綠僵菌與小檗堿復配制備水分散粒劑

楊 肖 葛喜珍 劉國新 田平芳*

(1.北京化工大學 生命科學與技術(shù)學院， 北京 100029； 2.北京聯(lián)合大學 生物化學工程學院， 北京 100023；3.河北省化工研究院有限公司， 石家莊 050031)

引 言

金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是廣譜昆蟲病原菌[1]，可感染200多個種屬的昆蟲，其作為生物殺蟲劑用于防治有害昆蟲已有百年歷史[2-4]。與化學農(nóng)藥相比，生物殺蟲劑具有毒性小、專一性強、環(huán)境友好等優(yōu)點，逐漸成為今后農(nóng)業(yè)殺蟲劑發(fā)展的趨勢，具有廣闊的應用前景[5]。近40年來，已經(jīng)有80多種綠僵菌農(nóng)藥進行了登記，其制備工藝取得重要進展，不僅改進了傳統(tǒng)粉狀劑型，而且產(chǎn)生了許多能較好地適應環(huán)境變化的新劑型，例如油乳劑[6-7]、水劑[8]、顆粒劑[9]、乳粉劑[10]、懸乳劑[11]和微膠囊劑[12]等劑型。雷仲仁等[7]用綠僵菌LA06油劑防治東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)，當以V(大豆油)∶V(煤油)=3∶7配制油劑時，第18天蟲口減退率達81.1%，雖然防治效果好，但其破壞環(huán)境且成本偏高。楊華等[12]用綠僵菌微膠囊劑對林間黃脊竹蝗(Ceracriskiangsu)跳蝻進行防治，防治效果達92.59%，但微囊劑的制備工藝復雜且成本較高。水分散粒劑(water-dispersible granule, WG)是遇水即迅速崩解并分散為懸液的粒狀制劑[13-14]。與傳統(tǒng)劑型相比，水分散粒劑具有粉塵少、成分均勻、流動性強、對環(huán)境友好等優(yōu)點，并且對運輸和包裝的要求低。此外，水分散粒劑可兼容高濃度藥物，許多不適合制備成粉劑或乳油的有效成分可采用該劑型。

小檗堿(berberine)又稱黃連素，是從黃連(Coptischinensis)、黃柏(Phellodendronchinense)等藥用植物中提取的一種季銨生物堿[15]。小檗堿在傳統(tǒng)臨床上用于治療腹瀉。此外，小檗堿還能有效抑制許多植物病原菌，例如白粉病菌等，因此作為天然農(nóng)藥得到了推廣應用[16-19]。

早在上世紀70、80年代，許多化學農(nóng)藥出現(xiàn)抗藥性，農(nóng)藥復配成為研發(fā)熱點[20]。隨著生物農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)，復配已不局限于化學農(nóng)藥，而是拓展到了生物農(nóng)藥，甚至是將化學農(nóng)藥和生物農(nóng)藥進行復配[21]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在試驗濃度下對很多真菌病原具有較強的抑制作用，而在相同濃度下對綠僵菌的生長沒有明顯抑制作用[22]。為了開發(fā)既抗蟲又抗病的雙效制劑并降低田間施藥成本，本文將綠僵菌與小檗堿復配，制備了水分散粒劑。測定了小檗堿對綠僵菌的有效中濃度(EC50)，通過單因素試驗及響應面法分析篩選合適的載體以及潤濕劑、分散劑、黏結(jié)劑、崩解劑等助劑。以篩選的配方制備的水分散粒劑，其質(zhì)量檢測結(jié)果符合相關(guān)行業(yè)標準。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1供試菌種和小檗堿

金龜子綠僵菌CQMa421孢子粉(含水量2.39%，孢子萌發(fā)率90.02%，含孢量4.26×1010cfu/g，雜菌率1.32%)，重慶聚立信生物工程有限公司；小檗堿(含量97%)，陜西慧科植物開發(fā)有限公司。

1.1.2供試載體和助劑

載體 硅藻土、滑石粉、高嶺土、白炭黑，均為藥用級，上海麥克林生化科技有限公司。

潤濕劑 十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)、十二烷基磺酸鈉(SDBS)(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；拉開粉BX(化學純)、脂肪醇聚氧乙烯醚JFC- U(日化級)，山東優(yōu)索化工科技有限公司；乳化劑NP- 10(分析純)，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；潤濕劑HR- 3408，吉水文山航潤化工廠。

分散劑 木質(zhì)素磺酸鈣、木質(zhì)素磺酸鈉、亞甲基二萘磺酸鈉(NNO)、亞甲基雙甲基萘磺酸鈉(MF)，均為化學純，上海麥克林生化科技有限公司；羥丙基纖維素(HPC)Ⅱ型，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

黏結(jié)劑 糊精(生物試劑)、馬鈴薯淀粉(生物試劑)，北京索萊寶科技有限公司；聚乙烯醇1799(化學純)、明膠(生物試劑)，上海麥克林生化科技有限公司；聚乙二醇(平均數(shù)均分子量10 000)、羧甲基纖維素鈉(黏度1 000～1 400 mPa·s)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

崩解劑 海藻酸鈉(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；可溶性淀粉(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；尿素(分析純)、氯化鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基 將200 g馬鈴薯切成小塊，水煮(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用8層紗布過濾。加入葡萄糖20 g溶解，再加入瓊脂粉20 g溶解。加水至1 000 mL，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基 蛋白胨1 g，酵母粉1 g，葡萄糖4 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.1 g，KCl 0.1 g，加入蒸餾水200 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗儀器

XB- K- 25型血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；YKY- 700型光學顯微鏡，上海永科光學儀器有限公司；LSHE- 600型生化培養(yǎng)箱，上海勒豐實業(yè)有限公司；標準檢驗篩，40目(篩孔徑0.425 mm)，浙江上虞市公路儀器廠；WD101A型烘箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；KLJ- 150型粉末造粒機，廣州市大祥電子機械設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1小檗堿對綠僵菌的EC50測定

將小檗堿粉末加入到PDA培養(yǎng)基中，配制含藥固體培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度梯度設為0、200、400、600、 800、1 000、2 000、3 000 μg/mL，每個質(zhì)量濃度重復測試3次。用打孔器從生長綠僵菌的PDA培養(yǎng)基上打取菌餅，接種到含小檗堿平板的中心處，恒溫培養(yǎng)箱正面放置，于26 ℃靜置培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量菌絲直徑，采用菌絲生長抑制法計算小檗堿對綠僵菌的EC50[23]。

1.3.2待測樣品制備

載體篩選 70%(質(zhì)量分數(shù)，下同)載體、30%綠僵菌孢子粉；

潤濕劑篩選 25%綠僵菌孢子粉、3%小檗堿，不同種類潤濕劑的含量分別為1%、3%、5%，硅藻土補足100%；

分散劑篩選 25%綠僵菌孢子粉、3%小檗堿、3%乳化劑NP- 10，不同種類分散劑的含量分別為1%、3%、5%，硅藻土補足100%；

黏結(jié)劑、崩解劑篩選 25%綠僵菌孢子粉、3%小檗堿粉、3%乳化劑NP- 10、崩解劑與黏結(jié)劑各10%，硅藻土補足100%。

將以上各組成分充分混勻，室溫保存一個月，作為待測樣品。

1.3.3生物相容性測定

將上述待測樣品粉末制成懸液，以純孢子懸液為對照(每毫升孢子數(shù)為103個)，測定其生物相容性。

孢子萌發(fā)率 將500 μL待測樣品滴加至含有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于160 r/min、(25±1)℃培養(yǎng)16 h。在光學顯微鏡下用血球計數(shù)板統(tǒng)計總孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，設置5個重復，按照式(1)計算孢子萌發(fā)率。

G=(X1/X0)×100%

(1)

式中，G為孢子萌發(fā)率，X1為發(fā)芽孢子數(shù)，X0為孢子總數(shù)。

菌絲生長速率[24]配制PDA培養(yǎng)基，115 ℃高壓蒸汽滅菌，倒板凝固后，在固體培養(yǎng)基中間打孔，接種上述待測樣品懸液20 μL，每個載體處理5個平板，以不加載體的培養(yǎng)基作為對照組。(25±1)℃下培養(yǎng)10 d，用游標卡尺測量菌絲直徑，按照式(2)計算菌絲生長速率。

Φ1=Φ2/10

(2)

式中，Φ1為菌絲生長速率，mm/d；Φ2為菌絲直徑，mm。

產(chǎn)孢量 在上述菌絲半徑的1/2處用打孔器取3次樣，置于0.05%吐溫80的無菌水中，加入適量小玻璃珠，160 r/min振蕩2 h，使孢子充分散開，在光學顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，按照式(3)計算產(chǎn)孢量。

C=X0/S

(3)

式中，C為產(chǎn)孢量，S為菌餅面積。

1.3.4載體和助劑的篩選

為了獲得最佳成分組合，減少試驗次數(shù)，通過單因素試驗，確定載體和潤濕劑的種類與用量。對于分散劑、崩解劑、黏結(jié)劑的種類與用量，先通過生物相容性試驗進行粗篩，然后使用Box- Behnken響應面法進行優(yōu)化，最終確定分散劑、崩解劑、黏結(jié)劑的用量。

1.3.5水分散粒劑制備

按照確定的比例將綠僵菌孢子粉和小檗堿充分混勻，制成母粉。在母粉中按照篩選好的處方比例添加潤濕劑、分散劑、崩解劑，最后用載體補足全量，混勻后噴入黏結(jié)劑的水溶液，使混合物的含水量保持在30%(質(zhì)量分數(shù))。加入粉末造粒機中造粒，于35 ℃低溫干燥，以水分≤5%為干燥終點，得到綠僵菌與小檗堿復配的水分散粒劑。

1.3.6水分散粒劑的質(zhì)量評價方法

崩解時間 在25 ℃下，向含有90 mL蒸餾水的具塞量筒(100 mL，內(nèi)高22.5 cm、內(nèi)徑28 mm)加入0.5 g水分散粒劑(粒徑250～1 410 μm)，塞住筒口，夾住量筒中部，以8 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，一般以樣品在水中完全崩解(無可見顆粒)的時間小于3 min為測試合格。

潤濕時間和含水量 按照GB/T 5451—2001[25]測定潤濕時間，按照 GB/T 1600—2001[26]中的“共沸蒸餾法”測定含水量。

懸浮率和雜菌率 按照 GB/T 14825—2006[27]測定懸浮率，按照NY/T 3282.1—2018[28]測定雜菌率。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。使用Duncan法進行多重比較分析，P<0.05說明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 載體篩選結(jié)果

由于分散劑中載體的添加量較大，故載體的選擇要綜合考慮其理化性質(zhì)、生物相容性及成本等因素[29-31]。表1為不同種類的載體對綠僵菌生長的影響。

表1 載體對綠僵菌的影響

標有不同字母者代表組間差異顯著(P<0.05)，標有相同字母者代表組間差異不顯著(P>0.05)，下同。

通過表1結(jié)果可知，滑石粉和白炭黑的孢子萌發(fā)率與產(chǎn)孢量均顯著低于對照組(不含載體)，說明二者與綠僵菌的生物相容性較差，推測可能與兩種載體的性能有關(guān)：滑石粉的pH值在6～10之間，白炭黑的pH值在3.5～4.6之間，偏酸性或偏堿性均不利于孢子生長。硅藻土和高嶺土的孢子萌發(fā)率和產(chǎn)孢量與對照組相比無明顯差異，而硅藻土的菌絲生長速率顯著高于高嶺土，同時考慮到硅藻土的密度小、吸水量大，因此選擇硅藻土作為水分散粒劑的載體。

將綠僵菌孢子粉以40%、35%、30%、25%、20%的添加量(質(zhì)量分數(shù)，下同)加入篩選的硅藻土載體中，混勻后測定潤濕時間，結(jié)果見圖1。濕潤時間隨著孢子粉添加量的增大而增大。參考行業(yè)標準NY/T 3282.3—2018[32]對潤濕時間的要求(小于2 min)，當孢子粉的添加量為25%時，濕潤時間為243 s?？紤]后續(xù)添加潤濕劑可以減少濕潤時間，同時為了盡量保證含藥量大，確定綠僵菌孢子粉的添加量為25%。

圖1 不同綠僵菌孢子粉添加量下的潤濕時間Fig.1 Wetting time with different amounts of M. anisopliae conidia

圖2 不同質(zhì)量濃度的小檗堿對綠僵菌生長的影響Fig.2 Effect of different mass concentrations of berberine on the growth of M. anisopliae

2.2 EC50測定結(jié)果和小檗堿用量的確定

2.2.1EC50測定結(jié)果

圖2為不同質(zhì)量濃度的小檗堿對綠僵菌生長的影響。由結(jié)果可知，綠僵菌在含有不同質(zhì)量濃度的小檗堿的培養(yǎng)基中生長情況不同，隨著小檗堿質(zhì)量濃度的增大，綠僵菌的菌絲生長變慢。按照1.3.1節(jié)的方法計算小檗堿對綠僵菌的EC50，幾率值可從生物統(tǒng)計機率值換算表[33]中查找，得出EC50=47.2 mg/mL。此值每毫升達到了毫克級，表明小檗堿對綠僵菌的生長無明顯抑制作用。

2.2.2小檗堿用量的確定

有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可強烈抑制桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)，EC50為4.69～8.72 μg/mL[16-17]。以往田間試驗發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌CQMa421防治白背飛虱[34]、甘藍菜青蟲和小菜蛾[35]、蘋果桃小食心蟲和草地蝗蟲[36]以及辣椒病毒病[37]的最適施藥濃度為(2.5～3.33)×106cfu/mL，防效可達88.35%～93.08%。根據(jù)綠僵菌分生孢子的最適施藥濃度為(2.5～3.33)×106cfu/mL時小檗堿用量可達到10 μg/mL，計算出小檗堿的添加量為2.66%～3.54%(質(zhì)量分數(shù)，下同)，為便于計算和操作，本文選取3%的添加量。

2.3 助劑篩選結(jié)果

2.3.1潤濕劑

潤濕劑的潤濕能力因種類和濃度不同而存在差異。表2為潤濕劑的種類和添加量對潤濕時間和孢子萌發(fā)率的影響。當不添加潤濕劑(對照組)時，綠僵菌孢子粉和載體的潤濕時間超過2 min。當潤濕劑的添加量為1%時，只有SDBS和BX的潤濕性不滿足行業(yè)標準[32]的要求，JFC- U和HR- 3408的潤濕時間最短，分別為8 s和25.25 s。當潤濕劑的添加量為3%時，除JFC- U組外，其他實驗組的潤濕時間與1%添加量相比均有所縮短，并且潤濕時間降幅較大，其中BX的潤濕時間減至120 s以內(nèi)。當潤濕劑的添加量為5%時，只有BX和NP- 10較添加量為3%時潤濕時間降幅較大。進一步考慮潤濕劑與分生孢子的生物相容性，當潤濕劑的添加量為1%時，除BX和NP- 10外，其他實驗組和對照組之間的孢子萌發(fā)率均存在顯著差異。隨著潤濕劑添加量的增加，孢子萌發(fā)率總體上有所減小。只有添加量為1%的BX組以及添加量為1%～5%的NP- 10組符合行業(yè)標準[32]對孢子萌發(fā)率的要求(≥85%)。

表2 潤濕劑的種類和添加量對潤濕時間和孢子萌發(fā)率的影響

綜合潤濕時間和生物相容性，并兼顧后續(xù)助劑及制備過程對孢子活性的影響，確定潤濕劑種類為NP- 10，其添加量為3%，此時測得的孢子萌發(fā)率達91.52%，潤濕時間為63.25 s。

2.3.2分散劑

表3為分散劑的種類和添加量對懸浮率和孢子萌發(fā)率的影響。當MF的添加量為1%～5%時，懸浮率均高于其他分散劑，說明MF的分散能力較強。當分散劑的添加量為1%和3%時，各分散劑組與對照組(不含分散劑)的孢子萌發(fā)率無顯著差異；當分散劑的添加量為5%時，只有MF與對照組的孢子萌發(fā)率有顯著差異(F=3.942，P<0.05)。因為分散劑均不能滿足行業(yè)標準[32]對懸浮率的要求(≥80%)，故將懸浮性能最好的兩種分散劑MF和木質(zhì)素磺酸鈣進行復配：2%MF+5%木質(zhì)素磺酸鈣，此時測得的懸浮率為81.34%，孢子萌發(fā)率為86.45%，滿足相關(guān)行業(yè)標準的要求，因此確定以MF和木質(zhì)素磺酸鈣的質(zhì)量比為2∶5的混合物作為制劑的分散劑。

表3 分散劑的種類和添加量對懸浮率和孢子萌發(fā)率的影響

2.3.3黏結(jié)劑和崩解劑

圖3為不同黏結(jié)劑和崩解劑對綠僵菌的生物相容性。各實驗組和對照組的孢子萌發(fā)率均有顯著差異。糊精、馬鈴薯淀粉、聚乙烯醇和羧甲基纖維素鈉的孢子萌發(fā)率高于其他黏結(jié)劑；海藻酸鈉與氯化鈉的孢子萌發(fā)率高于其他崩解劑。結(jié)果表明這些助劑的生物相容性較好，可進行下一步粗篩。

標有不同字母者代表組間差異顯著(P<0.05)，標有相同字母者代表組間差異不顯著(P>0.05)。圖3 黏結(jié)劑和崩解劑與綠僵菌的生物相容性Fig.3 Biocompatibility of binders and disintegrants with M. anisopliae

使用1.3.5的方法制備水分散粒劑，測定不同黏結(jié)劑(糊精、馬鈴薯淀粉、聚乙烯醇和羧甲基纖維素鈉)的崩解性能，并且將所制備的顆粒的性狀與市售的同種劑型(70%吡蟲啉水分散粒劑，江西禾益化工股份有限公司)進行粗略對比，結(jié)果見表4。與市售制劑相比，用糊精和馬鈴薯淀粉制備的顆粒偏硬，結(jié)塊嚴重，導致崩解遲緩；以聚乙烯醇為黏結(jié)劑時，顆粒粉末較多，且易碎；以羧甲基纖維素鈉為黏結(jié)劑時，顆粒硬度適中。因此本文選擇羧甲基纖維素鈉為最優(yōu)黏結(jié)劑。表5 為不同添加量的羧甲基纖維素鈉對崩解時間和顆粒性狀的影響。崩解時間隨著羧甲基纖維素鈉添加量的增加而增加；當羧甲基纖維素鈉的添加量為3%時，水分散粒劑的顆粒硬度適中。

表4 黏結(jié)劑篩選

表5 羧甲基纖維素鈉的添加量篩選

表6為海藻酸鈉和氯化鈉對崩解時間的影響。使用海藻酸鈉為崩解劑時，制劑的崩解時間比氯化鈉制成的制劑短。由表7可知，當海藻酸鈉的添加量為2%和6%時，制劑的崩解時間大于10 min，原因是崩解劑的添加量太少造成崩解遲緩。隨著崩解劑添加量的增加，制劑的崩解性能逐漸提高，當崩解劑的添加量為10%和15%時，崩解時間較短，分別為360.48 s和228.48 s。

表6 崩解劑篩選

表7 海藻酸鈉的添加量篩選

2.4 Box- Behnken響應面法試驗設計與結(jié)果

為了進一步優(yōu)化制劑的處方，以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box- Behnken采樣原理，以木質(zhì)素磺酸鈣添加量、羧甲基纖維素鈉添加量、海藻酸鈉添加量為變量(后期為保證懸浮率合格，根據(jù)木質(zhì)素磺酸鈣含量添加MF)，以崩解時間為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗(表8)，試驗方案及結(jié)果如表9所示。

表8 各因素編碼和水平

表9 試驗方案與結(jié)果

使用Design-Expert 10.0.1分析試驗結(jié)果，獲得二次多項式回歸方程：

Y=224-2.12A+78.38B-51.50C-0.5AB-0.75AC-0.75BC+39.5A2+40.5B2+41.75C2

式中，Y為崩解時間，A為木質(zhì)素磺酸鈣添加量，B為羧甲基纖維素鈉添加量，C為海藻酸鈉添加量。

響應面模型的方差分析結(jié)果如表10所示?；貧w模型的P<0.000 1，失擬項的P>0.05，此值不顯著，說明模型的預測值和真實值之間的擬合度較高。該模型的復相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，表明該模型可以解釋響應面中99.98%的可變性。模型中自變量A、B、C、A2、B2、C2的P值達到極顯著水平，說明分散劑添加量、黏結(jié)劑添加量和崩解劑添加量對制劑崩解性能的影響最為顯著，且各影響因素和響應值之間不是線性關(guān)系。根據(jù)F值大小，確定這3個因素對崩解時間的影響程度大小是：B>C>A。

表10 響應面模型的方差分析結(jié)果

根據(jù)建立的回歸模型，得出最優(yōu)處方為：分散劑添加量A為5.267%，黏結(jié)劑添加量B為1.667%，崩解劑添加量C為18.333%。在此條件下模型預測的崩解時間為174.702 s。根據(jù)軟件預測結(jié)果并考慮實際工藝設置，選取分散劑添加量A為5.3%、黏結(jié)劑添加量B為1.7%、崩解劑添加量C為18%，進行3次重復試驗，測得平均崩解時間為178 s，與模型預測的結(jié)果接近，表明基于該響應面模型分析優(yōu)化崩解時間的方法有效可行。

2.5 水分散體粒劑粒徑與崩解時間的關(guān)系

表11為不同粒徑的水分散體粒劑對崩解時間的影響。結(jié)果表明，水分散體粒徑為0.8 mm時，崩解時間<180 s；粒徑大于0.8 mm時，崩解時間>180 s，原因是較大的粒徑與水接觸的相對表面積較小。因此本文最終選擇粒徑為0.8 mm的顆粒。

表11 不同粒徑的水分散粒劑對崩解時間的影響

綜上，綠僵菌與小檗堿復配為水分散粒劑的最佳配方為：25%綠僵菌孢子粉、3%小檗堿、3%潤濕劑NP- 10、2.1%分散劑MF、5.3%分散劑木質(zhì)素磺酸鈣、18%的崩解劑海藻酸鈉、1.7%的黏結(jié)劑羧甲基纖維素鈉，用載體硅藻土補足100%。按照1.3.5的方法，將各種組分按比例混合均勻，噴入黏結(jié)劑，放入造粒機中造粒，選擇粒徑0.8 mm的顆粒，于35 ℃干燥后過40目篩，得到綠僵菌與小檗堿復配的水分散粒劑。經(jīng)測定，所制備的水分散粒劑的平均崩解時間為174 s，孢子萌發(fā)率為85.4%，孢子懸浮率為86.34%，含水量為1.88%，雜菌率2.01%，符合相關(guān)行業(yè)標準。

3 結(jié)論

(1)本文將綠僵菌與小檗堿復配，測定了小檗堿對綠僵菌的EC50為47.2 mg/mL，表明小檗堿對綠僵菌沒有明顯的抑制作用，二者可以復配；根據(jù)以往綠僵菌的田間試驗及小檗堿的抗真菌實驗，確定小檗堿的添加量為3%；通過處方篩選試驗，最終確定水分散粒劑的配方為：25%綠僵菌孢子粉，3%小檗堿，3%NP- 10(潤濕劑)，2.1%MF(分散劑)，5.3%木質(zhì)素磺酸鈣(分散劑)，18%海藻酸鈉(崩解劑)，1.7%羧甲基纖維素鈉(黏結(jié)劑)，硅藻土(載體)補足100%。

(2)按照確定的配方加入綠僵菌孢子粉和小檗堿的母粉、潤濕劑、分散劑、崩解劑及載體，混勻后噴入黏結(jié)劑水溶液，使含水量保持在30%。加入造粒機中造粒，選擇粒徑0.8 mm的顆粒，于35 ℃低溫干燥以盡量保證孢子活力，以水分≤5%為干燥終點，過40目篩，得到綠僵菌與小檗堿復配的水分散粒劑。經(jīng)質(zhì)量檢測，所制備的水分散粒劑的平均崩解時間為174 s，孢子萌發(fā)率為85.4%，孢子懸浮率為86.34%，含水量為1.88%，雜菌率為2.01%，符合相關(guān)行業(yè)標準。