IRF5對低分化胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響及機制研究

吳佳琪 李為民 王怡棟 潘文勝

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例約103萬，死亡78萬[1]。我國是胃癌高發(fā)大國，國內(nèi)胃癌發(fā)病率僅次于肺癌[2]。由于胃癌早期癥狀的非特異性，患者確診時往往已是晚期，嚴重威脅人類的生命健康。胃癌組織的分化程度與胃癌預后關系緊密，低分化胃癌較中高分化胃癌更易出現(xiàn)轉移，同時伴隨預后不良[3]。而死于腫瘤的病例中，90%與腫瘤侵襲、轉移有關[4]。因此，尋找抑制低分化胃癌細胞侵襲能力的分子標志物，對于提高患者的生存率具有重要的意義。

干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5,IRF5）是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的重要一員，過去研究表明IRF5不僅對病原體的防御與免疫細胞的分化方面起重要作用，同時也參與腫瘤形成及腫瘤細胞凋亡[5-6]。同時，研究表明IRF5在不同腫瘤細胞中可發(fā)揮抑制腫瘤或者促進腫瘤的作用，提示IRF5功能的多樣性[7-8]。目前，IRF5在低分化胃癌細胞中的生物學功能及其機制尚未完全闡明。過去研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞系中IRF5基因DNA區(qū)域高度甲基化，然而具體作用依然不清[9-10]。因此本研究探討IRF5對低分化胃癌細胞的遷移和侵襲能力的影響及其作用機制，為尋找低分化胃癌的治療靶點提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 實驗標本 選取2019年12月至2020年7月杭州師范大學附屬醫(yī)院行胃鏡活檢及手術且經(jīng)病理學檢查最終證實為低分化胃癌石蠟標本5例以及正常胃黏膜組織石蠟標本5例。本研究經(jīng)杭州師范大學附屬醫(yī)院科研倫理委員會批準，批準文號：2019（倫02）-HS-27。

1.2 細胞及主要試劑 人低分化胃癌細胞株BGC-823和人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1由本課題組保存。兔源IRF5抗體、兔源基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體均購自美國abcam公司，辣根過氧化物酶標記GAPDH抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）抗體、嘌呤霉素、RIPA裂解液均購自上海碧云天公司；BCA定量法試劑盒、脂質體3000均購自美國ThermoFisher公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；RPMI1640購自美國Gibco公司；逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒均購自日本TAKARA公司；Matrigel基質膠、Transwell小室均購自美國Corning公司；慢病毒為載體的IRF5 shRNA、MMP-9過表達慢病毒液及空載病毒、IRF5空載質粒及IRF5過表達質粒、pGL3-basic質粒及pGL3-MMP-9質粒均由廣州銳博生物技術有限公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染 細胞培養(yǎng)于5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。取處對數(shù)生長期的BGC-823細胞，分別加入稀釋后的IRF5 shRNA慢病毒液及空載病毒液，轉染24 h后棄含病毒液的舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)48～96 h后，采用2 μg/ml嘌呤霉素篩選，得到IRF5敲低的BGC-IRF5組及作為對照的BGC-NC組。BGC-IRF5組細胞加入MMP-9過表達慢病毒液，經(jīng)過轉染篩選得到MMP-9高表達的BGC-MMP-9 Over組細胞。

1.4 胃組織中IRF5和MMP-9相對表達水平檢測 采用免疫組化法。低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織標本脫蠟后放入盛有檸檬酸的溶液中，隨后進行高溫抗原修復。3%過氧化氫進行室溫避光孵育10 min，PBS洗3次后正常山羊血清封閉1 h。除去血清后，每張玻片加IRF5或MMP-9一抗，4℃孵育過夜。PBS洗3次后加羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。新鮮配制的DAB溶液顯色5 min，自來水水洗4 min終止顯色。蘇木素復染細胞核3～5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。各個樣本在高倍顯微鏡（400倍）下隨機拍攝3張，使用Image-Pro Plus 6.0分析平均光密度，以正常組織為對照計算相對表達水平。

1.5 IRF5和MMP-9 mRNA相對表達水平檢測 采用RT-PCR法。采用Trizol提取各組細胞總RNA，按照試劑盒說明書將細胞總RNA逆轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR。反應條件為：95℃預變性10 min，PCR：95℃ 15 s、60℃ 60 s，共40個循環(huán)，溶解曲線：95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 30 s，擴增結果以 Ct值顯示。用2-ΔΔCt表示各組基因表達水平的倍比關系。每次實驗至少重復3次。

1.6 IRF5和MMP-9蛋白相對表達水平檢測 采用Western blot法。采用RIPA裂解液提取各組細胞內(nèi)的蛋白，對細胞進行重復裂解后離心，BCA法測定蛋白濃度。每孔加入20 μg蛋白樣品上樣以后，進行SDSPAGE電泳。蛋白轉移至PVDF膜上后，用5%脫脂奶粉 PBST常溫封閉 1 h，IRF5或 MMP-9一抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育1 h后，隨后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)獲取條帶。以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白/GAPDH代表目的蛋白的相對表達水平，每次實驗至少重復3次。

1.7 細胞遷移能力檢測 在6孔板中接種BGCIRF5組和BGC-NC組5×105個細胞，接種的細胞在培養(yǎng)板里分布均勻。接種原則為過夜后融合率達到90%。用滅菌的100 μl槍頭在孔正中間畫1條直線，吸除培養(yǎng)基，并用PBS將懸浮的細胞除去。加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0 h和24 h拍照記錄劃痕愈合程度，用Image J軟件分析，計算相對遷移水平。每次實驗至少重復3次。

1.8 細胞侵襲能力檢測 Matrigel基質膠包被在Transwell小室底部膜的上室面，鋪制均勻平整，置于37℃孵箱使膠凝固。BGC-MMP-9 Over組、BGC-IRF5組和BGC-NC組細胞血清饑餓24 h后，消化重懸，細胞濃度調(diào)整為1×106/ml。將200 μl懸液加入上室，在下室中加入約500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室液體，用PBS輕柔漂洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽仔細擦凈膜上未遷移的細胞。下室加入濃度為5 μg/ml的DAPI溶液，避光染色 15～20 min，吸去DAPI溶液，加入PBS溶液，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，即為穿基底膜細胞數(shù)量。每次實驗至少重復3次。

1.9 IRF5對MMP-9相對表達水平的調(diào)控 采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測。在24孔板中接種5×105個293T細胞，在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用脂質體3000分別共轉染：IRF5空載質粒＋pGL3-空載質粒，IRF5空載質粒＋pGL3-MMP-9質粒，IRF5過表達質粒＋pGL3-空載質粒，IRF5過表達質粒＋pGL3-MMP-9質粒。48 h后獲取細胞，相對熒光素酶活性檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System，操作按說明書使用。20 μl細胞裂解液加入至100 μl LARⅡ，檢測發(fā)光讀數(shù)，隨后加入100 μl終止液體，再次讀數(shù)。每次實驗至少重復3次。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 低分化胃癌組織及正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9相對表達水平比較 低分化胃癌組織中IRF5與MMP-9相對表達水平均明顯高于正常胃黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1（插頁）和表1。

表1 低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9相對表達水平比較

圖1 低分化胃癌組織和正常胃黏膜組織IRF5與MMP-9免疫組化檢測所見（×400）

2.2 BGC-IRF5組、BGC-NC組和 GES-1組 IRF5 mRNA及蛋白相對表達水平比較 BGC-NC組IRF5 mRNA及蛋白相對表達水平均明顯高于BGC-IRF5組和GES-1組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

表2 3組細胞IRF5 mRNA及蛋白相對表達水平比較

圖2 3組細胞IRF5蛋白表達的電泳圖

2.3 BGC-IRF5組和BGC-NC組相對遷移水平比較 BGC-IRF5組及BGC-NC組相對遷移水平分別為0.59±0.12和1.08±0.14，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 兩組細胞相對遷移水平劃痕圖

2.4 BGC-MMP-9 Over組、BGC-IRF5組和BGC-NC組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達水平、穿基底膜細胞數(shù)量比較 BGC-IRF5組較BGC-MMP-9 Over組和BGC-NC組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達水平均明顯下降，穿基底膜細胞數(shù)量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖4，圖5（插頁）和表3。

表3 3組MMP-9 mRNA及蛋白相對表達水平、穿基底膜細胞數(shù)量比較

圖4 3組細胞MMP-9蛋白表達的電泳圖

圖5 3組細胞穿基底膜細胞數(shù)量比較（×400）

2.5 4種質粒相對熒光素酶活性比較 IRF5過表達質粒+pGL3-MMP-9質粒較IRF5空載質粒+pGL3-空載質粒、IRF5空載質粒+pGL3-MMP-9質粒和IRF5過表達質粒+pGL3-空載質粒相對熒光素酶活性均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見表4。

表4 4種質粒相對熒光素酶活性比較

3 討論

轉移和侵襲是晚期胃癌最主要的特征，是導致患者胃癌復發(fā)和死亡的主要原因，其中低分化胃癌又是最容易發(fā)生轉移的病理類型之一。腫瘤的侵襲和轉移是一個多步驟、多階段和多因素參與的復雜過程[11]。腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強是引起腫瘤轉移的重要作用機制，其中諸多分子相互協(xié)調(diào)，共同參與該過程[12]。因此從分子層面研究胃癌細胞侵襲、轉移發(fā)生的過程，尋找相關分子，有助于尋找潛在藥物干預靶點，改善胃癌患者預后。

研究表明IRF5在調(diào)節(jié)先天免疫和腫瘤細胞增殖、凋亡與侵襲方面起到至關重要的作用[5-6]。通過依賴或者非依賴p53途徑，IRF5可以抑制腫瘤細胞的增殖，同時可促進腫瘤細胞凋亡[7，13]。此外，還有研究指出IRF5參與TNF相關凋亡誘導配體所誘導的腫瘤細胞凋亡[7，13]。在病毒相關的腫瘤發(fā)生中，IRF5可以抑制病毒復制，減少腫瘤發(fā)生[8，15]。然而，Massimino 等[16]發(fā)現(xiàn)IRF5在甲狀腺癌細胞中表達水平顯著增高，且IRF5異常增高可以增加甲狀腺癌細胞的增殖能力，提示IRF5可能參與促進腫瘤的作用。上述研究結果提示IRF5在不同腫瘤細胞中可能發(fā)揮不同的作用。還有研究指出與正常乳腺組織及乳腺細胞相比，人乳腺腫瘤組織及腫瘤細胞中IRF5表達水平降低明顯，當乳腺腫瘤細胞過表達IRF5后，其增殖及遷移能力會受到部分抑制，該機制研究表明此效應可能跟調(diào)控CXCR4表達水平相關[17]。本研究首次探討了IRF5在低分化胃癌中的作用，結果表明在低分化胃癌細胞BGC-823中，敲低IRF5可降低胃癌細胞的侵襲能力，提示IRF5可能促進低分化胃癌細胞的侵襲、轉移。由此可見，IRF5在低分化胃癌的轉移中發(fā)揮重要作用，與低分化胃癌的發(fā)展關系密切。

IRF5影響低分化胃癌細胞侵襲、轉移的具體分子機制目前仍不清楚。腫瘤細胞轉移過程中，腫瘤細胞外基質的降解和基底膜破壞是首要條件，而MMP家族在該過程中扮演重要的角色[12]。研究表明MMP-9在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，人胃癌組織中MMP-9相對表達水平顯著高于周圍相鄰健康組織，且低分化胃癌中MMP-9相對表達水平高于高分化組織[18]。同時，MMP-9相對表達水平與胃癌細胞的侵襲和轉移程度呈正相關[18-19]。MMP-9還參與HER2、HOXC6等上游分子調(diào)節(jié)胃癌細胞的侵襲和遷移過程[20-21]。本研究結果提示，下調(diào)IRF5可以降低低分化胃癌細胞的MMP-9相對表達水平，由此推測，IRF5可能通過調(diào)控MMP-9相對表達水平，破壞胃癌的基底膜，促進低分化胃癌的轉移和侵襲。IRF5與MMP的調(diào)控機制目前尚未詳細闡明。在急性心肌梗死組織中，下調(diào)IRF5可顯著降低組織中MMP-9相對表達水平[22]。該結論與本研究團隊在BGC-823細胞中得到的結論一致。此外，有研究指出在人原代軟骨細胞中IRF5可以調(diào)控MMP-3相對表達水平，具體分子機制可能是IRF5直接結合MMP-3啟動子區(qū)域和與NF-κB分子協(xié)同調(diào)節(jié)MMP-3相關[23]。上述研究結果均提示IRF5可能通過多種機制調(diào)節(jié)MMP-9相對表達水平。本研究結果提示IRF5可通過直接結合MMP-9啟動子區(qū)域，發(fā)揮對MMP-9啟動子區(qū)域的調(diào)節(jié)，繼而影響MMP-9相對表達水平。

綜上所述，IRF5可以促進低分化胃癌的侵襲和遷移，該效應可能通過調(diào)控MMP-9來完成。本研究為降低低分化胃癌侵襲能力提供了新的治療靶點。在未來的研究中，本團隊將在動物水平進一步論證，充分探討IRF5在低分化胃癌遷移和侵襲中的功能及機制。