SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的制備及樣本混檢性能分析

釗倩倩，劉雙雙，周云英，史桂芝，汪運(yùn)山*

(1.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中心，山東 濟(jì)南 250013；2.山東英盛生物技術(shù)有限公司 研發(fā)中心，山東 濟(jì)南 250100)

新型冠狀病毒(novel corona virus, severe acute respiratory syndrom corona virus 2,SARS-CoV-2)，屬于冠狀病毒科β屬[1]，跨物種傳播引起2019冠狀病毒疾病(corona virus disease 2019, COVID-19)[2-3]，對全球的公共衛(wèi)生安全造成極大威脅。病毒核酸陽性被作為SARS-CoV-2感染的確診依據(jù)之一[4]，而熒光RT-qPCR依其成本低、操作流程簡單、易批量化等優(yōu)點(diǎn)成為核酸檢測的主流技術(shù)[5]。目前為了應(yīng)對大規(guī)模人群SARS-CoV-2核酸篩查，提高檢測效率，國務(wù)院及國家衛(wèi)生健康委員會分別頒布了關(guān)于多樣本混合檢測的工作手冊及技術(shù)規(guī)范，分單采混檢和混采單檢兩種方式。由于混檢會降低病毒濃度，對試劑靈敏度要求更高。市售核酸檢測試劑盒性能良莠不齊，一直存在“假陰性”質(zhì)疑，對混檢樣本的檢測效果未見報(bào)道。本研究擬優(yōu)化熒光RT-qPCR體系中不同靶基因擴(kuò)增效率，開發(fā)適用于大規(guī)模人群篩查的核酸檢測試劑盒，并考察臨床多樣本混合檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物和探針：ORF1ab和N靶基因擴(kuò)增引物及探針序列源自中國疾病預(yù)防控制中心(Chinese Center For Disease Control And Prevention, CCDC)，RNaseP(ribonuclease P)作為內(nèi)標(biāo)基因(表1)。引物配制成濃度為20 μmol/L的溶液，探針配制濃度為10 μmol/L的溶液。

表1 SARS-CoV-2 RT-qPCR引物及探針序列

1.1.2 臨床樣本：新型冠狀病毒樣本及常見呼吸道病毒樣本均為鼻咽拭子，來自濟(jì)南市中心醫(yī)院及當(dāng)?shù)丶部夭块T。其中陽性樣本為臨床確診病例并經(jīng)國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的試劑盒檢測為核酸陽性。樣本采集后放入3 mL病毒保存液中，并-70 ℃保存?zhèn)溆?。樣本的收集及使用均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2020-053-01)。

1.1.3 試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶及PCR反應(yīng)MIX(南京諾維贊生物科技有限公司)；RNA磁珠法提取試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)；參比試劑盒：Kit-B(上海伯杰醫(yī)療科技有限公司)、Kit-S(碩世生物科技股份有限公司)及Kit-Z(北京卓誠惠生生物科技股份有限公司)均為市售主流產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取與處理：磁珠法提取鼻咽拭子樣本的病毒RNA，提取步驟及樣本用量參照試劑盒說明書。RNA提取后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試劑盒引物及探針濃度優(yōu)化：單靶基因引物濃度優(yōu)化：采用單一變量原則分別優(yōu)化每一個(gè)靶基因引物濃度。25 μL的擴(kuò)增體系中，緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶及擴(kuò)增酶使用量按照說明書添加，加入5 μL含靶基因的重組質(zhì)粒(1 copy/μL)作為模板(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，加入200 nmol/L探針，分別加入240～800 nmol/L的等量正向及反向擴(kuò)增引物。

引物濃度配比優(yōu)化：按照3因素四水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)3個(gè)靶基因的引物濃度配比。分析每組擴(kuò)增曲線的Ct值。

探針濃度優(yōu)化：在25 μL反應(yīng)體系中，分別加入200、320及400 nmol/L 3種濃度的探針，觀察熒光PCR擴(kuò)增曲線和Ct值。

1.2.3 試劑盒擴(kuò)增參數(shù)：ABI7500熒光定量PCR儀按照如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：反轉(zhuǎn)錄：50 ℃ 15 min；預(yù)變性：95 ℃ 5 min；變性、退火、延伸：[95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s(檢測熒光)]×40循環(huán)。ORF1ab、N及RNaseP3個(gè)靶基因的檢測通道分別為FAM、VIC及ROX。

1.2.4 試劑盒性能分析：準(zhǔn)確性驗(yàn)證：提取107例新型冠狀病毒陰性標(biāo)本(其中男性55例，女性52例，年齡4～90歲，具有發(fā)熱癥狀者28例，僅咳嗽或其他呼吸道癥狀者79例)及12例SARS-CoV-2陽性標(biāo)本的病毒RNA,以獲得國藥監(jiān)局批準(zhǔn)的試劑盒作為參比試劑盒檢測SARS-CoV-2核酸，計(jì)算陽性、陰性及總符合率。

特異性驗(yàn)證：檢測10種常見的呼吸道病原體陽性且經(jīng)市售試劑盒檢測新型冠狀病毒核酸為陰性的鼻咽拭子樣本，分析檢測結(jié)果是否為陰性。

靈敏度分析：梯度稀釋已知濃度的陽性參考品，每個(gè)濃度重復(fù)測定20次，以O(shè)RF1ab和N同時(shí)檢出作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)各濃度樣本檢出的陽性個(gè)數(shù)。以95%陽性檢出率的濃度值作為試劑盒的檢出限，即靈敏度。

1.2.5 臨床多樣本混合檢測效果分析：陽性樣本與陰性樣本按1/5、1/10、1/20、1/40及1/80比例混合[陽/(陽+陰)]，磁珠法提取病毒RNA。以靈敏度與本試劑盒相同的3種市售試劑盒Kit-B、Kit-S及Kit-Z作為參比，檢測SARS-CoV-2核酸，每種濃度重復(fù)檢測3次。分析全部檢出陽性結(jié)果的最高混檢比例及擴(kuò)增Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 試劑盒的多靶標(biāo)引物濃度優(yōu)化結(jié)果

單一變量優(yōu)化得到每個(gè)靶基因的引物濃度范圍均為320～800 nmol/L。正交實(shí)驗(yàn)中，ORF1ab、N的Ct值隨引物濃度增加而降低，RNaseP的Ct值受引物濃度影響不明顯(圖1B)。3個(gè)靶基因的均值效應(yīng)極差值(Mean-value effect)趨勢為ORF1ab(delta=3.00)>N(delta=1.43)>RNaseP(delta=0.33)(圖1A)，提示ORF1ab引物濃度變化對擴(kuò)增結(jié)果影響最大。在保持3個(gè)靶基因擴(kuò)增效率相似的基礎(chǔ)上，以O(shè)RF1ab擴(kuò)增效率為主要因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得ORF1ab、N及RNaseP的引物濃度配比為640、800及400 nmol/L(圖1C)。

ORF1ab和N的熒光信號強(qiáng)度隨探針濃度的提高而增強(qiáng)(圖1D)，當(dāng)探針濃度≥320 nmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度不再有明顯的變化；而RNaseP的熒光信號強(qiáng)度變化不大。因此ORF1ab、N和RNaseP探針濃度分別為320、320及200 nmol/L。

A.mean-value effect of different target genes; B.amplification Ct value of RT-qPCR under different primers concentration; C.experiment groups of different primers concentration; D.amplification curve of RT-qPCR with different probes concentration; delta Rn*.changes in fluorescence from the previous cycle

2.2 試劑盒的準(zhǔn)確性及特異性驗(yàn)證結(jié)果

準(zhǔn)確性：本試劑盒(命名為Kit-Y)對12例陽性標(biāo)本檢測結(jié)果全部為陽性，對107例陰性標(biāo)本的檢測結(jié)果全部為陰性，陽性、陰性及總符合率均為100%(表2)。

表2 試劑盒Y準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

特異性：Kit-Y對甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、EB病毒、巨細(xì)胞病毒共10種病原菌的陽性標(biāo)本的檢測結(jié)果均為陰性(NoCt)，分析特異性為100%(表3)。

表3 試劑盒Y特異性驗(yàn)證結(jié)果

靈敏度：陽性定值參考品按梯度稀釋為1×105、1×104、1×103和1×102copies/mL，每個(gè)濃度重復(fù)測定20次的陽性檢出結(jié)果如表4。模板濃度為1×103copies/mL時(shí)，20個(gè)陽性樣本檢出19個(gè)，陽性檢出率為95%，符合靈敏度定義，因此Kit-Y檢測靈敏度為1×103copies/mL。

表4 試劑盒Y靈敏度分析結(jié)果

2.3 臨床多樣本混合檢測結(jié)果

多樣本混合檢測Kit-Y對ORF1ab的檢出限低于市售試劑盒(圖2)。當(dāng)混合比超過1/10時(shí)，3個(gè)參比試劑盒均無法檢測到ORF1ab，而Kit-Y對其檢出限可低至混合比例1/20(P<0.01)(圖2A)；Kit-Y對N基因的檢出限與Kit-B及Kit-S相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1/10)，但低于Kit-Z(P<0.01)；兩個(gè)靶基因的擴(kuò)增Ct值均隨模板濃度降低而增大，相同模板濃度時(shí)，Kit-Y對ORF1ab的擴(kuò)增Ct值低于3種參比試劑盒(P<0.05)(圖2B)，Kit-Y與Kit-S對N基擴(kuò)增Ct值在不混合樣本模板濃度下分別為31.74及35.5，差異顯著(P<0.05)，Kit-Y與其余兩個(gè)試劑盒的Ct值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.template dilution range of different target genes; B.amplification Ct values with same template concentration; *P<0.01，**P<0.05 compared with Kit-Y group

3 討論

以熒光RT-qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的新冠病毒核酸檢測試劑在臨床使用中多次出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，甚至是個(gè)別病例還出現(xiàn)在不同時(shí)間5次以上結(jié)果陰性后又轉(zhuǎn)陽的現(xiàn)象[6]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)具有多方面的原因：標(biāo)本的采集部位或手法不當(dāng)造成病毒采集量不足；標(biāo)本保存及運(yùn)輸過程不當(dāng)造成病毒降解等，而試劑的檢測性能尤其是靈敏度不足則是造成假陰性結(jié)果的主要實(shí)驗(yàn)室原因。在本文中，3個(gè)靶基因擴(kuò)增效率分析結(jié)果表明ORF1ab的擴(kuò)增效率受引物濃度影響最大。以熒光PT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸檢測中，ORF1ab是檢測結(jié)果判為陽性的必要條件，其檢測靈敏度的提高，對于降低檢測結(jié)果的假陰性具有重要意義。

由于多樣本混檢只進(jìn)行初步篩查，任意一個(gè)靶標(biāo)檢測出陽性就需要對本組樣本單個(gè)復(fù)檢，因此單靶標(biāo)的高靈敏度在樣本混合檢測過程中會更具有優(yōu)勢。用9～10個(gè)樣本一組混檢的方式對292組混合樣本，通過單靶標(biāo)(E)的篩查出的兩組陽性樣本，均得到了雙靶標(biāo)(E/ORF1ab)的復(fù)檢及測序驗(yàn)證[7]。Kit-Y及Kit-Z均具有一個(gè)高靈敏靶標(biāo)，在樣本混合檢測過程中會更具有優(yōu)勢。

有效的多樣本混合檢測試劑盒的開發(fā)及應(yīng)用對大規(guī)模人群篩查具有重要意義。目前大多數(shù)試劑盒中的引物及探針序列都來源于中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)或世界衛(wèi)生組織(WHO)的公布數(shù)據(jù)[8-9]，本文研究發(fā)現(xiàn)使用相同引物來源的檢測試劑仍有不同的檢測性能，比如在選擇10個(gè)樣本進(jìn)行混合檢測時(shí)，不同品牌的檢測試劑出現(xiàn)不同的檢測結(jié)果。差異原因可能是由于不同品牌試劑盒在緩沖體系成分、引物濃度、酶濃度及擴(kuò)增條件等方面均存在差異而導(dǎo)致的。因此在實(shí)際應(yīng)用中，對于檢測試劑盒的靈敏度及樣本的混合數(shù)量均需要預(yù)先進(jìn)行分析確認(rèn)以防止漏檢錯(cuò)檢的發(fā)生。