間接法建立上海地區(qū)新生兒G6PD篩查臨界值的可行性

紀(jì) 偉，田國力，朱之星，周 卓，王燕敏，張瀟分

（1.上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒篩查中心，上海 200040；2.上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)信息研究中心，上海 200040）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD） 缺乏癥為常見的X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，是新生兒高膽紅素血癥常見和重要的危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重者可引起新生兒膽紅素腦病，影響患兒智力發(fā)育，導(dǎo)致嚴(yán)重后遺癥，甚至危及生命[1]。G6PD缺乏癥患兒血液中G6PD水平會(huì)顯著降低，通過檢測(cè)新生兒G6PD水平，可早期篩查出大部分患兒并盡早干預(yù)，最大限度地降低疾病的影響[2]。G6PD缺乏癥有顯著的地域分布，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議在男性患病率＞3%的地區(qū)常規(guī)開展產(chǎn)前健康教育及新生兒篩查[3-4]，但隨著人口的流動(dòng)，這些地區(qū)患病率也逐漸增高。從2007年起，上海地區(qū)全面開展新生兒G6PD缺乏癥篩查，采用定量熒光法檢測(cè)濾紙干血片中的G6PD水平，結(jié)果顯示上海地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥的發(fā)病率為0.18%[5]。從2018年起，上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心開始采用全自動(dòng)新生兒疾病篩查（genetic screening processor，GSP）系統(tǒng)檢測(cè)G6PD，以前期臨床驗(yàn)證階段小樣本建立的220 U/L作為臨界值（Cut-off值），以G6PD＜臨界值判定為篩查陽性[6]。本研究擬基于大樣本數(shù)據(jù)，采用間接法建立G6PD的篩查臨界值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6月—2020年6月上海市兒童醫(yī)院新生兒篩查中心行G6PD缺乏癥篩查的新生兒134 747名，其中男70 310名、女64 437名，日齡為2～30 d，體質(zhì)量為1 350～5 400 g，母親孕周為33～44周。所有新生兒均于出生48 h后采用針刺足跟的方法制備濾紙干血片。

1.2 儀器與試劑

2021-0010型全自動(dòng)熒光免疫分析儀GSP（美國PerkinElmer公司）及配套G6PD試劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品（簡稱GSP系統(tǒng)）。室內(nèi)質(zhì)量控制采用Westgard多規(guī)則（13s和22s），確保質(zhì)控在控。本實(shí)驗(yàn)室參加美國疾病預(yù)防控制中心、中國臺(tái)灣預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)和國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心組織的新生兒G6PD缺乏癥篩查室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃，成績均合格。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件和R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性分布分析，不同性別之間比較采用Z檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示。將偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Box-Cox轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布。采用四分位間距（Turkey）法剔除±1.5倍四分位距（interquartile range，IQR）以外的數(shù)據(jù)，即離群值[7]。采用R語言basicTrendline（https：//CRAN.R-project.org/package=basicTrendline）軟件包繪制累計(jì)頻率分布圖，對(duì)任意2點(diǎn)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行無限循環(huán)，循環(huán)條件設(shè)為同時(shí)滿足最小殘差平方和占累積分布最大百分比的線性部分，直到識(shí)別出最佳線性。

因新生兒G6PD缺乏癥篩查以G6PD水平降低為異常，因此按新生兒疾病篩查指標(biāo)臨界值建立原則[8]，本研究以參考區(qū)間下限[單邊第5百分位數(shù)值（P5）]作為篩查臨界值。將篩查臨界值分別與廠商聲明的參考區(qū)間下限和本實(shí)驗(yàn)室臨床驗(yàn)證階段采用小樣本建立的臨界值作比較，計(jì)算相對(duì)偏差，并與參考變化值（reference change value，RCV）進(jìn)行比較，RCV公式計(jì)算為：RCV=21/2×Z×（CVA2+CVI2）1/2，式中（CVA2+CVI2）1/2表示濾紙干血片G6PD檢測(cè)的不精密度，其結(jié)果來自westgard網(wǎng)站（http：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）；Z表示差異的95%可能性概率值，取值為1.96。以相對(duì)偏差＜RCV為兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)偏差＞RCV為兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生兒篩查總體情況

134 747名新生兒中篩查陽性352例，采用G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶比值法或基因檢測(cè)確診G6PD缺乏癥233例，其中男210例、女23例，G6PD缺乏癥發(fā)病率為1∶579。

2.2 入組新生兒基本信息

Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)結(jié)果顯示，G6PD數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布。134 747名新生兒中去除G6PD缺乏癥患兒233例（0.17%）和確診為其他遺傳代謝病患兒141例（0.10%），剩余數(shù)據(jù)經(jīng)Box-Cox轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布，然后采用Turkey法剔除離群值793個(gè)（0.59%），最終入組新生兒為133 580名。見表1。

表1 入組新生兒基本信息

2.3 采用間接法建立G6PD參考區(qū)間

Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，男嬰與女嬰之間G6PD水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。將男嬰和女嬰G6PD檢測(cè)結(jié)果用Box-Cox轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布曲線，見圖1。以累積頻率作為橫坐標(biāo)，G6PD檢測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)，對(duì)任意2點(diǎn)間數(shù)據(jù)進(jìn)行無限循環(huán)擬合，得出的最佳線性曲線見圖2。根據(jù)擬合線性方程，以P5為臨界值，求得男嬰G6PD的臨界值為317.8 U/L、女嬰為325.7 U/L。見表2。

圖1 男嬰和女嬰G6PD檢測(cè)結(jié)果的頻率分布直方圖

圖2 男嬰和女嬰G6PD檢測(cè)結(jié)果的累計(jì)頻率分布曲線

表2 間接法建立的G6PD篩查臨界值

2.4 根據(jù)篩查臨界值計(jì)算的相對(duì)偏差與RCV的比較結(jié)果

濾紙干血片G6PD的RCV為10.26%。無論是男嬰還是女嬰，采用間接法建立的篩查臨界值與廠商聲明的參考區(qū)間下限及本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)小樣本建立的臨界值的相對(duì)偏差均高于RCV。見表3。

表3 篩查臨界值與廠商聲明、小樣本臨界值的相對(duì)偏差及與RCV的比較結(jié)果

2.5 間接法建立的G6PD篩查臨界值的驗(yàn)證

233例G6PD缺乏癥患兒中男嬰210例，G6PD水平為15.3～258.5 U/L；女嬰23例，G6PD水平為24.7～312.9 U/L，均低于相應(yīng)臨界值。

回顧分析2018年6月—2020年6月中國臺(tái)灣預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)新生兒G6PD篩查院際品質(zhì)保證計(jì)劃的7批70份樣本結(jié)果，其中陽性樣本19份、陰性樣本51份，以間接法建立的G6PD篩查臨界值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，陰性、陽性的符合率均為100%。見圖3。

圖3 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討論

新生兒G6PD缺乏癥篩查通過實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)濾紙干血片上G6PD濃度，把可疑患兒在新生兒期篩查出來，再進(jìn)一步采用定量比值法或基因檢測(cè)方法明確診斷，盡早干預(yù)，以最大限度地降低疾病對(duì)患兒的影響[9]。本研究采用GSP系統(tǒng)對(duì)上海地區(qū)出生的134 747名新生兒進(jìn)行G6PD缺乏癥篩查，確診233例患兒，得出上海地區(qū)G6PD缺乏癥的發(fā)病率為1∶579，與采用定量熒光法得出的上海地區(qū)發(fā)病率[10]基本一致。G6PD缺乏癥為X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，男性患兒為酶活性顯著缺乏的半合子，女性患兒雜合子可表現(xiàn)為G6PD活性接近正?；蛘！１狙芯看_診男嬰210例、女嬰23例，男嬰例數(shù)遠(yuǎn)高于女嬰。由于以G6PD為指標(biāo)的新生兒篩查是篩查有“表現(xiàn)型”的G6PD缺乏癥[11]，因此女嬰的實(shí)際發(fā)病率可能更高。

臨界值是指某被測(cè)物在健康人群中的上限值或下限值，用于判斷罹患疾病的風(fēng)險(xiǎn)，也是新生兒篩查工作中疾病診斷和治療的重要依據(jù)，臨界值是否準(zhǔn)確直接影響著新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量。新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室一般先建立健康新生兒中相應(yīng)指標(biāo)的參考區(qū)間，然后根據(jù)篩查疾病的特點(diǎn)，將參考區(qū)間的下限或上限定義為臨界值[12]。G6PD缺乏癥患兒血G6PD水平降低，故新生兒G6PD缺乏癥的篩查是以G6PD低于臨界值為陽性。如果臨界值設(shè)定偏低，易導(dǎo)致假陰性，直接導(dǎo)致漏診；如果設(shè)置偏高，易導(dǎo)致過多假陽性，造成人力、物力的極大浪費(fèi)。2015年，我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心對(duì)全國88家開展G6PD缺乏癥篩查的臨床實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查結(jié)果顯示，G6PD臨界值為2.0～10.0 U/g Hb，是以每克血紅蛋白中G6PD的含量為單位[13]。從2017年起，具有洗脫控制環(huán)節(jié)的GSP系統(tǒng)逐步被應(yīng)用于臨床，其G6PD的單位為U/L，直接反映了全血中G6PD的活性，特別是對(duì)于貧血等低色素新生兒，準(zhǔn)確度更高[6]。2020年，中國臺(tái)灣預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)的新生兒G6PD缺乏癥篩查室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃結(jié)果顯示，全球參加該計(jì)劃的57家篩查中心中，有11家使用GSP系統(tǒng)檢測(cè)，其臨界值為160～360 U/L。本研究采用間接法計(jì)算出的G6PD篩查臨界值為男嬰317.8 U/L、女嬰325.7 U/L?；仡櫺苑治?33例G6PD缺乏癥患兒和70份室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本，依據(jù)此篩查臨界值能檢出所有患兒，且室間質(zhì)量評(píng)價(jià)陰性、陽性符合率均達(dá)100%。

傳統(tǒng)的直接法建立參考區(qū)間需要從健康人群中篩選出符合要求的參考個(gè)體，遺傳代謝病的患病率較低，計(jì)算相關(guān)指標(biāo)臨界值至少需要10 000名新生兒，且隨著檢測(cè)數(shù)據(jù)的積累，需要不斷修正臨界值[14]，這對(duì)新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室的人力和物力是一個(gè)極大的考驗(yàn)。另外，對(duì)在出生48 h就采集樣本的新生兒疾病篩查，很多疾病還未表現(xiàn)出來，難以保證全部為健康人群，這使得篩選參考個(gè)體變得異常困難。本實(shí)驗(yàn)室早期采用直接法建立臨界值，入組的28例陽性樣本和75例陰性樣本均經(jīng)基因檢測(cè)明確診斷，檢測(cè)成本高，入組數(shù)量有限，難以在臨床推廣[6]。因此，很多新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室直接引用試劑廠商或其他實(shí)驗(yàn)室建立的參考區(qū)間，但因人群、地域和檢測(cè)系統(tǒng)的差異，會(huì)產(chǎn)生過多的假陽性和假陰性，甚至出現(xiàn)漏診，直接影響新生兒疾病篩查的效率。間接法[15]是利用實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫中已有的數(shù)據(jù)，以數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型為基礎(chǔ)建立參考區(qū)間的方法，既可以獲得與直接法近似的結(jié)果，也避免了直接法的繁瑣過程，在成本效益方面遠(yuǎn)優(yōu)于直接法。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010年發(fā)布的EP28-A3C文件[16]中允許實(shí)驗(yàn)室通過間接法來建立參考區(qū)間。但將間接法用于新生兒疾病篩查項(xiàng)目參考區(qū)間的建立，同時(shí)建立篩查臨界值尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，男嬰與女嬰之間G6PD水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），采用間接法建立的篩查臨界值高于廠商聲明的參考區(qū)間下限及本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)小樣本建立的臨界值。這進(jìn)一步說明每個(gè)新生兒篩查實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)自行建立相關(guān)篩查項(xiàng)目的參考區(qū)間和篩查臨界值，且隨著篩查量的增加，臨界值需不斷修正。本研究基于133 580名新生兒的G6PD檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用間接法建立的G6PD臨界值為：男嬰317.8 U/L、女嬰325.7 U/L。雖然會(huì)增加一定的假陽性率，但能避免漏診現(xiàn)象的發(fā)生。確診病例和第三方室間質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)結(jié)果的回顧性分析均確認(rèn)了該篩查臨界值用于臨床G6PD缺乏癥篩查的可行性。

綜上所述，新生兒疾病篩查信息系統(tǒng)中存儲(chǔ)著大量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，基于現(xiàn)有的大樣本量數(shù)據(jù)，采用間接法建立G6PD的參考區(qū)間和篩查臨界值，可為提高新生兒G6PD缺乏癥的篩查效率提供一種切實(shí)、有效的方法，具有臨床推廣價(jià)值。