脂肪酶催化縮聚合成脂肪族聚酯的研究進(jìn)展

于 躍 楊 興 韓志躍 劉 歡 王 芳 鄧 利*

(1.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100029； 2.北京理工大學(xué) 爆炸科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081)

引 言

脂肪族聚酯是由二元醇和二元羧酸發(fā)生縮聚反應(yīng)而生成的一類高分子聚合物，具有可水解的酯鍵結(jié)構(gòu)，是一種可生物降解的材料，在纖維、農(nóng)業(yè)、組織支架、包裝材料及藥物遞送系統(tǒng)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，脂肪族聚酯主要通過(guò)化學(xué)聚合法合成，使用如錳、鋅、鈣、鈷、鎂等金屬元素的乙酸鹽、氧化銻和氧化鈦等材料作為催化劑[1]，反應(yīng)溫度通常高于180 ℃。高溫不適用于熱不穩(wěn)定或化學(xué)不穩(wěn)定的單體和官能團(tuán)(如碳碳雙鍵)，可能會(huì)導(dǎo)致一系列副反應(yīng)的發(fā)生，如凝膠化、分解、變色等反應(yīng)[2-3]。此外，當(dāng)聚酯應(yīng)用于生物醫(yī)用材料時(shí)，金屬催化劑的殘留物會(huì)對(duì)人體造成不利影響。

生物酶催化聚合是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的聚合方法，生物酶催化劑為提高生物基聚合物的性能和價(jià)值提供了機(jī)會(huì)，很多不同結(jié)構(gòu)的生物基單體已經(jīng)可以通過(guò)發(fā)酵或化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，所得的可降解產(chǎn)品(如聚乳酸等)有望減輕化石基聚合物(如塑料)對(duì)環(huán)境的不利影響。與化學(xué)法相比，生物酶催化法有以下優(yōu)點(diǎn)[4]：1)酶催化反應(yīng)的條件溫和，對(duì)熱不穩(wěn)定的官能團(tuán)(如酚羥基、醛基和碳碳雙鍵等)具有保護(hù)作用；2)具有立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性[5]；3)酶經(jīng)過(guò)固定化處理后，具有可重復(fù)利用性，可降低應(yīng)用成本[6]；4)可在無(wú)溶劑體系下反應(yīng)，避免后續(xù)有機(jī)溶劑的分離所帶來(lái)的成本和污染[7]；5)酶催化合成的聚酯的分子量分布均勻，多分散性指數(shù)(PDI)較低(接近1)；6)脂肪酶本身無(wú)毒，不含重金屬，且合成的聚酯能被人體降解，可滿足生物醫(yī)用材料的要求。因此，酶催化聚合反應(yīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

脂肪酶是應(yīng)用廣泛的一類催化聚合酶，除了可以催化長(zhǎng)鏈酯鍵的水解，生成甘油、脂肪酸以及甘油單酯和二酯外，脂肪酶還可以催化酯合成、酯聚合、酯交換及酰胺合成等反應(yīng)，其中聚酯和聚酰胺是脂肪酶可以催化聚合的兩類重要聚合物。在酶催化合成脂肪族聚酯中，主要通過(guò)3種類型的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)：開(kāi)環(huán)聚合、酯交換聚合和直接縮聚，其中直接縮聚的最大優(yōu)點(diǎn)是底物二元羧酸和二元醇容易獲得，無(wú)需經(jīng)過(guò)特殊處理。本文綜述了脂肪酶催化縮聚反應(yīng)合成脂肪族聚酯的研究進(jìn)展，介紹了脂肪酶的種類、飽和及不飽和脂肪族聚酯的酶催化合成，總結(jié)了酶催化法在聚酯合成中存在的問(wèn)題并提出了相應(yīng)的對(duì)策。

1 脂肪酶

1.1 脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

脂肪酶又稱為三?；视王；饷?，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞中。其分子量大小各異，最小的為20～25 kDa，最大的為60～65 kDa。脂肪酶的活性中心包含親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)兩部分，活性中心中的絲氨酸殘基靠近疏水端，因此表現(xiàn)為“外疏水、內(nèi)親水”的特性[6]。脂肪酶是一種典型的α/β水解酶，在活性口袋的上方有一個(gè)螺旋“蓋子”，這個(gè)蓋子的開(kāi)啟和關(guān)閉直接影響到底物能否被催化，同時(shí)也使得酶在溶解時(shí)產(chǎn)生多構(gòu)象狀態(tài)(open and closed)。通常，脂肪酶具有表面激活效應(yīng)，即螺旋“蓋子”在水和有機(jī)物的表面被激活而打開(kāi)，這也是其區(qū)別于酯酶的重要標(biāo)志。另外，脂肪酶都具有催化三聯(lián)體Ser- Asp- His，它們形成質(zhì)子傳遞鏈，加速了Ser與底物基團(tuán)的作用。在酶蛋白的中心有一個(gè)長(zhǎng)約25 ?的“L”形疏水口袋，這是底物與酶作用的主要場(chǎng)所，在疏水口袋壁上共有21個(gè)氨基酸參與酶和底物的結(jié)合[8]。

1.2 脂肪酶的催化過(guò)程

脂肪酶的催化過(guò)程遵循“乒乓機(jī)制”，當(dāng)脂肪酶與底物作用時(shí)，覆蓋活性中心的“蓋子”發(fā)生移動(dòng)而暴露活性中心，開(kāi)啟催化反應(yīng)。其活性中心催化三聯(lián)體中的組氨酸吸收絲氨酸上的一個(gè)質(zhì)子，然后絲氨酸親核進(jìn)攻底物羰基上的碳原子，形成酶- 底物復(fù)合物中間體[7]，然后釋放產(chǎn)物，釋放后再結(jié)合底物繼續(xù)催化反應(yīng)，如此循環(huán)往復(fù)[9-10]。脂肪酶催化酯化反應(yīng)的關(guān)鍵中間體是酶催化位點(diǎn)絲氨酸殘基上的羥基參與形成的活性酯，生成的中間體被醇攻擊后得到酯。各種羧酸、甲酯、乙烯基酯和鹵代烷基酯等已被用作脂肪酶催化合成聚酯的單體[11]。

圖1 脂肪酶催化的縮聚反應(yīng)Fig.1 Lipase-catalyzed polycondensation

1.3 脂肪酶的種類

脂肪酶的種類有很多，依據(jù)來(lái)源不同可以分為動(dòng)物性脂肪酶、植物性脂肪酶和微生物性脂肪酶。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，因此，微生物性脂肪酶具有比動(dòng)植物性脂肪酶更廣的pH作用范圍和反應(yīng)溫度范圍以及更高的底物專一性。微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的發(fā)酵微生物有黑曲霉(Aspergillusniger)、假絲酵母(Candida)等，它們適合工業(yè)化生產(chǎn)，且易于獲得高純度樣品，因此微生物性脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源。Novozym 435酶是目前最常用的商業(yè)化的高效率固定化脂肪酶[11]，由南極假絲酵母脂肪酶B(Candidaantarcticalipase B，CALB)通過(guò)界面活化吸附在甲基丙烯酸樹(shù)脂(Lewatit VP OC 1600)上制成[12]。

譚天偉等[13]通過(guò)對(duì)假絲酵母菌種Candidasp.99- 125進(jìn)行多種方式誘變，得到假絲酵母脂肪酶，經(jīng)純化，脂肪酶的比酶活可達(dá)5 035 U/mg。該脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈不飽和甘油酯以及長(zhǎng)鏈脂肪酸(C12～C18)甲酯表現(xiàn)出較高的活性，可用于催化合成長(zhǎng)鏈脂肪酸酯和中鏈甘油酯、維生素A棕櫚酸酯和生物柴油，轉(zhuǎn)化率均在90%以上。此外，將來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)的脂肪酶固定化[14]，制備成Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM等固定化酶，也可以用于催化酯化和轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)[15]。

2 脂肪酶催化縮聚反應(yīng)

2.1 縮聚原理

縮聚反應(yīng)分為低分子二元酸(或其活性酯)與二元醇的縮聚以及羥基酸(或其活性酯)的自縮聚兩種。底物之間通過(guò)脫去低分子量的副產(chǎn)物(水或小分子醇類)，形成新的酯鍵，從而合成高分子聚合物(圖1)。酶催化縮聚反應(yīng)與水解反應(yīng)之間存在競(jìng)爭(zhēng)，因此限制了聚酯分子量的增長(zhǎng)。在不改變聚合反應(yīng)平衡的條件下，反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間和較大的酶量，并且得到的聚合物的分子量也較低。反應(yīng)中可以通過(guò)抽真空或添加帶水劑等方式不斷去除小分子，以提高聚酯產(chǎn)物的分子量[16-17]。

2.2 飽和脂肪族聚酯的合成

2.2.1飽和脂肪族聚酯

飽和脂肪族聚酯是分子結(jié)構(gòu)中除了酯鍵外不再含有雙鍵等不飽和鍵的聚酯。通過(guò)采用不同的多元酸和多元醇可以合成出不同類型、不同特性的飽和聚酯。

采用直鏈結(jié)構(gòu)的多元醇與多元酸反應(yīng)，可以得到具有線性結(jié)構(gòu)的熱塑性樹(shù)脂，其柔韌性非常好，主要用作生活中的各種塑料，如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是一種典型的線性聚酯，由1,4-丁二酸與1,4-丁二醇縮聚而成。如果采用含有苯環(huán)的多元酸與多元醇反應(yīng)，則得到含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的聚酯，如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)，苯環(huán)的剛性特征賦予聚酯硬度，而苯環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)特征賦予聚酯耐化學(xué)性，因此這類聚酯可作為強(qiáng)度很高的纖維產(chǎn)品應(yīng)用于軍工等領(lǐng)域。

關(guān)于飽和聚酯酶催化合成工藝，國(guó)內(nèi)外已有很多相關(guān)報(bào)道，表1總結(jié)了脂肪酶在催化合成飽和脂肪族聚酯中的應(yīng)用?？梢钥闯?，Novozym 435是最常用的催化聚酯合成的酶，反應(yīng)溫度通常在70～90 ℃之間，反應(yīng)時(shí)間大于20 h，可以在有機(jī)溶劑或無(wú)溶劑的條件下進(jìn)行反應(yīng)。

表1 脂肪酶催化飽和脂肪族聚酯的合成

2.2.2脂肪酶催化二元酸和二元醇聚合

Mahapatro等[18]使用CALB催化己二酸和1,8-辛二醇的縮聚反應(yīng)，于70 ℃反應(yīng)48 h，合成了分子量為28 500的聚酯，并且發(fā)現(xiàn)酶催化法合成的產(chǎn)物的PDI比化學(xué)催化法低；將Lewatit上的CALB濃度從0.1%(CALB占Lewatit的質(zhì)量分?jǐn)?shù))增加到1%時(shí)，產(chǎn)物的分子量略有增加；游離的CALB對(duì)聚合反應(yīng)也有催化活性，但相對(duì)于其固定化形式，鏈增長(zhǎng)較慢；在65～90 ℃之間，聚合反應(yīng)對(duì)反應(yīng)溫度的依賴性很小。

Mahapatro等[19]發(fā)現(xiàn)脂肪酶Novozym 435可以在二苯醚中保持80%的活性；還發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)鏈的二元酸(癸二酸和己二酸)和二元醇(1,8-辛二醇和1,6-己二醇)體系的反應(yīng)活性高于短鏈的二元酸(丁二酸和戊二酸)和二元醇(1,4-丁二醇)體系。

Azim等[20]以CALB為催化劑、二苯醚為溶劑，以丁二酸二乙酯和1,4-丁二醇為原料制備了單相反應(yīng)混合物，合成了數(shù)均分子量為38 000、PDI為1.39的聚酯；發(fā)現(xiàn)添加分子篩或減壓可以在反應(yīng)過(guò)程中去除小分子產(chǎn)物和水，提高聚酯的分子量；與短鏈單體相比，長(zhǎng)鏈單體具有更高的反應(yīng)活性。

酶催化酯化縮聚反應(yīng)還可以在無(wú)溶劑體系中進(jìn)行，使酶催化反應(yīng)更加環(huán)保。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)Candidasp.99- 125產(chǎn)生的脂肪酶在無(wú)溶劑體系下能夠有效地催化合成聚癸二酸丁二酯的縮聚反應(yīng)，反應(yīng)24 h可使聚合物的分子量達(dá)到15 800。該課題組還采用β-環(huán)糊精修飾聚合物分子以起到支撐作用，保持低聚物正確的鏈構(gòu)象，避免其凝聚，從而進(jìn)一步提高了聚合物產(chǎn)物的分子量[22]。

通過(guò)Novozym 435催化縮聚制備多元嵌段聚酯已有文獻(xiàn)報(bào)道[25-27]，所得聚酯具有很好的熱塑性、可生物降解性和生物相容性。研究表明，3種或3種以上單體的聚合可以用來(lái)制備多種功能性高分子材料，比由2種單體聚合的材料具有更優(yōu)秀的性能，為改善傳統(tǒng)高分子材料的性能提供了一種很有前途的手段[25-27]。

以上介紹了一些關(guān)于飽和脂肪族聚酯的酶催化合成的研究工作，可以看出，酶催化合成聚酯的過(guò)程中反應(yīng)條件十分溫和，非常節(jié)約能源。但突出的一個(gè)問(wèn)題是產(chǎn)物的分子量較小，難以進(jìn)一步提升。因此如何通過(guò)酶催化的方式獲得分子量更大的聚酯以滿足實(shí)際需求，是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的一個(gè)研究重點(diǎn)。

2.2.3脂肪酶催化酸酐、二酯聚合

除了二元酸和二元醇外，酸酐、二酯參與的縮聚反應(yīng)可以減少水的生成，有利于平衡向聚合物生成的方向移動(dòng)。

丁二酸酐和1,8-辛二醇在脂肪酶Candidaantarctica的催化下聚合，在室溫下就可以合成數(shù)均分子量達(dá)10 000的聚酯[23]。除二元醇外，多元醇也可以作為反應(yīng)原料，通過(guò)控制反應(yīng)條件來(lái)控制支化度，進(jìn)而調(diào)節(jié)材料的疏水性。

Taresco等[24]以己二酸二乙烯酯和甘油為原料，經(jīng)Novozym 435催化縮聚，制備了聚己二酸甘油酯，并通過(guò)控制反應(yīng)溫度來(lái)控制支化度，該材料可以作為工程固體分散體或納米顆粒的一種成分，具有潛在的醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值。

2.2.4脂肪酶催化其他單體聚合

酶法縮聚為熱穩(wěn)定性差的單體提供了一種有效的聚合手段，如具有硅氧烷官能團(tuán)的單體。含硅聚酯因其獨(dú)特的性能，如低玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、低表面能、高透氣性和良好的生物相容性而備受關(guān)注。將1,3-雙(3-羧丙基)四甲基二硅氧烷與二元醇(1,4-丁二醇、1,6-己二醇和1,8-辛二醇)在無(wú)溶劑體系中于50～90 ℃減壓，使用Novozym 435催化縮聚反應(yīng)，可得到最大分子量為20 000的含硅聚酯[28]，該縮聚反應(yīng)如圖2所示。該聚合物與聚乙二醇再經(jīng)過(guò)Novozym 435酶催化聚合，可以生成雙親性嵌段共聚物[29]。此外，雙(3-羥丙基)聚二甲基硅氧烷與一系列二元羧酸(琥珀酸、己二酸和癸二酸)經(jīng)過(guò)Novozym 435酶催化聚合，可得到產(chǎn)率大于90%的聚硅氧烷- 聚酯[30]。

圖2 脂肪酶催化二元醇與1,3-雙(3-羧丙基)四甲基 二硅氧烷的縮聚反應(yīng)[28]Fig.2 Lipase-catalyzed polycondensation of diols with 1,3-bis- (3-carboxypropyl)-tetramethyldisiloxane[28]

酯化縮聚反應(yīng)已擴(kuò)展到含糖組分的產(chǎn)物，糖基運(yùn)載工具因具有固有的生物相容性和生物黏附性/靶向性而備受關(guān)注。Khatri等[31]在無(wú)溶劑條件下，以Novozym 435為催化劑，合成了新型糖基聚乙二醇雙親性共聚物，可以作為藥物載體。Perin等[32]采用Novozym 435為催化劑，在叔丁醇中以D-果糖和D-葡萄糖為原料，使用甲基丙烯酸三氟乙酯作為甲基丙烯酸供體，生成甲基丙烯酰-D-果糖和甲基丙烯酰-D-葡萄糖基單體，并以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，制得聚甲基丙烯酰果糖水凝膠，其具有較高的機(jī)械穩(wěn)定性和水膨脹能力。赤蘚糖醇(C4)、木糖醇(C5)、核糖醇(C5)、甘露醇(C6)、葡萄糖醇(C6)和半乳糖醇(C6)也可以與二元酸聚合。在反應(yīng)過(guò)程中，一級(jí)羥基的反應(yīng)活性高于二級(jí)羥基，因此在酶法縮聚過(guò)程中，糖多元醇的立體化學(xué)性并沒(méi)有發(fā)生變化[33]。

羥基酸及其酯的自縮聚也可以通過(guò)酯化(脫水)和酯交換縮聚來(lái)進(jìn)行。在羥基酸的自縮聚反應(yīng)中，脂肪酶對(duì)長(zhǎng)鏈單體表現(xiàn)出更高的反應(yīng)活性。這是因?yàn)閱误w鏈越長(zhǎng)，其疏水性越大，脂肪酶在與疏水性更大的底物結(jié)合時(shí)更容易被激活，這是脂肪酶特有的一種界面活化現(xiàn)象。除了均聚反應(yīng)外，脂肪酶催化的兩種或更多種羥基酸的共聚反應(yīng)是改變聚合物性質(zhì)的有效工具，例如乳酸和乙醇酸共聚可以合成普通藥物載體聚(乳酸- 乙醇酸)[34]。蓖麻油酸是蓖麻油的主要成分，通過(guò)脂肪酶催化自聚合可得到分子量為100 600的聚蓖麻油酸[35]，該聚合物可以在過(guò)氧化二異丙苯的催化下與不溶于氯仿的聚合物交聯(lián)。此外，蓖麻油酸還可以通過(guò)氫化轉(zhuǎn)化為12-羥基硬脂酸甲酯，然后與12-羥基十二烷酸共聚，合成新型綠色可降解的彈性體[36]。

2.3 不飽和脂肪族聚酯的合成

2.3.1不飽和脂肪族聚酯

不飽和聚酯中的雙鍵使得聚酯具有交聯(lián)性，雙鍵在高溫有氧條件下可以打開(kāi)，交聯(lián)后可以有效提高產(chǎn)品的黏合度。不飽和聚酯黏合劑(如聚氨酯黏合劑)的黏附性能好，透明度高，常溫下即可固化，且耐腐蝕性好，使用方便。不飽和聚酯是增強(qiáng)塑料中使用最普遍的材料，具有室溫可固化、黏度適中、可常壓成型、固化后無(wú)小分子副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，其力學(xué)性能優(yōu)于酚醛樹(shù)脂，但略低于環(huán)氧樹(shù)脂[37]。

2.3.2不飽和脂肪族聚酯的合成

目前不飽和聚酯大多由化學(xué)法合成，而酶催化法合成不飽和聚酯正逐漸受到人們的關(guān)注，表2總結(jié)了關(guān)于脂肪酶催化合成不飽和聚酯的研究工作。

表2 脂肪酶催化不飽和脂肪族聚酯的合成

衣康酸是一種通過(guò)土曲霉(Aspergillusterreus)發(fā)酵獲得的二元酸[3]，由于乙烯基部分和1,4位置羧基的功能性，衣康酸經(jīng)常作為聚合單體，為聚合物合成提供引入復(fù)雜官能團(tuán)的機(jī)會(huì)。在化學(xué)催化法中，強(qiáng)酸是常用的催化劑，在聚合過(guò)程中需加入對(duì)苯二酚或甲氧基苯酚等阻聚劑對(duì)衣康酸的碳碳雙鍵進(jìn)行保護(hù)，以防止雙鍵在高溫下發(fā)生自聚。而酶催化法的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)溫度往往為70 ℃，在此溫度下，衣康酸的雙鍵很少發(fā)生自由基聚合，因此酶催化法是保護(hù)雙鍵的最好途徑。

Jiang等[38]以衣康酸二甲酯、1,4-丁二醇和各種二羧酸乙酯為單體，CALB為催化劑，二苯醚為溶劑，通過(guò)兩步聚合制備了一系列飽和及不飽和的脂肪族聚酯，分子量可達(dá)94 000；研究發(fā)現(xiàn)，二羧酸乙酯的鏈越長(zhǎng)，CALB的活性越高，催化合成的產(chǎn)物分子量也越大，其中CALB對(duì)己二酸二乙酯的活性最高。Nguyen等[39]使用Novozym 435為催化劑，以甘油、季戊四醇、壬二酸、妥爾油脂肪酸(主要成分為油酸、亞油酸)為底物合成高支化聚酯材料，可以作為黏合劑和薄膜的成分。

由于生物酶的催化選擇性，可以合成化學(xué)法無(wú)法催化合成的功能性聚酯。Br?nnstr?m等[40]以衣康酸二甲酯、丁二酸二甲酯和1,4-丁二醇為原料合成聚酯，研究了不同催化劑的催化效果，發(fā)現(xiàn)CALB是最有效的催化劑；在60 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，CALB對(duì)衣康酸二甲酯和丁二酸二甲酯的共軛側(cè)基具有選擇性，使得衣康酸基主要位于產(chǎn)物聚酯鏈的末端(圖3)；生物酶法合成的聚酯經(jīng)過(guò)交聯(lián)，表現(xiàn)出與化學(xué)法催化合成的聚酯一樣的性質(zhì)，且酶催化生成的產(chǎn)物具有不變色的優(yōu)點(diǎn)。Pellis等[41]使用酶催化法在無(wú)溶劑條件下合成了衣康酸、富馬酸和馬來(lái)酸基聚酯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在縮聚反應(yīng)后，原有的功能性乙烯基團(tuán)被很好地保護(hù)了起來(lái)，且在反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有凝膠現(xiàn)象，證實(shí)了所產(chǎn)生的聚合物具有線性結(jié)構(gòu)。Guarneri等[42]在無(wú)溶劑的溫和條件下，利用脂肪酶催化合成聚(1,4-環(huán)己烷二甲醇衣康酸酯)，溫和的反應(yīng)條件保留了衣康酸的不穩(wěn)定乙烯基，并避免了1,4-環(huán)己烷二甲醇的分解。經(jīng)過(guò)上述反應(yīng)得到的聚酯中仍含有被保護(hù)的乙烯基，可繼續(xù)與己二胺和2-苯乙胺等進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，得到交聯(lián)度更高的聚合物，這些材料均無(wú)法通過(guò)常規(guī)的化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)合成。

圖3 衣康酸基在不飽和聚酯的末端[40]Fig.3 Itaconic acid group at the end of an unsaturated polyester chain[40]

2.3.3底物對(duì)脂肪酶催化的影響

不飽和底物對(duì)脂肪酶催化的產(chǎn)物的分子量有影響。Barrett等[43]使用衣康酸、乙二醇和戊二醇為底物，通過(guò)酶促反應(yīng)分別合成了3種聚酯：線性聚(1,4-環(huán)己烷二甲醇衣康酸酯)、聚(聚乙二醇衣康酸酯)和聚(3-甲基-1,5-戊二醇衣康酸酯-co-3-甲基-1,5-戊二醇己二酸酯)，其中最高的分子量達(dá)12 000，這些聚酯可用于藥物遞送系統(tǒng)、組織工程支架和其他醫(yī)用材料；研究還發(fā)現(xiàn)衣康酸二甲酯是酶促聚合的理想單體，其原因是增加了單體的柔性、延長(zhǎng)了碳鏈，使得反應(yīng)更易于進(jìn)行，從而提高了產(chǎn)物聚酯的分子量。

Jiang等[44]指出在酶促縮聚條件下，丁二酸在1,4-丁二醇中的溶解度較小，導(dǎo)致聚合效率較低，為避免聚合過(guò)程中兩相傳質(zhì)的發(fā)生，選擇衣康酸二甲酯為反應(yīng)單體；同時(shí)還研究了脂肪酶對(duì)底物衣康酸二酯的親和性，發(fā)現(xiàn)酶對(duì)底物的親和性由高到低為：衣康酸二甲酯>衣康酸二乙酯>衣康酸二丁酯>衣康酸，可以看出，衣康酸不受Novozym 435的青睞，因?yàn)橐驴邓嵩诖既芤褐胁蝗?，這使得酶顆粒無(wú)法與之接觸，也就無(wú)法進(jìn)行酶催化。衣康酸二甲酯是Novozym 435最易聚合的二酯，因?yàn)榕c乙醇(沸點(diǎn)78.4 ℃)和正丁醇(沸點(diǎn)117.7 ℃)相比，縮聚反應(yīng)生成的小分子產(chǎn)物甲醇(沸點(diǎn)64.7 ℃)在真空下更容易被除去。此外，烷基酯的化學(xué)反應(yīng)性是另一個(gè)原因，眾所周知，甲酯在化學(xué)上比乙酯和丁酯更具活性。

Yang等[45]以油酸、芥酸和環(huán)氧硬脂酸為原料，采用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法，以高轉(zhuǎn)化率合成了生物基ω-羧基脂肪酸單體；然后在Novozym 435的催化下單體與二元醇進(jìn)行縮聚，得到分子量為25 000～57 000的不飽和聚酯和具有環(huán)氧基團(tuán)的聚酯，并且發(fā)現(xiàn)底物二元醇的鏈越長(zhǎng)，產(chǎn)物聚酯的熔點(diǎn)和分子量就越高。

3 酶法合成脂肪族聚酯的不足及對(duì)策

目前，使用酶作為催化劑合成脂肪族聚酯在生產(chǎn)過(guò)程和實(shí)際應(yīng)用中仍然存在以下不足。

(1)與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，酶催化生成的聚合物的分子量仍較低。這一問(wèn)題可以通過(guò)兩種方法來(lái)改善：一種方法是在酶催化縮聚之后，再通過(guò)化學(xué)催化進(jìn)行第二步反應(yīng)，例如衣康酸聚酯制備成功后，利用其未反應(yīng)的乙烯基再進(jìn)行加成反應(yīng)，以提高產(chǎn)物的分子量。另一種方法是采用分步聚合法，即先進(jìn)行初始聚合以獲得功能化末端的低聚物，然后在較高溫度或較低壓力下進(jìn)行第二步聚合或交聯(lián)反應(yīng)。低聚物的合成避免了高聚物因沉淀而脫離反應(yīng)體系的情況，低聚物的功能性末端可以在第二步反應(yīng)中用于聚合或交聯(lián)，而無(wú)需脂肪酶就可獲得高分子量的材料。兩步法的合成方式避免了許多問(wèn)題，并且與酶催化直接縮聚合成聚酯相比，提供了更快的反應(yīng)速率和更高的產(chǎn)物分子量[46]。

(2)在有機(jī)溶劑、表面活性劑等物質(zhì)的存在下，酶會(huì)在高溫下從載體中釋放[47]。據(jù)報(bào)道，Novozym 435也存在這種現(xiàn)象[48]。因?yàn)槊傅尼尫?，?dāng)需要停止實(shí)驗(yàn)時(shí)將固定化酶與反應(yīng)體系分離，但游離在溶劑中的酶無(wú)法使反應(yīng)停止，失去了反應(yīng)的可控制性[49]。酶的滲漏是固定化脂肪酶的一個(gè)普遍問(wèn)題，最好的解決方案是交叉連接酶以防止酶的解吸[50]?？刹扇∑暇厶侨┗蚱暇厶橇蛩猁}等以物理方式與酶蛋白交聯(lián)[51]，例如戊二醛或醛- 葡聚糖[52]，或者添加一些離子或化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)[53]，使固定化酶的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

(3)在催化反應(yīng)中，機(jī)械攪拌使酶的載體顆粒變得脆弱，甚至?xí)姑割w粒破碎[54]，尤其是在工業(yè)層面上，破碎的酶可能會(huì)堵住過(guò)濾器[55]。為了避免載體被破壞，可以采用較溫和的攪拌方式[56]，或者在固定化酶上涂覆一些剛性的覆蓋層，以避免載體斷裂[57]。例如，在Novozym 435表面涂上硅酮等有機(jī)硅，在劇烈攪拌下可避免載體支架被破壞，并且可以抑制酶的釋放，使得固定化酶的活性能保持在90%以上[57]。

(4)脂肪酶的許多應(yīng)用環(huán)境是無(wú)水介質(zhì)(例如疏水性溶劑)，在反應(yīng)過(guò)程中底物可能釋放一些親水性化合物，導(dǎo)致這些化合物在酶中積聚。例如，在酯化反應(yīng)中，水是反應(yīng)的副產(chǎn)物，酸也可以積聚在這種環(huán)境中，從而使得酶暴露在非常低的pH值下而失活。此外，水的積累也會(huì)使反應(yīng)體系中的酶不利于接近底物，從而降低酶的活性[58]。一種解決方法是使用超聲波處理和分子篩吸附，可以部分減少水在酶上的積聚[59-60]；另一種方法是改變固定化載體，使用一些疏水性更強(qiáng)的固定化材料，這些材料更能抵抗溶劑的溶解，并且由于更加疏水而防止酶的積水[61-62]。

(5)使用酶法合成脂肪族聚酯的反應(yīng)速率較慢，且酶的價(jià)格較高，致使酶法合成聚酯的生產(chǎn)成本過(guò)高，迄今為止只有少數(shù)生產(chǎn)工藝實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。這主要是由于在底物接受和工藝穩(wěn)定性方面缺乏適當(dāng)?shù)拿钢苿?，大大降低了成本效益。針?duì)酶蛋白本身的優(yōu)化，目前有兩個(gè)方向：一是通過(guò)蛋白質(zhì)工程和基因工程將已有的脂肪酶進(jìn)行改造，增加其穩(wěn)定性、催化活性和選擇性；二是將酶蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾和固定載體優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性，增加固定化酶的重復(fù)使用率，降低產(chǎn)物分離成本[63]。

4 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，由于脂肪酶催化合成聚酯具有諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其是它可以得到許多化學(xué)法催化較難實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，包括硅氧烷、環(huán)氧樹(shù)脂和乙烯基部分，因此酶催化法合成脂肪族聚酯具有良好的應(yīng)用前景。 但是到目前為止，該策略仍在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)應(yīng)用，主要原因是酶的成本和催化活性的限制。相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，酶催化聚合會(huì)取得突破性進(jìn)展，這些問(wèn)題也會(huì)逐步得到解決，最終實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。