xù)可調(diào)，且可定做適合不同器官的多種規(guī)格吸盤(pán)，可廣泛用于各類(lèi)軟組織成像。但是負(fù)壓固定器的調(diào)節(jié)也并非一步到位，需要通過(guò)摸索，找到最穩(wěn)定的狀態(tài)。其次，在不影響數(shù)據(jù)收集的前提下，可盡量提高拍照速度，調(diào)節(jié)雙光子圖像采集頻率，使其與呼吸心跳節(jié)奏一致。最后，不同幀圖像因抖動(dòng)產(chǎn)生的位移可以借助軟件解決，如Image J插件Running Z Projector等。小鼠雙光子活體成像應(yīng)用廣泛，解決前期樣品處理和固定問(wèn)題，將更有利于實(shí)驗(yàn)的順利開(kāi)展。