纖維素酶及其活性提升研究進展

王豐園 金海炎 丁凌飛 魯云風(fēng)*

（1南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 河南 南陽 473061；2車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室 河南 南陽 473000）

為解決日益加重的能源枯竭問題，近年來各個國家為尋找新型清潔可再生能源開展了大量研究。纖維素是葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵聚合而成，是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，但是目前對纖維素的利用主要體現(xiàn)在直接燃燒，不僅利用率低，而且還造成大氣污染，因此對纖維素的有效利用成為人們關(guān)注的核心問題。纖維素酶是纖維素有效利用的關(guān)鍵因素，目前纖維素酶主要應(yīng)用于食品業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、紡織業(yè)和生物質(zhì)能源等產(chǎn)業(yè)[1]，但是這些產(chǎn)業(yè)都要求纖維素酶產(chǎn)量大且活性高。因此，如何快速提高纖維素酶活性和纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素工業(yè)化生產(chǎn)成本，是纖維素酶快速應(yīng)用于工業(yè)的關(guān)鍵性技術(shù)問題。本文從纖維素酶的來源、纖維素酶活性的影響因素以及提高纖維素酶活性的主要方法等幾個方面進行闡述，以期為纖維素酶產(chǎn)業(yè)發(fā)展和纖維素有效利用提供理論依據(jù)。

1 木質(zhì)纖維素

木質(zhì)纖維素被譽為地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，是植物和藻類等綠色植物利用光合作用固定二氧化碳的產(chǎn)物，也是地球上含量最多、分布最廣的碳水化合物之一；自然界的木質(zhì)纖維素材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有機結(jié)合組成[2]。

半纖維素和木質(zhì)素通過一種特殊的結(jié)合方式，緊緊的環(huán)繞在纖維素的外面，有效地保護了纖維素內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)纖維素的二次利用非常困難，因此，木質(zhì)纖維素開發(fā)的關(guān)鍵在于如何安全有效的破壞掉纖維素外面的“保護層”。目前主要采用酸處理、堿處理及微生物酶解處理等方法，破壞木質(zhì)纖維素的基本結(jié)構(gòu)，增大底物和酶的接觸面積，從而有效提高木質(zhì)纖維素的綜合利用率[3～4]。

天然的纖維素分子結(jié)構(gòu)是由結(jié)晶區(qū)纖維素和非結(jié)晶區(qū)纖維素相互交錯排列形成的(圖1)。結(jié)晶區(qū)纖維素比非結(jié)晶區(qū)部分更難被酶攻擊，晶態(tài)纖維素含量較高，這意味著纖維素的降解率會較低[5]。纖維素酶主要降解纖維素的非結(jié)晶區(qū)，當作用于晶體纖維素時會嚴重受阻，極大地降低纖維素酶與底物的結(jié)合率，因此會降低生物質(zhì)的酶解效率。通過在不同生物質(zhì)中的研究表明：生物質(zhì)經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理后，纖維素結(jié)晶度是酶解效率的重要負影響因子之一[6]。

圖1 纖維素結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)展示圖[7]

2 纖維素酶

纖維素酶是可降解纖維素的一類復(fù)雜酶系的總稱，目前公認的主要功能酶有內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(EGs，EC 3.2.1.4)、外切β-1，4-葡聚糖酶(CBHs，EC 3.2.1.91)和β-1，4-葡萄糖苷酶(BGs，EC 3.2.1.21)3類[8]；關(guān)于纖維素降解機理，研究人員普遍接受和認同的理論是協(xié)同降解理論(圖2)，其基本原理和特點是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶首先發(fā)揮作用，它可以識別并切斷長鏈纖維素分子內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生大量的短鏈纖維素，為外切β-1，4-葡聚糖酶發(fā)揮作用奠定了基礎(chǔ)。外切β-1，4-葡聚糖酶可以識別并切斷纖維素分子末端的β-1，4-糖苷鍵，識別位置在末端2號位或4號位，形成許多纖維二糖和纖維四糖，纖維四糖繼續(xù)被該酶水解為纖維二糖。最后β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒆R別并酶解纖維二糖β-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖[9]，該酶在整個纖維素降解體系中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可以消除前2種酶的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，是纖維素降解酶系中的限速酶。

圖2 纖維素酶協(xié)同降解纖維素[10]

3 纖維素酶來源

自然界為纖維素酶的來源提供了廣闊的途徑，在細菌、真菌、放線菌中都有大量的分布。

3.1 細菌。目前產(chǎn)纖維素酶的主要細菌類型及相應(yīng)研究較多的菌屬有厭氧發(fā)酵菌熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、梭菌屬(Clostridium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、醋酸弧菌屬(Acetivibrio)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)；好氧發(fā)酵菌熱桿菌屬(Caldibacillus)、熱酸菌屬(Acidothermus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、小雙孢菌屬(Microbispora)、高溫單胞菌屬(Thermomonospora)、嗜纖維菌屬(Cytophaga)、生孢嗜纖維菌屬(Sporocytophaga)等。有研究表明，細菌降解纖維素的能力較弱，是因為其只能分泌葡聚糖內(nèi)切酶，大部分都沒有降解纖維素晶體的作用，并且細菌產(chǎn)生的纖維素酶不能分泌到胞外，酶的提取和純化難度大、成本高，所以目前不適合用于工業(yè)生產(chǎn)[11]。對細菌的開發(fā)應(yīng)著重于厭氧或兼性厭氧菌方面，主要在于這些菌種在環(huán)境保護和飼料發(fā)酵等方面作用尤其突出，因為降解污物纖維素和飼料發(fā)酵加工等都在缺氧條件下進行，好氧真菌則無法使用[12]。

3.2 真菌。真菌是目前已知的產(chǎn)纖維素酶的能力較強的微生物，主要在于真菌可以分泌胞外纖維素酶，真菌在生長過程中，其菌絲可以穿透植物的角質(zhì)層，破壞掉部分木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)暴露出纖維素，其分泌的胞外纖維素酶可直接與纖維素結(jié)合進行酶解，從而提高降解效率。目前為止產(chǎn)纖維素酶真菌中研究較多的有木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)等[13]。迄今發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維素酶真菌中，大部分為好氧型，但也有部分是厭氧型的；張艷英[14]研究了哺乳動物的瘤胃液中的產(chǎn)纖維素酶真菌，并成功分離出8株厭氧型產(chǎn)纖維素酶真菌。不同營養(yǎng)類型的真菌也為纖維素資源化利用的不同場景提供了可能。

3.3 放線菌。放線菌降解纖維素的能力要比真菌和細菌低的多，是因為其代謝非常慢，產(chǎn)纖維素酶量極低，分泌的纖維素酶種類較少，且對纖維素酶活性較弱，因此很少應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)。但是放線菌產(chǎn)生的纖維素酶在強堿和高溫環(huán)境下仍然能較高的維持其原有的纖維素酶活性，目前研究較多的主要是纖維放線菌、玫瑰色放線菌以及黑紅旋絲放線菌[15]。

3.4 其它來源。自然界中能夠高效降解木質(zhì)纖維素的系統(tǒng)還有很多，其中白蟻與其共生微生物協(xié)同降解木質(zhì)纖維素一直被世界各國學(xué)者所關(guān)注；目前認為白蟻降解木質(zhì)纖維素體系是通過白蟻自身分泌的內(nèi)源纖維素酶和其共生微生物分泌的外源纖維素酶協(xié)同發(fā)揮作用，是一種雙重降解機制。梁世優(yōu)[16]等研究了培菌白蟻的共生機制，培菌白蟻獨特生存方式是在其巢內(nèi)形成的一種三維立體多孔狀結(jié)構(gòu)—“菌圃”，這種特殊結(jié)構(gòu)為共生菌雞樅菌(Termitomycesspp)提供了生存空間，二者互利共生，形成了獨特的木質(zhì)纖維素降解體系。培菌白蟻的共生真菌是通過水平傳播得到的，但是在大白蟻屬及小白蟻屬中共生菌的來源是垂直傳播得到的，有研究表明成熟的蟻巢中僅存在一種共生真菌。

4 提高纖維素酶活性的策略

纖維素酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其活性受溫度、pH值、酶濃度、底物濃度和離子強度等影響，不同種類的纖維素酶有不同的最適反應(yīng)條件。纖維素酶具有作用條件溫和、特異性強、不產(chǎn)生其他雜物、安全、無污染等優(yōu)點，是纖維素工業(yè)化的研究熱點。但目前纖維素酶普遍存在酶解效率低、反應(yīng)時間長等問題，這導(dǎo)致第一次纖維素乙醇工業(yè)失敗[17]。為解決這一問題，各國學(xué)者采取了多種策略以提高纖維素酶活性，包括添加合適的酶助劑、對微生物進行誘變改良、基因工程育種和原生質(zhì)體融合育種等。

4.1 添加酶助劑。表面活性劑(Surfactant，SF)是具有1個疏水基團和1個親水基團的一種兩親性分子，能夠表現(xiàn)出乳化、增溶等特性，從而通過增加酶、底物以及溶劑的互溶來提高酶解效率。根據(jù)其極性基團的解離性質(zhì)，SF可分為離子型和非離子型。非離子型SF對纖維素酶的酶解效率促進較大，如Tween(吐溫)和聚乙二醇，因其具有穩(wěn)定性高、溶解性好等優(yōu)點，在提高纖維素水解率上有顯著作用[18]。楊耀剛[19]等研究發(fā)現(xiàn)金屬離子與表面活性劑可不同程度的提高搖瓶中還原糖的含量，即可提高纖維素酶解效率，其中促進效果最好的金屬離子是Co2+和Cu2+，促進效果最好的表面活性劑是SDS(十二烷基硫酸鈉)。王亞林[20]等研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑Tween80和“一枝花”洗衣粉均能有效促進木霉菌產(chǎn)生纖維素酶。王超[21]等研究結(jié)果表明：Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對該纖維素酶活性有促進作用。

4.2 微生物誘變育種。在微生物發(fā)酵工業(yè)中，通過人為的方式對菌種施加某種誘變因素，使微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，引起細胞物質(zhì)代謝改變，通過篩選可以得到高產(chǎn)菌株，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本；目前常用的誘變技術(shù)分為物理誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合理化誘變。徐廣偉[22]通過復(fù)合理化誘變(紫外照射-LiCl)康氏木霉，篩選出1株突變株E-1 CMC(羧甲基纖維素鈉)，其酶活增長率是350.5%，而FPA(濾紙酶活)酶活增長率是87.65%。

4.3 基因工程育種?；蚬こ逃N是直接對纖維素酶基因進行改造，可以快速、定向地對纖維素酶基因進行修飾，獲得新的高比活力纖維素酶。改造后的纖維素酶在穩(wěn)定性和催化活性等方面也有很大的提升，對提高酶的生產(chǎn)效率及降低生產(chǎn)成本具有重要意義。因此，通過基因工程構(gòu)建高效表達高活性纖維素酶的基因工程菌，是國內(nèi)外研究的熱點之一。人們已經(jīng)將纖維素酶的基因克隆到細菌、酵母、真菌中，并得到了重組型纖維素酶的表達菌株。丁軻[23]等利用PCR及酶切等技術(shù)將2個纖維素酶基因連接在一個開放閱讀框內(nèi)，構(gòu)建重組表達載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行表達。隨后通過大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中成功檢測出融合纖維素酶，通過試驗該酶可適應(yīng)較廣的溫度和pH值范圍，酶活性對金屬離子敏感。還可以利用基因工程技術(shù)，來抑制阻遏基因的表達，從而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。鄧嘉雯[24]等通過構(gòu)建多靶向siRNA表達載體對里氏木霉碳阻遏抑制因子進行干擾，成功抑制里氏木霉的分解代謝物阻遏基因的表達，使得纖維素酶基因能夠充分表達，通過搖瓶培養(yǎng)檢測纖維素酶活力，干擾后的纖維素酶活性明顯比原始菌株要高。還有一些學(xué)者利用基因敲除技術(shù)，來修改表達基因，得到高產(chǎn)菌株，如劉富川[25]等采用基因敲除技術(shù)，去除掉纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子bglr基因及其上下游序列，獲得bglr基因敲除的菌株EU7-22Δbglr，該菌的纖維素酶活力均有不同程度提高?；蚯贸夹g(shù)是目前國內(nèi)外研究的熱點，其應(yīng)用廣泛，目的性較強。

4.4 原生質(zhì)體融合育種。原生質(zhì)體融合(Protoplast Fusion)是一種基因重組技術(shù)。用相應(yīng)水解酶除去細胞壁，制成由細胞膜包被的裸細胞，然后選擇適當?shù)奈锢?、化學(xué)或生物的方法進行誘導(dǎo)融合，經(jīng)過融合，遺傳物質(zhì)重組并成功生存下來，通過篩選可獲得有效產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株，為微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供廣闊空間。該技術(shù)已成為微生物育種的研究熱點。研究者利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以實現(xiàn)既能產(chǎn)生纖維素酶，又能產(chǎn)生木質(zhì)素酶的強化菌株；對于纖維素酶生產(chǎn)菌株的改良，原生質(zhì)體融合技術(shù)比常規(guī)雜交育種具有更大的優(yōu)越性。張素敏[26]等通過制備產(chǎn)纖維素酶菌株里氏木霉T306原生質(zhì)體，分別將其進行紫外照射和微波輻射雙親滅活后，通過化學(xué)試劑聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，原生質(zhì)體融合率為0.5%。經(jīng)過2輪原生質(zhì)體融合試驗，通過篩選獲得1株遺傳穩(wěn)定，纖維素酶活力較出發(fā)菌株有明顯提高的融合子。曾柏全[27]等將高產(chǎn)纖維素酶的青霉菌與強抗逆性的枯草芽孢桿菌分別經(jīng)過高溫、紫外雙親滅活后，通過化學(xué)試劑聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，最終成功篩選出了1株抗逆性比原始菌株有明顯提高的高產(chǎn)纖維素酶優(yōu)良菌株。

5 展望

目前選育的產(chǎn)纖維素酶系菌株，都存在產(chǎn)酶量不高、酶活性較低等問題，造成生產(chǎn)成本高，不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。自然界的菌株均難滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求，必須對其進行適當改良，以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)。在對菌株改良的方法中，復(fù)合理化誘變效果最為理想，廣泛應(yīng)用于各種菌株改良，具有效率高、操作簡單等特點，但是誘變育種存在不定向性和盲目性，要進行多次重復(fù)試驗才有可能獲得理想菌株。這是因為人們需要的產(chǎn)物往往是多基因控制的，例如目的產(chǎn)物代謝途徑上的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、輔助基因等，這些基因不可能通過一次誘變?nèi)恳鹜蛔?，而獲得高產(chǎn)菌株，即使有這種可能，菌體DNA由于一次性改變太大，細胞代謝嚴重失調(diào)，而失去生存的可能性。但是復(fù)合理化因素交替處理時，誘變劑量應(yīng)適中或偏低。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是獲得多功能產(chǎn)酶強化菌株的關(guān)鍵，首先要從自然界獲得性狀優(yōu)良的菌株，經(jīng)過誘變改良后，可以作為原生質(zhì)體融合的親本，經(jīng)過融合可獲得多功能強化菌株。原生質(zhì)體融合比常規(guī)遺傳育種具有明顯優(yōu)勢，它使親本的全部遺傳物質(zhì)進行重組，雙親優(yōu)良性狀的保留率更高，但是原生質(zhì)體融合存在較大重組隨機性。相比以上方法，基因工程育種具有可操作性及目的性強等優(yōu)點，目前在實驗室階段已成功克隆纖維素酶基因，并轉(zhuǎn)化細胞進行表達，但其目的產(chǎn)物分泌量不盡人意，還需進一步研究。另外還應(yīng)結(jié)合基因修飾技術(shù)來改良產(chǎn)纖維素酶基因，以構(gòu)建出快速高效表達纖維素酶的基因組成。除了研究菌株內(nèi)部因素外，添加酶助劑等外部因素也很重要，因此，也應(yīng)加大尋找理想的酶助劑的研究力度，使纖維素酶的活性能更好的發(fā)揮出來。

選育和改良酶活性高、耐受性好、酶系多樣均衡的高產(chǎn)纖維素酶菌株仍然是纖維素酶產(chǎn)業(yè)化研究的重點。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，對高產(chǎn)纖維素酶工程菌研究的逐漸深入和完善，將大大地推動纖維素酶產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。