miR-216a對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞特性的影響

韓 爽，陳 宇，張偉麗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037)

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。循環(huán)血中的單核細(xì)胞遷移并黏附于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，浸潤至內(nèi)膜下層形成巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)，單核-巨噬細(xì)胞通過極化和分泌炎性因子等機(jī)制調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的各個(gè)階段。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下具有表型異質(zhì)性和可塑性，主要分為兩種類型：經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(classical activated macrophages, M1)、替代活化型巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages, M2)[1]。M1型巨噬細(xì)胞在斑塊中大量存在，通過分泌炎性因子促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展；反之，M2型巨噬細(xì)胞可以通過分泌抗炎因子發(fā)揮抑制斑塊進(jìn)展的作用[2]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞功能中的作用受到廣泛關(guān)注[3]。已有研究報(bào)道m(xù)iR-216a可以激活端粒酶，促進(jìn)人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞向M1型極化[4]，但miR-216a對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)衍生的巨噬細(xì)胞特性尚不清楚。人PBMCs為原代培養(yǎng)單核細(xì)胞，能更真實(shí)地反映體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)，是研究動(dòng)脈粥樣硬化的適宜模型[5]。本研究旨在探討miR-216a對(duì)PBMCs衍生的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)和極化分型的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和Histopaque?1077淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司)，干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和白介素-4(interleukin-4, IL-4)(PeproTech公司)，PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen公司)，Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)，抗體CD86和CD206(BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人PBMCs的分離和培養(yǎng)：研究對(duì)象來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院疑為冠心病行冠狀動(dòng)脈造影檢查的患者6例，外周血標(biāo)本來自于晨起空腹抽血。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究設(shè)計(jì)以及人外周血的使用，所有患者均簽署書面知情同意書。

采用密度梯度離心法分離人PBMCs：肝素抗凝的新鮮外周血4 mL，1 500 r/min室溫離心10 min，棄上層血清，加入磷酸緩沖液稀釋至終體積4 mL，充分混勻后，沿管壁緩慢加入4 mL Histopaque?1077淋巴細(xì)胞分離液。隨后1 500 r/min室溫離心40 min，取中間層霧狀液體，加入6倍體積的磷酸緩沖液稀釋，再次1 700 r/min室溫離心10 min，加入磷酸緩沖液洗滌兩次，得到人PBMCs懸液[6]。在含有20%胎牛血清和100 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)PBMCs，并放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞極化模型的建立：將生長狀態(tài)良好的PBMCs以(0.8～1.0)×106個(gè)/mL的濃度在12孔板中培養(yǎng)，使用100 ng/mL的PMA刺激48 h后，PBMCs分化成M0型初始巨噬細(xì)胞。繼而，用1 ng/mL的LPS和20 ng/mL的IFN-γ刺激48 h，誘導(dǎo)M0型初始巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化；用20 ng/mL的IL-4刺激48 h，誘導(dǎo)M0型初始巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用lipofectamine 3000試劑將miR-216a模擬物(mimics)和陰性對(duì)照(negative control，NC)以終濃度為50 nmol/L轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參考Lipofectamine 3000試劑說明書。miR-216a mimics序列如下：正義鏈5′-UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-3′;反義鏈5′-AC AGUUGCCAGCUGAGAUUAUU-3′。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測基因表達(dá)水平：使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用SYBR Green qPCR Mix試劑配制反應(yīng)體系，利用ABI ViiA7 System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測基因的mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s和72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用2-ΔΔCt定量法進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參照?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)：收集M1和M2型巨噬細(xì)胞，分別向細(xì)胞內(nèi)加入抗體CD86和CD206，4 ℃避光孵育30 min。用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，并重新懸浮，使用Accuri C6 流式細(xì)胞儀(BD公司)進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PBMCs衍生的巨噬細(xì)胞極化模型建立

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，LPS和IFN-γ共同誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞中，M1型表面標(biāo)志物CD86陽性率達(dá)89.9%(圖1A)；IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中，M2型表面標(biāo)志物CD206陽性率達(dá)92.1%(圖1B)。

A.the expression of CD86 in M1 macrophages; B.the expression of CD206 in M2 macrophages

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物CD86 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平是M0型巨噬細(xì)胞的10.3倍(P<0.01)(圖2A)；M2型特異性表面標(biāo)記物CD206 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比M0型升高12倍(P<0.01)(圖2B)。

A.the expression of CD86; B.the expression of CD206；*P<0.01 compared with M0 macrophages

2.2 M1/M2型巨噬細(xì)胞炎性相關(guān)因子的特點(diǎn)

與M0型巨噬細(xì)胞相比，在誘導(dǎo)激活的M1型巨噬細(xì)胞中，促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別增加10.6倍、11.5倍、9.3倍(P<0.01)(圖3A)；抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-10 mRNA在M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平均較M0型顯著降低(P<0.01)(圖3B)。

A.the expressions of IL-1β, IL-6 and TNF-α; B.the expressions of TGF-β and IL-10; 0.01 compared with M0 macrophages

2.3 miR-216a對(duì)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物和炎性因子的影響

與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-216a后，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD163 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平升高0.4倍(P<0.05)，但CD206 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(圖4A)。此外，過表達(dá)miR-216a后，M2型巨噬細(xì)胞的促炎因子TNF-α和IL-1β mRNA的相對(duì)表達(dá)水平降低約30%(P<0.05)(圖4B)，抗炎因子TGF-β和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平升高約0.6倍(P<0.05)(圖4C)。

A.the expressions of CD163 and CD206; B.the expressions of TNF-α and IL-1β; C.the expressions of TGF-β and IL-10; *P<0.05 compared with negative control(NC)

3 討論

巨噬細(xì)胞通過合成和分泌細(xì)胞因子參與炎性反應(yīng)、脂質(zhì)蓄積以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性使其在不同組織微環(huán)境表現(xiàn)出不同的炎性反應(yīng)特征和功能特性[7]。M1型在炎性反應(yīng)早期階段通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)多種炎性因子和趨化因子的釋放，促進(jìn)炎性反應(yīng)，同時(shí)降低膽固醇蓄積導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定甚至破裂[8]。M2型為炎性反應(yīng)消退階段的主要活化表型，引起抗炎細(xì)胞因子釋放并促進(jìn)組織的修復(fù)和再生[9]。M1型/M2型巨噬細(xì)胞平衡極化影響著炎性反應(yīng)性疾病的進(jìn)程，其中M2型巨噬細(xì)胞更具可塑性，并容易極化為炎性M1型巨噬細(xì)胞[10]。

miRNA在巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。例如，miR-495通過抑制肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)表達(dá)促進(jìn)M1型極化，加重小鼠胰島素抵抗和脂肪組織炎性反應(yīng)[11]；miR-145靶向抑制靶基因IL-16，上調(diào)IL-10的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向M2型極化[12]。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a通過Smad3/NF-κB途徑激活端粒酶，促進(jìn)THP-1衍生的巨噬細(xì)胞向M1型極化[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-216a誘導(dǎo)了PBMCs衍生的巨噬細(xì)胞中M2型表面標(biāo)記物CD163和CD206的表達(dá)，抑制炎性因子表達(dá)，增加抑炎因子表達(dá)，從而促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，提示miR-216a在不同微環(huán)境中的作用復(fù)雜。

THP-1單核-巨噬細(xì)胞是一種具有相同表觀遺傳背景的永生單核細(xì)胞系，而人PBMCs是原代單核細(xì)胞系[5]。LPS、IFN-γ和IL-4等刺激物誘導(dǎo)THP-1單核-巨噬細(xì)胞的極化模型與原代單核細(xì)胞PBMCs來源的巨噬細(xì)胞極化模型，二者間存在重要差異[13]。例如，與THP-1細(xì)胞相比，PBMCs對(duì)LPS刺激的反應(yīng)更強(qiáng)烈，主要表達(dá)單核細(xì)胞分化抗原CD14抗體[14]。因此，在相同刺激下，不同來源的巨噬細(xì)胞可能產(chǎn)生不同的極化表型差異。本研究的局限性在于在探究miR-216a對(duì)巨噬細(xì)胞特性的影響時(shí)，僅采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將采取流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步鑒定巨噬細(xì)胞極化分型的特點(diǎn)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-216a可促進(jìn)人PBMCs來源的巨噬細(xì)胞向M2型極化并抑制炎性因子表達(dá)，這為miR-216a對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)提供了新的證據(jù)。尋找影響巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控因子可能為慢性炎性反應(yīng)性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新思路。