華蟾素抑制人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1增殖

趙 霞，蔡慶春，丁瑞敏，張 倩

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是全球第5常見的惡性腫瘤，盡管治療手段不斷地改進(jìn)，但其5年生存率仍僅有30%～40%[1-2]。其中，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高發(fā)于東南亞和中國(guó)華南地區(qū)的頭頸部上皮惡性腫瘤，發(fā)病率約為25/10萬(wàn)，每年約有8萬(wàn)新增病例和5萬(wàn)死亡病例[3]。盡管常規(guī)化學(xué)藥物治療可改善NPC患者的總體生存率，但其預(yù)后仍不太理想[4]。因此，尋找NPC新的有效治療手段具有重要意義。

華蟾素(cinobufagin，Cin)為干蟾蜍皮中提取的脂溶性物質(zhì)，長(zhǎng)期以來(lái)，其在中國(guó)和亞洲其他國(guó)家/地區(qū)一直用于中晚期肝癌、胃癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤的治療[5-9]。但，Cin對(duì)NPC的作用及其機(jī)制尚未闡明。因此，在本研究旨在探索Cin在體外是否可以抑制NPC細(xì)胞系的增殖，并初步探究其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與抗體：華蟾素(Cin)(Sigma-Aldrich公司)；胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(ThermoFisher Scientific公司)；CCK-8試劑盒、TUNEL試劑盒和細(xì)胞核蛋白、RIPA裂解緩沖液與線粒體蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；DCFH-DA試劑盒(Molecular Probes公司)；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Bio-Rad公司)；細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cytc)、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(EMD Millipore公司)；GAPDH兔重組單克隆抗體和HRP-羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 細(xì)胞：人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2和HONE1(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將細(xì)胞分為對(duì)照組和低、中、高劑量Cin處理組。待細(xì)胞貼壁后，低、中、高劑量Cin處理組分別用5、15和45 mg/L濃度的Cin處理，對(duì)照組僅接受與Cin等體積的DMSO。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性：將CNE2和HONE1細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的加在96孔板中。24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液(20 μL/孔)，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。使用Spectra Max M5動(dòng)功能微孔酶標(biāo)儀記錄490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞活性=各Cin處理組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察：將CNE2和HONE1細(xì)胞種植到6孔板(5×105個(gè)/mL)，48 h后，用相差顯微鏡在×100放大倍率下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用數(shù)碼相機(jī)拍攝細(xì)胞的大體形態(tài)圖像。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)凋亡：將CNE2細(xì)胞種植到6孔板(5×105個(gè)/mL)，48 h后，用PBS洗滌3次。使用4%甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次后，加入含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育5 min，并用PBS洗2次。在樣品上加100 μL配置好的TUNEL工作液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次后，用含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)570 nm)下觀察，并計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.5 活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測(cè)定(DCF法)：將CNE2細(xì)胞種植到6孔板(5×105個(gè)/mL)，48 h后，用PBS洗滌3次。之后，根據(jù)說(shuō)明書的指示，將細(xì)胞用熒光染料(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探針室溫避光孵育30 min，在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)觀察并拍照，使用Image J軟件進(jìn)行定量計(jì)算。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)檢測(cè)Cytc、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)：將CNE2細(xì)胞種植到6孔板(5×105個(gè)/mL)，48 h后，用PBS洗滌3次，收集細(xì)胞。細(xì)胞分成倆部分，一部分用細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)Cytc和線粒體Cytc的表達(dá)；另一部分用RIPA裂解緩沖液提取全蛋白，用Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 華蟾素(Cin)抑制NPC細(xì)胞系的細(xì)胞活性

與對(duì)照組(0 mg/L)比較，Cin處理24、48和72 h時(shí)，隨著Cin劑量的增加，CNE2和HONE1細(xì)胞活性逐漸降低(P<0.05，P<0.01和P<0.001)(圖1)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

2.2 華蟾素(Cin)處理誘導(dǎo)NPC細(xì)胞系形態(tài)改變

對(duì)照組(0 mg/L)細(xì)胞形態(tài)正常，在15 mg/L處理組，CNE2和HONE1細(xì)胞呈現(xiàn)拉絲和稀疏(細(xì)胞密度降低)現(xiàn)象，在45 mg/L處理組這種變化更加明顯，并且在HONE1細(xì)胞中觀察到細(xì)胞皺縮(圖2)。

圖2 華蟾素(Cin)處理對(duì)CNE2(A)和HONE1(B)的細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 華蟾素(Cin)處理促進(jìn)NPC細(xì)胞系凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加

與對(duì)照組(0 mg/L)比較，Cin處理組的CNE2細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例和ROS陽(yáng)性細(xì)胞的比例均隨著Cin劑量增加而增加(P<0.05，P<0.01或P<0.001)(圖3)。

A.representative images of TUNEL staining(scale bar=200 μm); B.representative images of DCF fluorescence staining(scale bar=200 μm); C.statistical results of TUNEL positive cells; D.statistical results of ROS positive cells; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

2.4 華蟾素(Cin)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組(0 mg/L)比較，Cin處理組的CNE2細(xì)胞中線粒體Cytc和Bax表達(dá)降低，細(xì)胞質(zhì)Cytc、Bcl-2和cleaved caspase-3表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01或P<0.001)(圖4)。

A.representative Western blot bands of the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins; B.statistical results of relative expression levels of mitochondria Cytc and Bax; C.statistical results of relative expression levels of cytoplasmic Cytc, Bcl-2 and cleaved caspase-3; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mg/L group

3 討論

近年來(lái)，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中尋找替代抗癌藥具有很大的研究前景[10]。很多種中藥成分具有抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其死亡的作用，從而達(dá)到消融惡性腫瘤的目的。Cin作為一種已上市的中藥，其可在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌作用[5-9]。而目前，Cin對(duì)NPC的具體作用和機(jī)制還未闡明。因此，本研究探索了Cin對(duì)NPC細(xì)胞系的生物學(xué)作用，結(jié)果顯示，Cin處理后的NPC細(xì)胞系(CNR2和HCNE1)的活性下降，凋亡增加，提示Cin也是潛在的抗NPC藥物。

ROS和腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程相互交織。ROS在細(xì)胞功能和存活信號(hào)中起重要作用，細(xì)胞內(nèi)ROS的積累最終可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。最近的研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加是一項(xiàng)重要的抗腫瘤策略[11]。線粒體是大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的場(chǎng)所，且線粒體過(guò)量生成的ROS然后能夠靶向易受氧化損傷的mtDNA(mitochondrial DNA)等結(jié)構(gòu)[12]。mtDNA損傷會(huì)損害電子傳輸鏈中涉及的蛋白質(zhì)的mtRNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致呼吸鏈功能中斷，ROS生成進(jìn)一步增加，從而導(dǎo)致Cytc從線粒體釋放、線粒體膜通透性改變和膜電位喪失和ATP合成受損[13]。這些事件最終通過(guò)線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白位于線粒體膜上，可以觸發(fā)Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致caspase激活和細(xì)胞凋亡[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)Cin可誘導(dǎo)NPC細(xì)胞系(CNE2)內(nèi)ROS生成水平增加，且進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，Cin可使得NPC細(xì)胞系(CNE2)的Bax表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)降低，Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，cleaved caspase-3水平增加；以上數(shù)據(jù)均提示，Cin抑制NPC細(xì)胞系(CNE2)增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用可能與其誘導(dǎo)ROS激活的凋亡途徑相關(guān)。

綜上所述，本研究證明了Cin能抑制NPC細(xì)胞系的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并且這一作用可能與ROS激活的凋亡途徑相關(guān)。盡管，目前研究還存在一些不足，尚缺乏在體的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，仍需繼續(xù)深入推進(jìn)Cin對(duì)NPC的治療作用的研究。就目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，本研究結(jié)果提示Cin有可能是潛在的NPC的治療劑。