胃癌患者血清IL-1的升高和癌組織JAK2/STAT3信號通路的激活

牛世偉，蘇 韞*，龔紅霞，李婷婷，曾元丁，張 晗，聶 蓬

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000；3.甘肅省武威腫瘤醫(yī)院 武威醫(yī)學(xué)科學(xué)院 胃外科，甘肅 武威 733000)

胃癌(gastric cancer)作為世界上的常見惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織國際癌研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率居第五位，病死率居第四位[1]。腫瘤的十大特征中就有炎性反應(yīng)[2]。胃癌的最初表現(xiàn)為慢性胃炎，長時間的炎性反應(yīng)可導(dǎo)致胃黏膜出現(xiàn)損傷，最終成為胃癌[3]。有研究報道[4]，炎性因子可導(dǎo)致癌基因突變、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。炎性細(xì)胞通過分泌多種炎性因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移，同時影響腫瘤的預(yù)后。其中的IL-1和IL-10是目前研究較多的兩種炎性因子，IL-1由活化單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可加速炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展；而IL-10可抑制炎性因子的合成與釋放從而減輕炎性反應(yīng)。JAK2/STAT3信號通路作為經(jīng)典的炎性通路，在腫瘤中被廣泛激活，參與了多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過收集臨床患者組織和血清及健康者血清標(biāo)本，探討炎性因子IL-1、IL-10和JAK2/STAT3信號通路及下游相關(guān)蛋白在胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇在甘肅省武威腫瘤醫(yī)院2018年1月至2018年12月手術(shù)治療的胃癌患者及同期健康體檢的人群各30例，收集患者及健康體檢者的基本資料及晨起空腹靜脈血。選取患者的胃癌組織、距病灶5 cm的癌旁組織及距病灶10 cm的正常組織各30例。本研究獲得武威市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批文號:WWZL-LL-2016-0001)。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)病理檢查診斷為胃癌的患者；2)年齡在40～60歲且預(yù)計存活周期3個月以上者；3)血常規(guī)、心、肺、肝、腎功能基本正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)身體狀態(tài)差，難以耐受手術(shù)者；2)患有嚴(yán)重心血管疾病及其他惡性腫瘤者；3)正在參加其他藥物臨床研究者。

1.1.2 試劑及試劑盒：白細(xì)胞介素1(interleukin 1,IL-1)、白細(xì)胞介素10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bax和Bcl-2兔抗人多克隆抗體(Immunoway公司)；DAB顯色試劑盒(中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Trizol(Ambion公司)；RT-qPCR試劑盒(上海翊圣生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測IL-1、IL-10的含量：分離患者及健康體檢者血清，保存于-80 ℃冰箱；采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定血清中IL-1和IL-10水平，實(shí)驗(yàn)過程依據(jù)說明書嚴(yán)格進(jìn)行，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處波長的吸光度(A)值。

1.2.2 免疫組化法檢測Bax、Bcl-2蛋白含量：將組織固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)包埋、切片、水化，常溫3% H2O2孵育，用PBS洗滌3次后，用檸檬酸鈉溶液修復(fù)抗原，分別加入Bax、Bcl-2一抗，4 ℃過夜。清洗后室溫孵育二抗，30 min后PBS清洗DAB顯色，封片后切片在光鏡下觀察并拍照。使用ImageJ軟件分析平均吸光度(A)值。

1.2.3 蛋白印跡法(Western blot)檢測組織JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax蛋白含量：提取組織蛋白，樣品煮沸5 min后變性，BCA法檢測蛋白濃度，配制12% SDS-PAGE膠，上樣電泳，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉2 h后，孵育于相應(yīng)一抗稀釋液中4 ℃搖床過夜。第二天，TBST洗膜10 min×3次后于4℃搖床二抗孵育2 h。再用TBST洗膜3次后用ECL發(fā)光試劑曝光，使用ImageJ軟件統(tǒng)計各蛋白條帶吸光度(A)值，與內(nèi)參吸光度(A)值的比值即為相對蛋白表達(dá)量。

1.2.4 RT-qPCR定量檢測各組織中JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax mRNA的含量：引物序列(表1)。取凍存組織100 mg，按Trizol法提取RNA，分光光度計測定其A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0，采用SYBR法以cDNA為模板在實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。繪制熔解曲線，根據(jù)比較Ct值法分析各基因的相對表達(dá)量，相對表達(dá)量為2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 健康人與胃癌患者基線信息比較

健康人30名，其中男性14名，女性16名，平均年齡為(52.2±8.2)歲；胃癌患者30例，其中男性17例，女性13例，平均年齡為(55.5±6.3)歲，兩組性別及年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 各組血清中IL-1、IL-10含量水平比較

與對照組相比，胃癌患者血清中IL-1含量升高，而IL-10含量下降(P<0.05)(表2)。

表2 IL-1、IL-10在各組血清中濃度

2.3 各組組織中Bax、Bcl-2含量水平比較

胃癌組織中Bax主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而Bcl-2表達(dá)于細(xì)胞核，圖片中棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)(圖1,2)。Bax在胃癌組織中的含量明顯低于對照組和癌旁組，Bcl-2在胃癌組織中的含量明顯高于對照組和癌旁組(P<0.05)(表3)。

A.Bax content in normal tissue;B.Bax content in adjacent tissue; C.Bax content in cancer tissue

表3 Bax、Bcl-2在各組組織中的含量

2.4 各組組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax蛋白含量水平比較

與對照組相比，胃癌組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量增加，而Bax含量減少(P<0.05)。與癌旁組織比較，癌組織中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量增加，而Bax含量減少(P<0.05)(圖3，表4)。

表4 JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax的含量情況

A.Bcl-2 content in normal tissue; B.Bcl-2 content in adjacent tissue; C.Bcl-2 content in cancer tissue

圖3 JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3、Bcl-2和Bax在各組組織中的含量

2.5 各組組織中JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA含量水平比較

與對照組相比，胃癌組織中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量增加，而Bax mRNA含量減少(P<0.05)。與癌旁組織比較，癌組織中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量增加，而Bax mRNA含量減少(P<0.05)(表5)。

表5 RT-qPCR檢測各組mRNA的含量

3 討論

最近幾年大量的報導(dǎo)指出IL-1和慢性炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。胃癌細(xì)胞在自身生長的過程中，能通過多種方式刺激單核-巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌大量的IL-1和IL-6[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8]，在大鼠胃癌模型中，IL-10能夠有效提高血清IFN-γ和IL-4的水平，降低TNF-α水平，具有一定的抗腫瘤效果。藏藥二十五味驢血丸可通過提高治療組動物血清中IL-10及降低TNF-α、IL-6、IL-17的含量水平來起到治療關(guān)節(jié)炎的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路有關(guān)[9]。Bax和Bcl-2為JAK2/STAT3信號通路的下游因子，兩者可形成一個凋亡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)參與細(xì)胞的增殖、存活，抑制細(xì)胞的凋亡和炎性[10-11]。在本研究中，與對照組相比，胃癌組中JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和Bcl-2含量均增加，而Bax含量減少，胃癌組中JAK2、STAT3和Bcl-2 mRNA含量均增加，而Bax mRNA含量減少，血清中IL-1含量增高，而IL-10含量下降，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。

綜上所述，由IL-1引發(fā)的炎性反應(yīng)在胃癌的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，同時JAK2/STAT3信號通路被激活進(jìn)而調(diào)控下游的Bax和Bcl-2參與胃癌異常的凋亡與增殖，通過干預(yù)胃癌前炎性反應(yīng)以及開發(fā)JAK2/STAT3信號通路抑制劑可能為臨床防治胃癌提供新思路。另外，IL-1、IL-10炎性細(xì)胞因子與JAK2/STAT3信號通路之間的靶向因果關(guān)系尚須在動物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上進(jìn)一步驗(yàn)證。