法夫酵母耐熱基因工程菌的構(gòu)建

楊 蒙 蒙， 劉 詩(shī) 文， 劉 冰 南

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蝦青素(astaxanthin)作為葉黃素家族中的一種，是類胡蘿卜素的氧化衍生物。蝦青素屬于萜烯類不飽和化合物，具備極強(qiáng)的抗氧化能力，可有效提高機(jī)體的免疫力，在心血管疾病、腫瘤和某些免疫系統(tǒng)類疾病的治療與預(yù)防方面具有巨大的潛能[1]。與化學(xué)合成的蝦青素相比，天然來(lái)源的蝦青素具有更好的活性。法夫酵母作為蝦青素的一種天然來(lái)源，其發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。但法夫酵母最適細(xì)胞生長(zhǎng)和色素合成的溫度在20 ℃左右，發(fā)酵中后期需消耗大量能源降溫，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，難于工業(yè)化生產(chǎn)。目前報(bào)道的提高法夫酵母生產(chǎn)蝦青素溫度的方法主要是原生質(zhì)體融合和化學(xué)誘變。通過(guò)原生質(zhì)體融合的方式獲得的耐熱菌株，蝦青素產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比顯著降低[2]，甚至不能生產(chǎn)蝦青素[3]。通過(guò)將外源基因整合到法夫酵母基因組以提高蝦青素生產(chǎn)溫度的方法未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)將外源熱激蛋白編碼基因整合到法夫酵母基因組上，構(gòu)建耐熱基因工程菌株，以期提高法夫酵母耐熱性，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株：E.coliTop10；法夫酵母XanthophyllomycesdendrorhousCBS6938；嗜熱菌ThermusthermophilesHB8 CGMCC1.6492。

所用引物如表1所示。

1.2 方 法

1.2.1 法夫酵母質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 質(zhì)粒pUC18-18S的構(gòu)建

根據(jù)法夫酵母18S rDNA基因序列(GenBank：D 31656.1)，以SalⅠ作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物18S-F和18S-R，以法夫酵母基因組DNA作為模板，使用高保真酶Dpx(Tolobio)進(jìn)行18S rDNA片段PCR擴(kuò)增。18S rDNA片段與去磷酸化的pUC18質(zhì)粒線性化載體用T4連接酶(Takara)在16 ℃連接30 min，構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-18S。構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中擴(kuò)增，用質(zhì)粒小提試劑盒(上海生工)提取質(zhì)粒。以M13F-47和M13R-47為引物進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證質(zhì)粒pUC18-18S是否構(gòu)建成功。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.1.2 質(zhì)粒pUC18-kan-18S的構(gòu)建

在pUC18-18S質(zhì)粒中添加G418抗性基因kan(816 bp，GenBank：KY 860085.1)作為標(biāo)記，以質(zhì)粒pET-28為模板，以kan-F0和kan-R0為引物，使用高保真酶進(jìn)行kan基因PCR擴(kuò)增。根據(jù)法夫酵母基因組中肌動(dòng)蛋白基因(GenBank：X 89898.1)啟動(dòng)子(pact，580 bp)和終止子(tact，552 bp)的序列，以SalⅠ作為酶切位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物Pact-F、Pact-R1和終止子引物Tact-F1、Tact-R1，以法夫酵母基因組DNA作為模板，使用高保真酶進(jìn)行啟動(dòng)子和終止子片段PCR擴(kuò)增[4]。將tact-kan-pact通過(guò)融合PCR進(jìn)行連接，連接后的片段與pUC18-18S質(zhì)粒分別用SalⅠ酶切，用T4連接酶進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。以M13F-47，kan-F0，Tact-F1為引物進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，驗(yàn)證質(zhì)粒pUC18-kan-18S是否構(gòu)建成功。

1.2.2 法夫酵母熱激蛋白元器件的構(gòu)建

提取純化質(zhì)粒pUC18-kan-18S，利用HindⅢ37 ℃酶切1 h。以T.thermophilesHB8基因組為模板，以groes-F和groes-R為引物，采用高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到306 bp的PCR產(chǎn)物groes(Gene ID：3168828)。以法夫酵母基因組為模板，分別以Pact-groes-F、Pact-groes-R和Tact-groes-F、Tact-groes-R為引物擴(kuò)增得到片段pact和tact。將pact-groes-tact采用融合PCR方法連接，經(jīng)Hind Ⅲ酶切后，連接到酶切后的pUC18-kan-18S質(zhì)粒上，進(jìn)行測(cè)序，命名為pUC18-kan-18S-groes。

1.2.3 法夫酵母感受態(tài)細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細(xì)胞制備和電擊轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)[5]的方法，采用Eppendorf Eporator電轉(zhuǎn)化儀，具體電擊條件：電轉(zhuǎn)儀電壓500 V，時(shí)間5 ms。電擊后菌液涂布于含有50 μg/mL G418的PDA抗性平板上，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。

1.2.4 法夫酵母XD-G外源基因表達(dá)鑒定

2% XD-G種子液接種于PD液體培養(yǎng)基中(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L)，25 ℃振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，每12 h取樣一次，離心去上清，菌體液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，進(jìn)行RNA提取。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，groes-F1和groes-R1為引物進(jìn)行PCR。

1.2.5 法夫酵母XD-G發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

取9個(gè)250 mL搖瓶，裝液量50 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)120 h，每次隨機(jī)抽取3瓶取樣，HPLC法測(cè)定蝦青素含量[6]、葡萄糖消耗以及細(xì)胞OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 法夫酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將法夫酵母18S rDNA基因插入pUC18上作為同源片段，構(gòu)建pUC18-18S質(zhì)粒。將法夫酵母肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子pact-G418抗性基因kan-肌動(dòng)蛋白終止子tact融合成一個(gè)片段，構(gòu)建可在法夫酵母中表達(dá)的G418抗性基因盒。將基因盒連接到pUC18-18S上構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-kan-18S。經(jīng)測(cè)序，證明質(zhì)粒pUC18-kan-18S構(gòu)建成功。

2.2 法夫酵母熱激蛋白元器件的構(gòu)建

嗜熱棲熱菌能夠在75 ℃條件下生長(zhǎng)，是由于其細(xì)胞內(nèi)含有豐富的熱激蛋白[7]。在高溫環(huán)境下，熱激蛋白能夠幫助熱變性的蛋白質(zhì)恢復(fù)原有的空間構(gòu)象和功能，從而幫助細(xì)胞抵御熱脅迫[8]。基因groes編碼的熱激蛋白10(HSP10)通常作為一種輔助蛋白，常與熱激蛋白HSP60(groes基因)形成圓柱形結(jié)構(gòu)，能夠特異性的識(shí)別由于高溫導(dǎo)致變性的蛋白質(zhì)，使其進(jìn)入中空部分，幫助受損蛋白質(zhì)重新正確折疊后，釋放出修復(fù)后的蛋白質(zhì)[9]。

采用融合PCR技術(shù)，將啟動(dòng)子pact、熱激蛋白基因groes和終止子pact連為一條基因片段，目的基因P-groes-T(1 512 bp)融合結(jié)果如圖1所示。

按構(gòu)建pUC18-kan-18S的方法，將目的基因P-groes-T連接到質(zhì)粒pUC18-kan-18S，構(gòu)建法夫酵母熱激蛋白元器件，命名為pUC18-kan-18S-groes，質(zhì)粒示意圖如圖2所示。將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用Amp LB平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。以groes-F和groes-R為引物，通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆菌株，結(jié)果如圖3所示。

M，DNA marker；1，目的基因groes圖3 質(zhì)粒pUC18-kan-18S-groes的PCR結(jié)果Fig.3 PCR result of positive clones for plasmidpUC18-kan-18S-groes

2.3 耐熱工程菌株的構(gòu)建

2.3.1 法夫酵母XD-G陽(yáng)性克隆菌株的篩選

挑取抗性平板上生長(zhǎng)的法夫酵母菌落進(jìn)行裂解，以裂解液為DNA模板，以groes-F和groes-R為引物進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖4所示。有3株菌落出現(xiàn)目的基因groes條帶。產(chǎn)物測(cè)序，并與groes基因序列比對(duì)，驗(yàn)證該P(yáng)CR產(chǎn)物為groes基因。結(jié)果表明，groes基因已成功整合到法夫酵母基因組上，命名為法夫酵母XD-G。

M，DNA marker；1，2，3，目的基因groes圖4 法夫酵母XD-G的PCR驗(yàn)證Fig.4 PCR result of X. dendrorhous XD-G

將法夫酵母XD-G分別置于25、28、30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，測(cè)定不同培養(yǎng)條件下XD-G的蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，XD-G在25 ℃能夠生長(zhǎng)并合成蝦青素，蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為177.7 μg/g，表明XD-G與野生型法夫酵母相比，培養(yǎng)溫度提高了5 ℃。因此，將目的基因groes整合到法夫酵母基因組上，能夠保護(hù)法夫酵母合成蝦青素的相關(guān)酶，使其在25 ℃條件下仍具有活性。但是當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到28～30 ℃，XD-G生物量顯著降低且無(wú)蝦青素生成。

2.3.2 法夫酵母XD-G外源基因表達(dá)鑒定

如圖5所示，經(jīng)鑒定groes在法夫酵母mRNA水平上有表達(dá)，目的基因產(chǎn)物大小為119 bp。PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，序列經(jīng)過(guò)比對(duì)證明為groes目的基因。結(jié)果表明，法夫酵母XD-G在25 ℃培養(yǎng)條件下，外源基因groes在法夫酵母mRNA水平上有表達(dá)，但表達(dá)量偏低。groes編碼的HSP 10 是典型的熱激蛋白，通常情況HSP 10作為協(xié)助伴侶分子與groes編碼的HSP 60熱激蛋白形成筒狀結(jié)構(gòu)，協(xié)助非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)和新生肽鏈進(jìn)行正確折疊，對(duì)提高細(xì)胞耐熱性發(fā)揮著重要作用[10]。有學(xué)者對(duì)釀酒酵母耐熱元器件進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)雖然熱激蛋白基因groes在mRNA上的表達(dá)量相較于其他熱激蛋白基因表達(dá)量較低，但是插入熱激蛋白基因groes獲得的釀酒酵母工程菌S.c-GroES耐熱性最好[7]。本實(shí)驗(yàn)獲得的法夫酵母耐熱工程菌株法夫酵母XD-G中熱激蛋白基因groes在mRNA上表達(dá)量較低，但能夠有效地將法夫酵母最適培養(yǎng)溫度提高5 ℃，與這一結(jié)果相一致。

M，DNA marker；1～5分別為培養(yǎng)12，24，48，72，96 h的目的基因groes圖5 法夫酵母XD-G中g(shù)roes基因在mRNA水平上的表達(dá)驗(yàn)證Fig.5 Expression of the groes gene in X.dendrorhousXD-G at mRNA level

2.4 法夫酵母XD-G發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線

如圖6所示，法夫酵母XD-G于84 h時(shí)OD600達(dá)到最大值，進(jìn)入菌體發(fā)酵的穩(wěn)定期，此時(shí)葡萄糖完全消耗，蝦青素合成達(dá)到最大值177.7 μg/g。法夫酵母野生型菌株在25 ℃條件下生物量極低且無(wú)蝦青素生成，說(shuō)明法夫酵母發(fā)酵受溫度影響明顯。在20 ℃的條件下，發(fā)酵96 h后蝦青素產(chǎn)量為140.3 μg/g[11]。與野生型法夫酵母相比，基因工程菌株法夫酵母XD-G的培養(yǎng)溫度提高到25 ℃，菌體的生長(zhǎng)速度減慢，蝦青素產(chǎn)量提高了26.7%。在發(fā)酵培養(yǎng)初期，法夫酵母XD-G生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明外源基因groes表達(dá)需要一定時(shí)間，當(dāng)表達(dá)一定量的熱激蛋白后，熱激蛋白可保護(hù)菌體由于升溫帶來(lái)的損害。蝦青素產(chǎn)量提高的原因可能是溫度升高導(dǎo)致氧化壓力提高，有研究表明氧化壓力使更多的萜類化合物代謝流進(jìn)入蝦青素合成途徑[12]。

圖6 法夫酵母XD-G發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Kinetics of X. dendrorhous XD-G

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)縫拼接的方式構(gòu)建了法夫酵母表達(dá)載體pUC18-kan-18S。從嗜熱棲熱菌HB8基因組中獲得熱激蛋白基因groes，采用融合PCR及無(wú)縫拼接的方法構(gòu)建了熱激蛋白元器pUC18-kan-18S-groes。將熱激蛋白元器件電擊轉(zhuǎn)化到法夫酵母感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出pUC18-kan-18S-groes陽(yáng)性克隆菌株法夫酵母XD-G，并驗(yàn)證了其在RNA水平上有一定表達(dá)。升高培養(yǎng)溫度至25 ℃，法夫酵母XD-G能夠在25 ℃條件下生長(zhǎng)并合成蝦青素，發(fā)酵84 h蝦青素產(chǎn)量達(dá)到177.7 μg/g，比20 ℃培養(yǎng)時(shí)蝦青素產(chǎn)量提高了26.7%。