酮咯酸氨丁三醇抑制膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎性反應(yīng)

李 蓉，朱含月

(無錫市第二人民醫(yī)院 藥劑科,江蘇 無錫 214002)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)多發(fā)生于中老年人群，以膝蓋紅腫、疼痛、活動受限、關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎性反應(yīng)等為主要病理癥狀的疾病[1]。KOA可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形甚至殘廢，嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量及生命健康[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路參與KOA滑膜炎性反應(yīng)及纖維組織增生過程[3]。酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine，KT)為非甾體類抗炎藥[4]，對創(chuàng)傷性疼痛、術(shù)后疼痛、腫痛、劇烈痛等各種疼痛有較好的治療效果[5]。但KT對KOA過程中滑膜炎性反應(yīng)及疼痛的影響，未見報(bào)道。本研究建立KOA大鼠模型，對此進(jìn)行探究，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 動物：清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g[無錫市第二人民醫(yī)院動物中心提供批號為IACUC-01(20160917)]。本研究經(jīng)無錫市第二人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.1.2 主要試劑：KT注射液(上海恒斐生物科技有限公司，純度：≥99.9%)；柳氮磺胺吡啶(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(Pierce公司)；蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin staining，HE)染色試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(上海篤瑪生物科技有限公司)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司)；TLR4抗體、NF-κB p65抗體、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、神經(jīng)突蛋白(neuritin)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、N-鈣黏素(N-cadherin)、整合素金屬蛋白酶4(integrin metalloproteinase 4,ADAM4)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：參照文獻(xiàn)[6]，于右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)取長約2 cm的縱切口，用改良Hulth法建立大鼠KOA模型，術(shù)后1周，若出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)紅腫、步態(tài)不協(xié)調(diào)、跳躍現(xiàn)象，表明造模成功，將建模成功的大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法，分為模型組、KT低(1 mg/kg)、高(4 mg/kg)劑量組、TAK-242 組(TLR4拮抗劑，1 mg/kg)，每組10只；另取10只大鼠，只暴露膝關(guān)節(jié)，作為對照組。造模成功后(術(shù)后第8 d)開始給藥，KT參照文獻(xiàn)[7]設(shè)置劑量，并用0.9%氯化鈉溶液配制為0.10、0.40 mg/mL的混懸液，以10 mL/kg的體積經(jīng)右膝關(guān)節(jié)肌肉處注射給藥1次/d，TAK-242組參照文獻(xiàn)[8]設(shè)置劑量，并經(jīng)尾靜脈注射給藥2次/周；對照組與模型組肌肉注射給予等量0.9%氯化鈉溶液1次/d，各組連續(xù)給藥2周。

1.2.2 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度觀察及自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分的檢測：末次給藥12 h后，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)紅腫、腫脹程度，參照文獻(xiàn)[9]將大鼠置于17 cm/s的電動跑步機(jī)上行走20 s，觀察大鼠步態(tài)行為，并進(jìn)行評分，總分以4分計(jì)，得分越高其疼痛行為越嚴(yán)重。

1.2.3 大鼠熱刺激撤足痛閾值的檢測：行為步態(tài)評分后，參照文獻(xiàn)[9]利用鼠爪熱輻射刺激測痛儀檢測大鼠后肢足跟部皮膚對熱刺激的反應(yīng)，記錄大鼠鼠爪撤足的反應(yīng)時間，即熱痛閾(heat-pain threshold,hppt)。

1.2.4 HE及馬森(Masson)染色觀察大鼠滑膜組織形態(tài)及組織纖維增生情況：麻醉處死大鼠，剝離完整滑膜組織(髕骨以下一層平滑光亮且呈淺淡黃色的組織)，剪取0.5 g滑膜組織，于液氮中保存?zhèn)溆?，剩余組織立即放入4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)。取部分切片，按HE及馬森染色試劑盒說明書行染色、封片后，置于顯微鏡下觀察組織染色情況。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠滑膜組織neuritin蛋白表達(dá)：取1.2.4中剩余切片，常規(guī)處理后，加入一抗抗體(neuritin、1∶500)4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液(1∶1 000)，室溫孵育30 min，用DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片后。于400倍光鏡下拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)以5個視野陽性表達(dá)的平均吸光度值[absorbance(A)value]表示neuritin蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA檢測大鼠滑膜組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平：取1.2.4中液氮中保存的滑膜組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿、分離后取上清液，按ELISA試劑盒說明書方法檢測IL-1β和TNF-α水平。

1.2.7 Western blot檢測TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4蛋白表達(dá) 取組織上清液，用蛋白提取試劑盒軸提蛋白后，BCA法測蛋白濃度，取30 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入抗體[TLR4、p-NF-κB p65、OPN、ADAM4(1∶100)，β-actin(內(nèi)參)1∶2 000]4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光成像儀觀察條帶并拍照，Image-J軟件分析蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 KT對大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度、自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分及熱刺激撤足痛閾值的影響

對照組大鼠膝關(guān)節(jié)及活動步態(tài)行為正常；與對照組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)紅腫，活動較少，行走步態(tài)不協(xié)調(diào)，自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分升高，熱刺激撤足痛閾值降低(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組關(guān)節(jié)紅腫、行走步態(tài)不協(xié)調(diào)行為緩解，自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分降低，熱刺激撤足痛閾值升高(P<0.05)(表1)。

表1 自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分及熱刺激撤足痛閾值比較

2.2 KT對大鼠滑膜組織病理形態(tài)的影響

對照組大鼠滑膜組織正常，未見明顯炎性損傷。模型組大鼠HE染色可見滑膜組織充血腫脹、肥厚粗糙，滑膜細(xì)胞增生呈多層且排列不整齊，毛細(xì)血管豐富及炎性細(xì)胞浸潤明顯；馬森染色可見纖維組織增生嚴(yán)重。與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織肥厚、炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生等病理現(xiàn)象均不同程度減輕。其中KT高劑量組優(yōu)于低劑量組，KT高劑量組與TAK-242 組病理損傷相近(圖1)。

圖1 大鼠滑膜組織病理損傷

2.3 KT對大鼠滑膜組織中neuritin蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組大鼠滑膜組織neuritin蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜Neuritin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖2，表2)。

圖2 大鼠滑膜組織免疫組化圖

表2 各組大鼠Neuritin蛋白表達(dá)結(jié)果比較

2.4 KT對大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平的影響

對照組相比，KOA組大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)；與KOA組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)(表3)。

表3 大鼠滑膜組織IL-1β、TNF-α水平比較

2.5 KT對大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

對照組相比，模型組大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖3，表4)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表4 大鼠滑膜組織TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

2.6 KT對大鼠OPN、ADAM4蛋白表達(dá)的影響

對照組相比，模型組大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組相比，KT低、高劑量組及TAK-242 組大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖4，表5)。

A.control；B.model；C.KT low-dose；D.KT high-dose；E.TAK-242

表5 大鼠滑膜組織OPN、ADAM4蛋白表達(dá)水平

3 討論

KOA過程中，滑膜細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞活化，可分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α等，來進(jìn)一步促進(jìn)滑膜炎性反應(yīng)，引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷[10]。神經(jīng)營養(yǎng)因子neuritin可間接反映疼痛程度，并參與KOA疼痛過程[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹、活動受限、滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生等KOA病理癥狀嚴(yán)重，并伴隨著自發(fā)疼痛行為步態(tài)評分升高、熱痛閾值降低、滑膜組織IL-1β、TNF-α水平及疼痛相關(guān)指標(biāo)neuritin表達(dá)升高，提示大鼠KOA造模成功。

KT是一種非甾體類抗炎藥物，可用于各種疼痛的治療[4]，但KT卻在KOA中應(yīng)用較少。本研究發(fā)現(xiàn)，KT劑量越高，大鼠KOA病理癥狀緩解越明顯，滑膜組織炎性指標(biāo)及疼痛相關(guān)指標(biāo)表達(dá)降低越明顯，這與報(bào)道，肌肉注射KT藥物，可緩解關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)后疼痛及炎性應(yīng)激狀態(tài)相一致[12]，提示KT也可用于KOA炎性反應(yīng)及疼痛癥狀的緩解治療。

TLR4/NF-κB通路是主要的炎性調(diào)控通路[13]，也是參與KOA滑膜炎性反應(yīng)、滑膜細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞增生病變的關(guān)鍵通路。NF-κB通路激活可介導(dǎo)OPN表達(dá)，促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)及增殖，可能是關(guān)節(jié)炎患者滑膜炎性增生及病變的關(guān)鍵原因[14]。NF-κB及炎性因子可觸發(fā)TLR4炎性反應(yīng)激活，并調(diào)控IL-1β炎性因子及ADAM4表達(dá)來促進(jìn)滑膜增生及侵襲[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜組織TLR4/NF-κB通路及相關(guān)蛋白OPN及ADAM4蛋白表達(dá)均異常增高，用TAK-242 阻斷TLR4/NF-κB通路激活后，大鼠KOA疼痛及滑膜炎性損傷緩解明顯。而KT劑量越高，TLR4/NF-κB通路抑制效果越顯著，且KT高劑量組對TLR4/NF-κB通路及KOA癥狀的抑制效果，與TAK-242組相近，提示KT藥物緩解KOA大鼠滑膜炎性反應(yīng)及疼痛癥狀，可能與阻斷TLR4/NF-κB通路激活有關(guān)。

綜上所述，KT可緩解KOA大鼠滑膜炎性反應(yīng)及疼痛癥狀，且其緩解作用可能與阻斷TLR4/NF-κB通路激活有關(guān)。這為KT在KOA領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定參考。但KOA病理過程較為復(fù)雜，還涉及免疫、自噬、氧化應(yīng)激等多種生理反應(yīng)，KT改善KOA癥狀的其他機(jī)制，有待繼續(xù)研究。