斑馬魚心臟再生模型及研究進(jìn)展

張維嘉，梁金秀，韓佩東

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)研究所，杭州 310058）

人類心臟由兩心房和兩心室構(gòu)成，經(jīng)過(guò)體循環(huán)和肺循環(huán)，為人體提供氧氣以及供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，心血管疾病已經(jīng)成為人類健康的“頭號(hào)殺手”，其發(fā)病率和死亡率都顯著高于其他疾病。其中心力衰竭是一種進(jìn)行性的心血管疾病，其外顯率隨年齡增大呈顯著上升的趨勢(shì)。在心力衰竭進(jìn)程中，心肌細(xì)胞死亡導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能下降，并誘發(fā)損傷區(qū)域纖維化。成年哺乳類動(dòng)物心肌細(xì)胞都具有一定的分裂增殖能力，但是心肌細(xì)胞發(fā)生分裂增殖的頻率很低[1]，不足以補(bǔ)償心臟損傷導(dǎo)致的細(xì)胞損失。目前，治療心血管疾病的主要策略是延緩病情進(jìn)展，臨床上缺乏對(duì)受損心肌進(jìn)行修復(fù)和再生的方法。而對(duì)于終末期心力衰竭患者而言，心臟移植是唯一有效的治療方法。但是心臟器官的供應(yīng)有限，無(wú)法滿足臨床面臨的大量需求。因此，胚胎干細(xì)胞[2]或者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞[3]治療心臟疾病的療法得到了廣泛的關(guān)注。這些細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，當(dāng)注射到心臟的損傷區(qū)域后，可以原位分化為心肌細(xì)胞，或通過(guò)旁分泌的機(jī)制誘導(dǎo)局部血管新生，以此來(lái)顯著改善損傷區(qū)域的心臟功能。但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞移植后，其分化產(chǎn)生的心肌細(xì)胞和內(nèi)源性心肌細(xì)胞功能在耦聯(lián)上存在一定的障礙，容易誘導(dǎo)心律失常的發(fā)生[2]。因此，探索內(nèi)源性心肌細(xì)胞的再生機(jī)制對(duì)治療人類心血管疾病具有重要意義。

斑馬魚心臟具有單心房、單心室的結(jié)構(gòu)，且其發(fā)育過(guò)程與哺乳類動(dòng)物具有高度的相似性。與哺乳動(dòng)物不同的是，成年斑馬魚心臟具有損傷后再生的能力，在損傷誘導(dǎo)的不同信號(hào)通路作用下，已有的心肌細(xì)胞可以發(fā)生去分化和再分化以再生心肌組織[4?5]，替代損傷區(qū)域纖維化瘢痕；損傷區(qū)域的冠狀血管也重構(gòu)以提供血液循環(huán)，心臟的整體結(jié)構(gòu)和功能在損傷后30～60 d 可完全恢復(fù)。對(duì)斑馬魚心臟再生研究的意義在于：探尋心臟在損傷時(shí)對(duì)損傷信號(hào)的感知途徑，研究損傷后心肌細(xì)胞增殖所需的反應(yīng)機(jī)制，摸索完全再生的心臟即時(shí)接收終止再生信號(hào)的相關(guān)過(guò)程，并基于以上生物學(xué)機(jī)制為人類心臟疾病的治療提供新的思路和干預(yù)策略。首先，在斑馬魚正常心臟上構(gòu)建相關(guān)研究的損傷模型，如心尖切除損傷模型、冰凍損傷模型、心肌細(xì)胞遺傳消融模型和缺氧/復(fù)氧模型等，以深入研究斑馬魚心臟再生過(guò)程中的具體機(jī)制。同時(shí)，斑馬魚心臟具有多種類型的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、心外膜細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等。不同種類細(xì)胞在損傷后的激活過(guò)程中具有獨(dú)特的時(shí)空特征，其協(xié)調(diào)作用促進(jìn)了心臟再生的進(jìn)程。因此，本文將詳述近年來(lái)斑馬魚心臟再生、心臟損傷模型構(gòu)建以及不同細(xì)胞類型對(duì)再生過(guò)程調(diào)控作用的研究進(jìn)展，以便探究人類心臟疾病的發(fā)生過(guò)程，進(jìn)一步提供新的治療策略，最終幫助人們擺脫心臟疾病的困擾。

1 心臟再生現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和斑馬魚用于心臟再生研究的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

脊椎動(dòng)物斑馬魚作為器官再生研究的模式生物，其肝臟[6]、視網(wǎng)膜[7]、鰭[8]等器官都被證實(shí)存在再生的能力。2002 年，POSS 等[9]首次發(fā)現(xiàn)：斑馬魚心臟內(nèi)切除20%的心室在2個(gè)月內(nèi)完全再生；同時(shí)，標(biāo)記有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白的單極紡錘體1基因（mps1）在損傷區(qū)域表達(dá)上調(diào)，證實(shí)在斑馬魚再生過(guò)程中出現(xiàn)了有絲分裂現(xiàn)象。

斑馬魚作為心臟再生研究模型的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠獲得大量的轉(zhuǎn)基因或基因缺失品系，這對(duì)于確定在再生進(jìn)程中特定基因的功能至關(guān)重要。在過(guò)去20 年里，研究人員發(fā)現(xiàn)了潛在的調(diào)控斑馬魚心臟再生的關(guān)鍵分子和細(xì)胞的事件主要包括：1）心外膜的激活。斑馬魚心臟損傷后1～2 d 心外膜細(xì)胞開始被激活，表現(xiàn)為視黃酸合成酶（retinoic acid synthesizing enzyme 2, RALDH2）[10?11]、心外膜發(fā)育編碼T?box 轉(zhuǎn)錄因子18（T?box transcription factor 18, tbx18）[12]、Wilms 腫 瘤 蛋 白（Wilms’ tumor 1,WT1）[13]和纖維連接蛋白1（fibronectin 1, Fn1）[14]等心外膜標(biāo)志物基因表達(dá)量上調(diào)；心外膜細(xì)胞在心尖切除損傷后7 d 在損傷區(qū)域聚集[10?11]。2）表觀遺傳程序的變化。染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物核心催化亞基基因（Brahma-related gene 1,Brg1）是腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）依賴的染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF 的一個(gè)組成部分，在損傷誘導(dǎo)后在損傷區(qū)域表達(dá)量上調(diào)[15]。Brg1通過(guò)與DNA 甲基化相關(guān)基因（DNA methyltransferases related 3ab,Dnmt3ab）的相互作用，提高了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因cdkn1c啟動(dòng)子上CpG 位點(diǎn)的甲基化水平，以抑制cdkn1c的表達(dá)。故Brg1通過(guò)依賴Dnmt3ab的DNA甲基化抑制cdkn1c的表達(dá)，以促進(jìn)心臟再生。3）心臟發(fā)育必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的再激活。通過(guò)構(gòu)建Tg（gata4∶EGFP）[4]、Tg（hand2∶EGFP）[16]轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，發(fā)現(xiàn)心臟損傷后gata4和hand2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）在心肌細(xì)胞中表達(dá)，提示了心臟發(fā)育必需的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如gata4[4]和hand2[10,16]被重新激活。4）心肌細(xì)胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)的解體。再生的心肌細(xì)胞失去了一些分化細(xì)胞的特征，包括肌節(jié)結(jié)構(gòu)的解聚，以及部分肌節(jié)蛋白表達(dá)量下調(diào)和肌球蛋白的重新表達(dá)[5]。

2 斑馬魚心臟損傷模型的構(gòu)建

通過(guò)構(gòu)建不同的斑馬魚心臟損傷模型，可以模擬人類心肌梗死等疾病中的心臟損傷。與哺乳動(dòng)物類似，斑馬魚心臟損傷反應(yīng)的最初階段包括血凝塊形成、成纖維細(xì)胞的積累和膠原沉積。目前常用的斑馬魚心臟再生研究模型主要有心尖切除模型、冰凍損傷模型、心肌細(xì)胞遺傳消融模型和缺氧/復(fù)氧模型。

2.1 心尖切除模型

POSS等[9]將心室尖端組織切除20%后，觀察到損傷后的組織經(jīng)過(guò)60 d 的恢復(fù)，從形態(tài)上完全再生，再生區(qū)域的功能也得以恢復(fù)。心尖切除模型制作的步驟如下：首先將斑馬魚麻醉后，腹部朝上放在用海綿凹槽制作的“手術(shù)臺(tái)”上；然后用鑷子撥開胸腔，露出心室（圖1A）；接著使用顯微手術(shù)剪，切除斑馬魚心室尖端的組織；最后立刻將斑馬魚放回?zé)o麻醉劑的養(yǎng)殖水中，同時(shí)使用巴氏管反復(fù)吹吸將其喚醒。心尖切除后損傷區(qū)域的變化過(guò)程如下：損傷后1 min 內(nèi)，損傷區(qū)域立即形成血凝塊；損傷后2～4 d，血凝塊逐漸被纖維組織替代；損傷后7～9 d，血凝塊完全被纖維組織替代；損傷后14 d，纖維蛋白減少，心肌開始重建；損傷后30 d，在損傷區(qū)域形成連續(xù)的由心肌細(xì)胞組成的心肌壁；損傷后60 d，心肌細(xì)胞完全取代纖維組織，形成一層新的致密心肌層，再生的心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)功能完全恢復(fù)正常[4]。不同于人類心肌梗死，斑馬魚心尖被切除后，在損傷區(qū)域并沒有形成永久性的瘢痕，而是先形成大量的血塊再形成纖維組織，最終由新生的心肌細(xì)胞代替纖維組織，完成再生過(guò)程（圖1B）。

2.2 冰凍損傷模型

在人類心肌梗死發(fā)生過(guò)程中，冠狀血管堵塞造成心肌細(xì)胞死亡，而后成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為纖維化瘢痕組織。而上述的心尖切除模型是依靠物理剪切移除掉部分心室組織以達(dá)到心臟損傷的目的，與人類心肌梗死造成的損傷仍具有一定的差異。且由于斑馬魚心臟較小，直徑1 mm 左右[17]，難以在解剖鏡下識(shí)別冠狀血管。為了更好地模擬人類心臟冠狀動(dòng)脈堵塞造成的心肌損傷，有研究者構(gòu)建了冰凍損傷模型[12?13,18]。冰凍損傷模型制作的基本步驟如下：首先將斑馬魚麻醉，使其腹部朝上平躺在用海綿凹槽制作的“手術(shù)臺(tái)”上；然后使用鑷子打開胸腔，露出心室；接著使用液氮處理過(guò)的低溫銅絲快速接觸心室的尖端部位；最后立刻使用室溫水滴在銅絲與心室交聯(lián)處以終止損傷，并將斑馬魚立刻放進(jìn)無(wú)麻醉劑的養(yǎng)殖水中，同時(shí)使用巴氏管反復(fù)吹吸將其喚醒。

與心尖切除模型相比，冰凍損傷模型導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡和纖維化瘢痕形成，更加類似于哺乳動(dòng)物心肌梗死的現(xiàn)象。其具體表現(xiàn)為：冰凍損傷后1 d，損傷區(qū)域占心室面積的25%，血細(xì)胞在損傷區(qū)域堆積，在心臟外表面特別是在損傷區(qū)域邊緣發(fā)生大量的心外膜細(xì)胞增殖；損傷后3 d，心肌細(xì)胞的死亡量達(dá)到最大程度，纖維化瘢痕在損傷區(qū)域堆積以替代死亡的心肌細(xì)胞；損傷后7 d，出現(xiàn)明顯的膠原沉積；損傷后21 d，形成纖維組織，瘢痕位于更靠近心腔的位置，心肌細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)明顯再生，環(huán)繞著剩余的瘢痕；損傷后90 d，在心室心尖仍然出現(xiàn)殘余的瘢痕；直到損傷后130 d，瘢痕完全消失，在損傷區(qū)域新生成的心肌細(xì)胞層比未損傷心室更為厚實(shí)，且其收縮能力也完全恢復(fù)[12]（圖1C）。與心尖切除損傷相比，冰凍損傷后心臟再生需要的時(shí)間更長(zhǎng)，且在早期階段的損傷區(qū)域出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡[13]。其原因可能與冰凍損傷導(dǎo)致的血流中斷和局部缺氧有關(guān)。

2.3 心肌細(xì)胞遺傳消融模型

斑馬魚心臟心尖切除模型和冰凍損傷模型雖然都能夠用于研究心臟損傷修復(fù)的過(guò)程，但是其共同的缺點(diǎn)在于不能損傷特定的細(xì)胞類型，進(jìn)而區(qū)分該細(xì)胞類型參與心臟再生的機(jī)制。CURADO 等[19]通過(guò)結(jié)合化學(xué)和遺傳學(xué)工具，使用細(xì)菌硝基還原酶（nitroreductase, NTR）/甲硝唑（metronidazole, Mtz）系統(tǒng)［原理是依賴于NTR介導(dǎo)的無(wú)毒性的硝基咪唑底物（如Mtz）的轉(zhuǎn)化，引起細(xì)胞毒性以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而消融細(xì)胞］，構(gòu)建Tg（myl7∶CFP-NTR）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，其心肌細(xì)胞高效表達(dá)由青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）和NTR 組成的融合蛋白（CFP?NTR）[19]指示，使用藥物Mtz 處理后，表達(dá)CFP?NTR的心肌細(xì)胞快速死亡；終止藥物Mtz處理后的幾天內(nèi)，心臟的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和收縮功能可以完全恢復(fù)，血液循環(huán)也可以重建，心臟完成再生過(guò)程。運(yùn)用類似的技術(shù)手段，通過(guò)特異性地消融斑馬魚心室心肌細(xì)胞，揭示了心房心肌細(xì)胞在胚胎心臟再生過(guò)程中轉(zhuǎn)分化為心室心肌細(xì)胞的能力[20]。這些研究表明，NTR/Mtz系統(tǒng)可以在時(shí)間和空間上精準(zhǔn)操控斑馬魚細(xì)胞消融；組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控的NTR表達(dá)，能夠在特定的時(shí)間誘導(dǎo)心臟上不同細(xì)胞的死亡，從而提供了分析不同類型細(xì)胞相互作用和研究再生機(jī)制的有效遺傳學(xué)工具（圖1D～E）。

圖1 斑馬魚心臟損傷模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of zebrafish heart injury models

2.4 缺氧/復(fù)氧模型

缺氧/復(fù)氧模型[21]可以在一定程度上模擬哺乳動(dòng)物冠狀動(dòng)脈堵塞后發(fā)生的心肌梗死。缺氧/復(fù)氧模型制作過(guò)程[21]如下：提前準(zhǔn)備一個(gè)5 L 的玻璃水槽，分別用溶解氧和pH探針監(jiān)測(cè)水溶氧濃度和pH。首先構(gòu)建缺氧的環(huán)境，即接入95%氬氣和5%二氧化碳的混合氣體，從而降低槽內(nèi)的氧氣濃度，使水溶氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)從80%逐漸降低到5%，同時(shí)在水中加入碳酸氫鈉，以保持pH 為7.50，避免缺氧引起酸化；接著將成年斑馬魚移入上述低氧環(huán)境中進(jìn)行低氧處理15 min；隨后將斑馬魚轉(zhuǎn)移到常氧水中，每條成年斑馬魚放入1 L 水箱中，進(jìn)行復(fù)氧處理。每個(gè)水箱中放入1條成年斑馬魚。

缺氧/復(fù)氧處理后2 h，斑馬魚心臟的氧化應(yīng)激作用達(dá)到高峰；4 h 后，心臟出現(xiàn)零星的炎性細(xì)胞；6 h 后，心臟中的炎性細(xì)胞數(shù)目達(dá)到峰值，同時(shí)心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；24 h后，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖減少并恢復(fù)到正常水平，心肌細(xì)胞的凋亡和壞死明顯增加，心肌細(xì)胞開始增殖；3 d后，心肌細(xì)胞的增殖達(dá)到峰值；30 d 后，心肌細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常，心室功能也完全恢復(fù)。然而，由于斑馬魚整體暴露在低氧環(huán)境中，這種模型導(dǎo)致的損傷并不局限于心臟。目前仍有待開發(fā)出使斑馬魚心臟局部性缺氧的方法，以更好地模擬人類心肌梗死。

3 斑馬魚心臟不同細(xì)胞類型參與心臟再生的機(jī)制

成年斑馬魚心臟由多種細(xì)胞類型組成，包括心肌細(xì)胞、心外膜細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞等，其通過(guò)不同的信號(hào)通路和細(xì)胞間的互作建立信息交流，以維持心臟正常的生理功能。斑馬魚心臟損傷后，心外膜和心內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移，并參與損傷區(qū)域血管系統(tǒng)的重建；心肌細(xì)胞也發(fā)生增殖以恢復(fù)心臟正常的收縮?舒張功能。這些細(xì)胞類型參與心臟再生的具體機(jī)制如下。

3.1 心肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞起源于側(cè)板中胚層，具有收縮和舒張功能，通過(guò)維持血液循環(huán)以向體內(nèi)器官和組織運(yùn)輸氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2010 年的2 項(xiàng)研究[4?5]通過(guò)運(yùn)用Cre/Loxp 系統(tǒng)介導(dǎo)的心肌細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)，證實(shí)了再生的心肌細(xì)胞來(lái)源于已有心肌細(xì)胞的去分化。KIKUCHI等[4]發(fā)現(xiàn)：在未損傷的成年斑馬魚心臟中，心臟發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子gata4的內(nèi)源性表達(dá)量極低；但在心室損傷后7 d，gata4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP在再生的心肌細(xì)胞中表達(dá)，表明再生的心肌細(xì)胞經(jīng)歷了去分化的進(jìn)程。同時(shí)，JOPLING 等[5]通過(guò)構(gòu)建Tg（myl7∶Cre-Ert2）和Tg（myl7∶LnL-GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，并經(jīng)過(guò)他莫昔芬藥物處理，將心肌細(xì)胞標(biāo)記為綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）陽(yáng)性；隨后對(duì)成年斑馬魚進(jìn)行心尖切除手術(shù)，發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)域再生的心肌細(xì)胞也呈現(xiàn)GFP陽(yáng)性，且再生區(qū)域發(fā)生心肌細(xì)胞肌節(jié)重組以及細(xì)胞周期相關(guān)因子plk1基因表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明再生的心肌細(xì)胞來(lái)源于已有的心肌細(xì)胞分裂增殖。

參與心肌細(xì)胞再生相關(guān)信號(hào)的通路有：1）神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1, Nrg1）信號(hào)通路。現(xiàn)有的研究證實(shí)，酪氨酸激酶配體Nrg1/酪氨酸激酶受體（erb?b2 receptor tyrosine kinase 2, Erbb2）信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖和損傷修復(fù)。其中Nrg1在損傷后的斑馬魚心臟冠狀血管周圍表達(dá)和分泌，并結(jié)合心肌細(xì)胞上的Erbb2，在心臟再生過(guò)程中起到重要作用[22]；使用藥物抑制Erbb2基因的功能會(huì)降低心肌細(xì)胞增殖；而過(guò)表達(dá)Nrg1基因則增強(qiáng)了損傷后心肌細(xì)胞的增殖能力[22]。2）核因子κB（nuclear factor?κB, NF?κB）信號(hào)通路。NF?κB 信號(hào)通路是多種組織中早期損傷反應(yīng)的重要組成部分[23]，損傷后的心肌細(xì)胞發(fā)生了NF?κB 信號(hào)的激活[24]。通過(guò)構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性抑制NF?κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，發(fā)現(xiàn)阻斷NF?κB 信號(hào)通路則抑制了gata4基因調(diào)控序列的激活，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖減少和心臟再生障礙[23]。3）低氧誘導(dǎo)因子?1（hypoxia inducible factor?1, HIF?1）信號(hào)通路。在心臟損傷后，缺氧導(dǎo)致HIF?1a表達(dá)量上調(diào)并與HIF?1β形成二聚體來(lái)激活下游序列[25]，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，保護(hù)缺血環(huán)境中的心肌細(xì)胞；通過(guò)對(duì)心尖切除的斑馬魚進(jìn)行缺氧處理，發(fā)現(xiàn)HIF?1a可調(diào)節(jié)心臟再生[26]；對(duì)斑馬魚進(jìn)行缺氧/復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)HIF?1依賴基因[21]如hmox1、epo和Vegfaa被激活，以保護(hù)損傷后的心肌細(xì)胞。4）P53 信號(hào)通路。腫瘤抑制因子P53的信號(hào)通路在心臟再生和氧化應(yīng)激的反應(yīng)中起到重要作用[27]。在斑馬魚心臟再生過(guò)程中，質(zhì)譜分析表明P53 信號(hào)受到抑制[28]。而在損傷后心外膜細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（H2O2）刺激下，p53異構(gòu)體Δ133p53的表達(dá)量上調(diào)，并通過(guò)增強(qiáng)抗氧化基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活[29]。Δ113p53在斑馬魚心臟再生區(qū)域的心肌細(xì)胞中表達(dá)。譜系示蹤結(jié)果顯示，Δ113p53陽(yáng)性的心肌細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞增殖并促進(jìn)心肌再生，缺失Δ113p53的斑馬魚心臟再生受損。因此，在損傷部位的心肌細(xì)胞中p53亞型Δ113p53通過(guò)增加抗氧化基因的表達(dá)來(lái)維持氧化還原平衡，從而促進(jìn)心臟再生。

3.2 心外膜細(xì)胞

在發(fā)育過(guò)程中，心外膜前體細(xì)胞附著并最終覆蓋胚胎心肌細(xì)胞的表面，形成一層心外膜[30]，通過(guò)分泌營(yíng)養(yǎng)因子刺激心肌細(xì)胞增殖[31]。心外膜細(xì)胞經(jīng)過(guò)上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）形成心外膜來(lái)源細(xì)胞（epicardial derived cells,EPDCs），并在胸腺素β4（thymosinβ4, Tβ4）[32]誘導(dǎo)下，最終形成成纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞[31]。

通過(guò)不同心外膜細(xì)胞標(biāo)志物的應(yīng)用，相關(guān)研究闡釋了該細(xì)胞類型在心臟再生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程及功能：1）心外膜標(biāo)志物基因raldh2在正常生理狀態(tài)下的成年斑馬魚心外膜細(xì)胞中表達(dá)量極低[10]，然而心尖切除損傷后1～2 d，raldh2在心臟流出道、心房和心室中表達(dá)量顯著上調(diào)，且心外膜細(xì)胞開始被激活進(jìn)入增殖和遷移進(jìn)程；損傷2周以后，raldh2表達(dá)逐漸局限于損傷區(qū)域，且增殖的心外膜細(xì)胞主要聚集在損傷區(qū)域。2）運(yùn)用標(biāo)記心外膜細(xì)胞基因的Tg（wt1b∶GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，發(fā)現(xiàn)冰凍損傷后的斑馬魚心臟中，GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高[13]，提示損傷誘導(dǎo)了心外膜細(xì)胞增殖。3）通過(guò)運(yùn)用NTR/Mtz系統(tǒng)在Tg（tcf21∶NTR）轉(zhuǎn)基因斑馬魚中遺傳消融心外膜細(xì)胞，然后進(jìn)行心臟損傷操作，結(jié)果證實(shí)心肌細(xì)胞增殖和心臟再生受到抑制[33]，提示了心外膜細(xì)胞在心臟再生過(guò)程中的重要作用。

損傷后的心外膜細(xì)胞參與再生的相關(guān)信號(hào)通路有：1）成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor, FGF）信號(hào)通路。FGF 信號(hào)通路中的配體基因fgf17b在損傷后再生的心肌細(xì)胞中表達(dá)[10]；而FGF信號(hào)受體基因fgfr2、fgfr4在損傷后增殖的心外膜細(xì)胞中表達(dá)[10]，提示FGF 信號(hào)通路介導(dǎo)了再生過(guò)程中心肌細(xì)胞和心外膜細(xì)胞的互作。進(jìn)一步的研究通過(guò)構(gòu)建Tg（hsp70∶dn-fgfr1）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系[10]，熱激后激活顯性?負(fù)性的fgfr1的表達(dá)，從而抑制FGF 信號(hào)通路的活性，導(dǎo)致再生進(jìn)程受到抑制，且再生的區(qū)域仍存在膠原和纖維瘢痕組織；且在損傷區(qū)域缺少Tg（fli1∶EGFP）轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的冠狀動(dòng)脈血管新生。上述研究結(jié)果證實(shí)FGF 信號(hào)與心外膜細(xì)胞增殖、冠狀血管生成以及心肌細(xì)胞的再生密切相關(guān)。2）血小板衍化生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor,PDGF）信號(hào)通路。壁細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞與心外膜細(xì)胞EMT進(jìn)程相關(guān)，壁細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記基因pdgfr在損傷區(qū)域的心外膜細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)[34]；通過(guò)藥物處理抑制PDGF 信號(hào)通路則造成體外培養(yǎng)的心外膜細(xì)胞增殖受到限制和pdgfrβ表達(dá)量下調(diào)[34]，進(jìn)一步影響心外膜細(xì)胞EMT 進(jìn)程，使冠狀動(dòng)脈形成受阻。因此，PDGF 信號(hào)通路對(duì)損傷后心外膜細(xì)胞增殖及其經(jīng)過(guò)EMT 轉(zhuǎn)化為冠狀動(dòng)脈的過(guò)程有重要作用。3）Hh 信號(hào)通路。運(yùn)用基于熒光泛素化的細(xì)胞周期指示劑（fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator, FUCCI）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系[35]，發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路影響了心肌細(xì)胞增殖。在斑馬魚心臟切除損傷后7 d，Hh 信號(hào)通路中配體基因shha在損傷區(qū)域的心外膜細(xì)胞中被激活[35]，而Hh 信號(hào)通路的靶基因ptch2在再生區(qū)域內(nèi)的心肌細(xì)胞中表達(dá)[35]，說(shuō)明Hh信號(hào)通路在再生過(guò)程中介導(dǎo)了心外膜細(xì)胞與心肌細(xì)胞的互作。通過(guò)運(yùn)用Cre/Loxp 系統(tǒng)條件性敲除損傷心臟心外膜細(xì)胞中shha的表達(dá)[36]，進(jìn)一步證實(shí)了Hh信號(hào)通路具有在再生過(guò)程中促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)心外膜細(xì)胞再生的功能[33]。

3.3 心內(nèi)膜細(xì)胞

心內(nèi)膜是一層特化內(nèi)皮細(xì)胞，覆蓋在心臟的管腔表面，為血液循環(huán)提供生理屏障。在未受損傷的心臟中，心內(nèi)膜細(xì)胞呈現(xiàn)扁平狀，緊密地附著在相鄰的心肌上；在損傷后1～3 h，心內(nèi)膜會(huì)經(jīng)歷快速的形態(tài)變化[11]；在損傷后3～5 d內(nèi)，損傷區(qū)域周圍的心內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生顯著增殖[37]。

心內(nèi)膜損傷后激活的主要信號(hào)通路有：1）視黃酸（retinoic acid, RA）信號(hào)通路。心臟損傷誘導(dǎo)raldh2在損傷部位的心內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)[11]。當(dāng)過(guò)表達(dá)顯性?負(fù)性類視黃酸受體基因RAR-α或RA 信號(hào)降解酶基因Cyp26，從而在斑馬魚中抑制RA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，心肌細(xì)胞增殖會(huì)受到抑制。在發(fā)育過(guò)程中，RA信號(hào)通路是通過(guò)肝促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）信號(hào)發(fā)揮作用，該信號(hào)激活I(lǐng)GF2 因子的表達(dá)[38]，進(jìn)而通過(guò)心臟IGF 信號(hào)受體激活心肌細(xì)胞的增殖。但在心臟再生過(guò)程中，RA 信號(hào)調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制仍有待研究。2）Notch 信號(hào)通路。在不同的斑馬魚心臟損傷模型中，研究者都觀察到了Notch 信號(hào)通路的激活。心尖切除損傷后，Notch信號(hào)受體基因notch1a、notch1b和notch2在心內(nèi)膜中的表達(dá)水平顯著升高[39]；而冰凍損傷則誘導(dǎo)了心內(nèi)膜細(xì)胞中Notch 信號(hào)受體基因notch1b、notch2和notch3的表達(dá)[37]；在遺傳消融系統(tǒng)介導(dǎo)的胚胎心室損傷中，由于notch1b表達(dá)量上調(diào)，心房?jī)?nèi)膜細(xì)胞介導(dǎo)Notch 信號(hào)通路的活性增強(qiáng)[20,40]。運(yùn)用小分子抑制劑或基因操作手段[15,29?30]抑制Notch信號(hào)通路活性，會(huì)降低心肌細(xì)胞增殖，從而阻斷心臟再生。3）JAK1/STAT3 信號(hào)通路。激活的心內(nèi)膜細(xì)胞和炎癥細(xì)胞都會(huì)釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素11a（interleukin 11a, Il11a）和 白 細(xì) 胞 介 素 11b（interleukin 11b, Il11b），這些分泌因子激活了心肌細(xì)胞中的JAK1/STAT3 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致刺激心肌細(xì)胞增殖的分泌因子relaxin3a表達(dá)量上調(diào)[41]。心肌細(xì)胞特異性stat3顯性失活會(huì)顯著減少心肌細(xì)胞的增殖并阻礙再生。

3.4 成纖維細(xì)胞

纖維組織在斑馬魚心臟損傷后的持續(xù)時(shí)間是短暫的，最終會(huì)被心肌細(xì)胞替代以完成再生。在修復(fù)過(guò)程中，纖維組織形成和降解的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)心臟再生起到重要作用。纖維組織由大量的成纖維細(xì)胞組成，通過(guò)分泌產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)以維持成年心臟正常結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)對(duì)標(biāo)記成纖維細(xì)胞的骨膜蛋白[42]和膠原蛋白[43]的轉(zhuǎn)錄組分析，證實(shí)了損傷區(qū)域成纖維細(xì)胞的存在；經(jīng)特異性消融成纖維細(xì)胞后，心肌細(xì)胞的再生過(guò)程受到抑制，故成纖維細(xì)胞對(duì)斑馬魚心臟損傷后修復(fù)過(guò)程有重要調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ, TGFβ）信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞參與心臟再生過(guò)程有重要聯(lián)系。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)在心臟損傷區(qū)域富集[43]，并激活TGFβ信號(hào)通路。在斑馬魚心臟再生過(guò)程中，TGFβ的Ⅰ型受體基因tgfbr1b在損傷區(qū)域的纖維化組織和再生心肌細(xì)胞中表達(dá)，TGFβ配體在損傷區(qū)域和周圍的心肌細(xì)胞中表達(dá)；另可以通過(guò)藥物處理TGFβ信號(hào)通路的Ⅰ型受體抑制磷酸化的Smad3[44]，進(jìn)而抑制TGFβ信號(hào)活性，最終使斑馬魚心臟再生過(guò)程受到抑制。因此，TGFβ信號(hào)通路通過(guò)依賴Smad3 的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)在心臟損傷后促纖維化與促再生的平衡[44]。

3.5 免疫細(xì)胞

心臟損傷后，免疫反應(yīng)參與了從組織修復(fù)階段到再生階段的轉(zhuǎn)變[45]。心臟再生的早期階段類似于傷口愈合反應(yīng)[46]，該階段斑馬魚心臟中心肌細(xì)胞的大量死亡引起炎癥反應(yīng)[12,31,47]，并招募巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。在免疫細(xì)胞招募過(guò)程中，過(guò)氧化氫通過(guò)降解Dusp6[48]從而解除對(duì)MAPK的抑制作用[49]，在斑馬魚心肌再生中發(fā)揮著重要功能。而免疫細(xì)胞在斑馬魚心臟損傷后修復(fù)過(guò)程中的主要功能如下：1）巨噬細(xì)胞。在斑馬魚心臟發(fā)育過(guò)程中，巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育[50]以及冠狀動(dòng)脈血管形成[51]。而在瘢痕組織形成和心臟再生過(guò)程中，巨噬細(xì)胞也發(fā)揮了不可或缺的功能。原位雜交結(jié)果顯示，心臟損傷后1 d 巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpeg1在損傷區(qū)域表達(dá)，證明在損傷早期階段出現(xiàn)了巨噬細(xì)胞招募[52]；經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞通過(guò)合成膠原以形成短暫的瘢痕組織而影響下游的傷口愈合過(guò)程[52]。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫系統(tǒng)能夠促進(jìn)ECM 重塑和血管生成，進(jìn)而促進(jìn)心臟再生[53]；而減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[47]，導(dǎo)致心臟再生進(jìn)程受到抑制。2）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這類細(xì)胞可維持對(duì)自身抗原的耐受性，并限制組織損傷引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)[54]。通過(guò)遺傳消融調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，會(huì)抑制斑馬魚的心臟再生進(jìn)程[55]，并伴有纖維蛋白的沉積和膠原瘢痕的形成[56]。

4 小結(jié)與展望

心臟病具有高發(fā)病率和高致死率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類生命。近年來(lái)的研究表明，脊椎動(dòng)物斑馬魚心臟具有良好的再生功能，基于該模型的再生醫(yī)學(xué)研究將為修復(fù)受損心臟提供一種新的策略。本文闡述了多種斑馬魚心臟損傷模型，包括心尖切除損傷、冰凍損傷、心肌細(xì)胞遺傳消融以及缺氧/復(fù)氧模型，進(jìn)而分析斑馬魚心臟損傷后出現(xiàn)的生物學(xué)進(jìn)程：在損傷早期階段快速形成血凝塊，心肌細(xì)胞的大量死亡引起炎癥反應(yīng)，機(jī)體開始招募免疫細(xì)胞限制進(jìn)一步炎癥反應(yīng)，而后由成纖維細(xì)胞形成纖維組織，同時(shí)發(fā)生心內(nèi)膜細(xì)胞和心外膜細(xì)胞的增殖遷移、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的增殖以及冠狀血管的新生，損傷后期在其他類型細(xì)胞的分泌因子和多種信號(hào)通路的誘導(dǎo)下，纖維組織隨著心肌組織的增殖逐漸被替代，最終斑馬魚心臟重塑形成一層致密的新的心肌細(xì)胞層，恢復(fù)收縮和舒張的功能。總之，斑馬魚心臟損傷模型的構(gòu)建，為心臟再生過(guò)程中的分子和細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制研究提供了新的手段。近年來(lái)不斷發(fā)展的熒光標(biāo)記技術(shù)和高分辨率光學(xué)成像技術(shù)，將有助于我們進(jìn)一步解析心臟多種細(xì)胞類型在此過(guò)程中互作的具體機(jī)制，有望為人類心臟疾病的治療提供新的思路和策略。